劉 煒， 張瓊梅

（1.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?71158 2.海南省熱帶藥用植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口571158）

巖白菜素與DNA相互作用的光譜研究

劉 煒1，2， 張瓊梅1

（1.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 海口571158 2.海南省熱帶藥用植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口571158）

利用鹽酸小檗堿為熒光探針，應(yīng)用熒光光譜法、紫外光譜技術(shù)和粘度法研究了巖白菜素與DNA分子間的相互作用.研究結(jié)果表明：在pH為7.4的Tris-HCl緩沖溶液體系中，隨著DNA濃度的增加，巖白菜素在215 nm處的紫外吸收峰發(fā)生紅移和吸光度的降低，表明巖白菜素與DNA之間存在著嵌插作用.隨著巖白菜素濃度的增加，BR-DNA體系發(fā)生熒光猝滅，其猝滅機(jī)制判斷為靜態(tài)猝滅；運(yùn)用位點(diǎn)模型計(jì)算了25℃下巖白菜素與DNA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)分別為0.9814和7.86×103L·mol-1.粘度實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明巖白菜素與DNA為嵌入結(jié)合.該結(jié)果為研究巖白菜素的抗癌機(jī)理提供了重要信息.

巖白菜素;DNA;熒光探針；熒光光譜；紫外光譜；相互作用

藥物分子與DNA的相互作用會(huì)影響到DNA的生理和物理化學(xué)性質(zhì)，改變DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制.在醫(yī)藥研究中DNA與靶向分子相互作用的研究不僅可以闡述一些抗腫瘤、抗病毒藥物以及致癌物的作用機(jī)理，而且對(duì)進(jìn)一步指導(dǎo)新型藥物的設(shè)計(jì)合成的研究都具有重要意義[1].

巖白菜素別名巖白菜內(nèi)酯、矮茶素等（見(jiàn)圖1），用于治療慢性支氣管炎，主要存在于虎耳草科植物巖白菜中，在海南龍腦香科植物青梅中亦可提取[2].有研究表明巖白菜素具有一定的抗癌和抗HIV病毒活性，但機(jī)理不明，目前尚未見(jiàn)有關(guān)其與DNA相互作用的研究報(bào)道.本文主要研究巖白菜素與DNA相互作用的機(jī)理，包括反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及結(jié)合方式等，為研究巖白菜素的抗癌機(jī)理提供重要信息.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301熒光分光光度儀（Shimadzu公司）；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海普析通用）；鯡魚(yú)精DNA(sigma公司)；巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品（中檢所，溶于甲醇配制成1×10-3mol/L）；鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（中檢所，配制成1×10-3mol/L）；三羥甲基氨基甲烷（0.1 mol/L）.

其它所用試劑均為分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在一系列10 mL比色管中，依次加入1 mLpH7.4的Tris-HCl緩沖溶液，0.2 mL的巖白菜素溶液和不同量的DNA溶液，再用二次蒸餾水稀釋到刻度，搖勻，以相同濃度的DNA溶液為參比，進(jìn)行紫外吸收光譜的測(cè)定.

在一系列10 mL比色管中，依次加入1 mL pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液，0.2 mL的鹽酸小檗堿溶液，0.2 mL的DNA溶液和不同量的巖白菜素溶液，再用二次蒸餾水稀釋到刻度，搖勻，在熒光儀上進(jìn)行熒光光譜測(cè)定.熒光激發(fā)波長(zhǎng)選擇358 nm，狹縫寬度均為5 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA對(duì)巖白菜素紫外可見(jiàn)吸收光譜的影響

根據(jù)巖白菜素與DNA反應(yīng)的紫外吸收譜圖（見(jiàn)圖2），隨著DNA濃度的增大（圖2，b→e∶1.36×10-4mol/L，2.04×10-4mol/L，2.72×10-4mol/L，3.4×10-4mol/L），巖白菜素（圖2，a∶2×10-5mol/L）在215 nm處的紫外吸收峰發(fā)生了紅移，同時(shí)在吸光度發(fā)生顯著降低，由于藥物在有DNA存在時(shí)出現(xiàn)減色效應(yīng)、紅移現(xiàn)象是該物質(zhì)與DNA發(fā)生插入作用的標(biāo)志[3]，產(chǎn)生減色效應(yīng)的原因是DNA堿基對(duì)與插入藥物分子間發(fā)生π電子堆積，使后者π空軌道上也有一定的電子填充，從而使藥物分子荷電躍遷（MLCT）的幾率減小[4]，因此巖白菜素是以嵌入式嵌入到DNA雙螺旋的堿基對(duì)之間.

2.2 巖白菜素對(duì)BR-DNA體系的熒光光譜的影響

鹽酸小檗堿（BR）可以專一性地插入DNA雙螺旋的堿基對(duì)之間，使本身很弱的熒光得到顯著性增強(qiáng)[5]，當(dāng)鹽酸小檗堿從雙螺旋中出來(lái)時(shí)，熒光又顯著性降低，當(dāng)體系中存在其他可與DNA發(fā)生作用的小分子時(shí)，該小分子可與小檗堿競(jìng)爭(zhēng)與DNA的結(jié)合，將小檗堿從DNA雙螺旋中擠出，導(dǎo)致體系熒光強(qiáng)度降低，而且體系熒光減弱的強(qiáng)度與小分子與DNA結(jié)合作用的強(qiáng)度存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此可作為熒光探針研究DNA與小分子化合物的相互作用.由圖3可知，隨著巖白菜素（熒光強(qiáng)度很弱）濃度增大（圖3，b→f∶2× 10-5mol/L，4×10-5mol/L，6×10-5mol/L，8×10-5mol/L，1×10-4mol/L），BR-DNA體系（圖4，a；2×10-5mol/L BR+6.8×10-5mol/LDNA）熒光強(qiáng)度顯著猝滅，說(shuō)明巖白菜素與DNA發(fā)生了相互作用，影響了鹽酸小檗堿與DNA分子的結(jié)合.

2.3 DNA對(duì)BR-DNA體系的熒光猝滅方式的判斷及結(jié)合常數(shù)的計(jì)算

熒光猝滅可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅2大類，根據(jù)猝滅Stern-Volumer方程

可計(jì)算出猝滅常數(shù)KSV=9446L·mol-1，相應(yīng)的雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)Kq=9.45×1011 L·mol-1·S-1，遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)（Kq=2.0×1010L·mol-1·s-1）[7]，證明巖白菜素對(duì)BR-DNA體系的猝滅屬于靜態(tài)猝滅.

由靜態(tài)猝滅而導(dǎo)致熒光體熒光強(qiáng)度減弱的過(guò)程，其初始熒光強(qiáng)度F0，加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度F、猝滅劑濃度[Q]、結(jié)合常數(shù)K及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n之間的關(guān)系式可表示如下[8]由lg[（F0-F）/F]對(duì)lg[Q]作圖，見(jiàn)圖4.由圖4可得到25℃下巖白菜素與DNA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合常數(shù)分別為0.9814和7.86×103L·mol-1.

2.4 粘度研究

粘度測(cè)定被認(rèn)為是確定鍵合模式最有力的證據(jù)之一，當(dāng)藥物分子以嵌入的方式與DNA結(jié)合，DNA為容納插入的分子雙螺旋變長(zhǎng)，粘度相應(yīng)地增加[9].向固定濃度的DNA溶液中加入不同量的巖白菜素，測(cè)定其相對(duì)粘度，發(fā)現(xiàn)隨著巖白菜素濃度的增大，DNA相對(duì)粘度逐漸增高，由此可知巖白菜素與DNA以嵌入方式結(jié)合，此結(jié)果與熒光、紫外光譜結(jié)果相吻合.

3 結(jié)論

用熒光法和紫外吸收光譜法以及粘度法研究了DNA與巖白菜素的相互作用，結(jié)果表明，DNA與巖白菜素之間存在較強(qiáng)的相互作用，25℃時(shí)結(jié)合常數(shù)為7.86×103L·mol-1，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為0.9814，結(jié)合方式是巖白菜素通過(guò)嵌入結(jié)合的方式與DNA結(jié)合，該結(jié)合方式可導(dǎo)致癌細(xì)胞DNA受到損傷從而不能復(fù)制.該研究為研究巖白菜素的抗癌機(jī)理提供了重要信息.

[1]Blackburn G M,Gait M J.Nucleic acids in chemistry and biology[M].New York,IRL Press,1990.

[2]陳光英,蔡寶華,吳曉鵬,等.HPLC法測(cè)定青梅莖皮中巖白菜素[J].中草藥,2008,39(5):776-777.

[3]Kumar C V,Asuncion H E.DNA binding studies and site selective fluorescence sensitization of an anthryl probe[J].J Am Chem Soc,1993,115:8547-8553.

[4]Tysoe S A,Morgan R J,Baker T C,et al.Spectroscopic investigation of differential binding modes of Δ-and A-Ru（bpy）（2ppz）2+with calf thymus DNA[J].J Phys Chem 1993,97:1707-1711.

[5]賀吉香,江崇球,高明霞,等.鹽酸小檗堿與脫氧核糖核酸相互作用的研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2003,23(4):755-758.

[6]Eftink M R,Ghiron C A.Anal Biochem,Fluorescence quenching studies with proteins[J].Anal Biochem,1981,114:199-227.

[7]Kandagal P B,Seetharamappa J,Shaikh S M T,et al.Bind?ing of trazodone hydrochloride with human serum albu?min:A spectroscopic study[J].J Photochem Photobiol A,2007,185:239-244.

[8]Kandagal P B,Ashoka S,Seetharamappa J,et al.Study of the interaction of an anticancer drug with human and bo?vine serum albumin:spectroscopic approach[J].J Pharma?ceutical and Biomedical Anal,2006,41:393-399.

[9]Palanisamy U M,Mallayan P.DNA binding and cleavage activity of[Ru(NH3)4(diimine)]Cl2complexes[J].Inor?ganica Chimica Acta,2004，357:901-912.

Study of the Interaction Between Bergenin and DNA

LIU Wei，ZHANG Qiongmei
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Hainan Normal University，Haikou571158，China；2.Hainan Provincial Key Lab of Tropical Pharmaceutical Herb Chemistry，Haikou571158，China）

The interaction of Bergenin and DNA was studied using UV spectrometry,viscosity method and fluorescence spectroscopy with Berberine（BR）as the fluorescent probe.The results showed that at pH 7.4 Tris-HCl buffer solution,the increase of the concentration of DNA caused red shift of the absorption peak and the decrease of the absorbance at 215 nm of Bergenin,which proved that there existed intercalative reaction between Bergenin and DNA;the fluorescence intensity of BR-DNA system was quenched when Bergenin was added and the quenching mechanism was judged as a static quenching;the binding constant K and binding sites n were calculated as 7.86×103L·mol-1and 0.9814 respective?ly at 25℃.The viscosity experiment further proved that Bergen reacts with DNA in the mode of intercalative binding.The result can provide important information for the research of anticancer and anti-HIV mechanism of Bergenin.

Bergenin;DNA；fluorescent probe；fluorescence spectroscopy；UV spectrometry；interaction

O 657.32

A

1674-4942（2011）02-0177-03

2011-04-03

海南省有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放基金項(xiàng)目（007）；海南省教育廳項(xiàng)目（Hjkj2009-39）

畢和平