張利娟(綜述)，郝邯生(審校)

(1.天津醫(yī)科大學研究生院，天津300070;2.中國人民武裝警察部隊醫(yī)學院附屬醫(yī)院傳染科，天津300162)

鮑曼不動桿菌為條件致病菌，可引起醫(yī)院內特別是重癥監(jiān)護病房中危重患者的各種感染，包括呼吸機相關性肺炎、皮膚和軟組織感染、傷口感染、繼發(fā)性腦膜炎、血行感染［1］等。鮑曼不動桿菌是院內感染的重要病原菌，在革蘭陰性桿菌所致的院內感染中位居前四位［2］，在重癥監(jiān)護病房非發(fā)酵菌感染中居第一、二位［3，4］。細菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動桿菌多重耐藥甚至泛耐藥菌株正以驚人的速度增加，近年來又出現(xiàn)了 XDR(extreme drug resistance)［5］和超級細菌［6］，并在世界范圍內播散，給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)。氨基糖苷類抗菌藥在治療嚴重細菌感染中發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)就介導革蘭陰性菌尤其是鮑曼不動桿菌氨基糖苷類抗菌藥耐藥的一種新機制16SrRNA甲基化酶綜述如下。

1 氨基糖苷類抗菌藥及其細菌耐藥

氨基糖苷類作為一類高效、廣譜、殺菌類藥物廣泛應用于臨床，特別是治療革蘭陰性菌所致的嚴重感染。該類藥物作用于細菌核糖體30S亞基的16SrRNA高度保守的A區(qū)，干擾細菌蛋白質的合成，從而引起細菌死亡。根據(jù)核糖體作用部位的不同，氨基糖苷類可分為以下幾類:①與A位點結合的氨基糖苷類，包括4，6-二取代脫氧鏈霉胺類。卡那霉素組——阿貝卡星、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素;慶大霉素組——慶大霉素、西索霉素、異帕米星、奈替米星。4，5二取代脫氧鏈霉胺類:如新霉素、巴龍霉素、青紫霉素A、核糖霉素。不同于以上結構的其他氨基糖苷類(如安普霉素)。②非A位點結合的氨基糖苷類，如鏈霉素、壯觀霉素等［7］。細菌對氨基糖苷類耐藥主要是產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶。

2003年質粒編碼的16SrRNA甲基化酶作為介導高水平氨基糖苷類耐藥的新機制出現(xiàn)。迄今為止，7種16SrRNA甲基化酶基因armA［8］、rmtA［9］、rmtB［10］、rmtC［11］、rmtD［12］、rmtE［13］和npmA［7］已經(jīng)在世界范圍的腸桿菌科、銅綠假單胞菌、不動桿菌中出現(xiàn)，檢出率0.03%～95.00%不等，這種差異取決于細菌的樣本量，特別是對氨基糖苷類的耐藥水平。此外，不同類型的甲基化酶存在于不同地區(qū)不同細菌種屬中，rmtA最初發(fā)現(xiàn)只存在于日本和韓國銅綠假單胞菌中，rmtD只在拉丁美洲存在，鮑曼不動桿菌僅檢測到armA［14］。

2 新的耐藥機制——16SrRNA甲基化酶的發(fā)現(xiàn)

16SrRNA甲基化酶原本是抗生素產(chǎn)生菌(如鏈霉菌屬和小單孢菌屬)為免于被自身產(chǎn)生的抗生素殺滅，在S-腺苷甲硫氨酸協(xié)同下對rRNA的轉錄后甲基化，是一種自我保護機制，曾被認為沒有臨床意義［15］。2003年，Galimand等［8］從泌尿系統(tǒng)分離的多重耐藥肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了16SrRNA甲基化酶armA，這是首次在臨床菌株中發(fā)現(xiàn)編碼該類酶的基因，該菌對4，6二取代脫氧鏈霉胺類耐藥，對安普霉素、巴龍霉素、鏈霉素敏感。Yokoyama等［9］從銅綠假單胞菌AR-2中發(fā)現(xiàn)了16SrRNA甲基化酶rmtA，該菌對慶大霉素組、卡那霉素組及新霉素高水平耐藥［最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)＞1024 mg/L］，對鏈霉素敏感。2004年，Doi等［10］從黏質沙雷菌S-95中發(fā)現(xiàn)了rmtB，該菌對慶大霉素組和卡那霉素組高水平耐藥，對新霉素和潮霉素B敏感。2006年，Wachino等［11］從奇異變形桿菌中發(fā)現(xiàn)rmtC，該菌對慶大霉素組和卡那霉素組高水平耐藥(MIC＞1024 mg/L)，但對新霉素和鏈霉素敏感。2007年Doi等［12］從銅綠假單胞菌PA0905中分離出rmtD，該菌對阿貝卡星、阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素的MIC值均高于256 mg/L，對安普霉素、新霉素和鏈霉素敏感。Wachino等［7］在多重耐氨基糖苷類的大腸埃希菌ARS3中分離出npmA，介導對卡那霉素組、慶大霉素組、新霉素、核糖霉素、阿普霉素、壯觀霉素耐藥(MIC＞256 mg/L)。2010年 Davis等［13］從牛分離出的耐慶大霉素和阿米卡星的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)了rmtE。至此，7種16SrRNA甲基化酶介導對多種氨基糖苷類高水平耐藥基因被發(fā)現(xiàn)。鮑曼不動桿菌攜帶16SrRNA甲基化酶armA最早在韓國［16］發(fā)現(xiàn)，隨后北美［17］、中國大陸地區(qū)［18］也相繼報道。目前在鮑曼不動桿菌中尚未發(fā)現(xiàn)其他編碼16SrRNA甲基化酶的基因型。

3 16SrRNA甲基化酶介導的氨基糖苷類耐藥機制

氨基糖苷類抗菌藥通過與細菌核糖體30S亞基16SrRNA上A位點的一個高度保守基元結合(該結構由A1408·A1492堿基對和1492位點的腺苷突起組成的不對稱內環(huán)形成的口袋結構)，影響翻譯的多個步驟，特別是誘導密碼子錯讀，干擾蛋白質合成，引起細菌死亡［8］。16SrRNA甲基化酶使細菌核糖體30S亞基16SrRNA的A位點中一個或幾個堿基甲基化，使氨基糖苷類不能與相應靶位結合，導致細菌耐藥［19］。armA使A位點G1405上的N-7甲基化，甲基化后阻礙G1405的N7與4，6-二取代脫氧鏈霉胺類3″氨基群之間的氫鍵形成，在空間上阻礙G1405與慶大霉素的環(huán)Ⅲ結合，甲基化也給G1405引入正電荷，不利于氨基糖苷類結合到解碼位點。其他介導4，6二取代脫氧鏈霉胺類耐藥的16SrRNA甲基化酶也是甲基化G1405位點相應的堿基。NpmA則甲基化16SrRNA的A1408上的N-1，同時介導對4，6二取代脫氧鏈霉胺和4，5二取代脫氧鏈霉胺類耐藥［7］。該類酶直接作用于氨基糖苷類藥物作用的靶位，引起對常用的幾乎所有氨基糖苷類高水平耐藥。這與氨基糖苷類修飾酶的耐藥機制不同，修飾酶作用的底物具有特異性，不會引起泛氨基糖苷類耐藥，且多為中等水平耐藥。

4 16SrRNA甲基化酶的傳播機制

目前已知的16SrRNA甲基化酶基因均位于質粒上，又常與Ⅰ類整合子或轉座子相關聯(lián)，這些結構與基因的移動、傳播有密切關系。

4.1 armA 分離自腹瀉豬的大腸埃希菌MUR050，其armA位于質粒pMUR050上，該質粒屬于質粒IncN不相容群(分離自人的armA位于IncL/M質粒上)。armA位于復合型轉座子上，介導其在人和動物分離的腸桿菌間傳播。質粒轉化后，受體菌也對4，6二取代脫氧鏈霉胺類耐藥。該質粒上一組負責質粒復制、移動和結合的基因(如repA、oriT、tra家族)，與來源于鼠傷寒沙門菌的IncN群不相容性結合性質粒R46同源性99%，表明類R46復制子是armA的載體。研究發(fā)現(xiàn)，armA位于復合型轉座子Tn1548上，上游為轉座酶基因tnpU和由intⅠ1-ant 3″9-qacE△Ⅰ-sul1-orf513組成的Ⅰ類整合子，下游包括轉座酶基因tnpD、大環(huán)內酯類外排泵基因mefE/ mel、大環(huán)內酯類磷酸轉移酶基因mph，兩側為兩拷貝的插入序列IS26［20］。armA復合型轉座子也存在于其他細菌中。分離自波蘭的弗氏枸櫞酸桿菌pCTX-M3也存在類似的復合型轉座子結構，其ant3″9上游還存在dhfrXⅡ基因。分離自法國肺炎克雷伯菌的armA位于結合性IncL/M型質粒pIP1204上，其上游為ISCR1和轉座酶基因tnpU，下游為轉座酶基因tnpD，并與介導廣譜頭孢菌素類耐藥的blaCTXM相連［8］。大腸埃希菌也存在相同的遺傳環(huán)境。最近報道分離自雞大腸埃希菌pHNE的armA，其上游和上述報道相同，下游為 IS26、tnpA-Tn3-like和tnpA-Tn3-like結構，表明IS26和轉座酶都參與armA的移動播散［21］。Kang等［22］報道armA位于多個結合性質粒上，如IncL/M、IncFIIAs、IncF、IncA/C、IncHI2，并且菌株對多種抗菌藥物耐藥。由多種不相容性群的結合性質粒介導armA在腸桿菌科細菌間傳播可導致多重耐藥菌的產(chǎn)生。

鮑曼不動桿菌armA的遺傳環(huán)境與腸桿菌科中復合型轉座子Tn1548的遺傳環(huán)境基本相同，其上游orf513編碼轉座酶，形成ISCR1，并且常常與Ⅰ類整合子相連，轉座酶基因tnpU也位于上游，下游為轉座酶基因tnpD［17］。表明Tn1548是革蘭陰性菌不同種系間armA有效的移動載體。

4.2 其他16SrRNA甲基化酶基因 銅綠假單胞菌AR-2的rmtA位于介導汞耐藥的轉座子Tn5041上，上游是轉座酶基因類似序列(序列1)和tRNA核糖轉移酶基因orfA，下游是類Na+/H－反向轉運基因序列(序列2)。在AR-11中rmtA上游orfA被截斷，由IS6100取代，下游仍為序列2，rmtA兩端均有orfQ-orfI結構［23］;黏質沙雷菌S-95的rmtB位于非結合性但可電轉化入受體菌的大質粒上，上游為一含blaTEM的轉座子 Tn3，下游是編碼轉座酶的開放讀碼框orf2［10］。Doi等［24］又發(fā)現(xiàn)，rmtB 可能會被含有blaCTX-M的質粒捕獲而傳播;奇異變形桿菌ARS68的rmtC位于含轉座酶tnpA的ISEcpI類似元件的下游［11］;銅綠假單胞菌PA0905的rmtD上游為整合子In163，兩側為ISCR14元件，下游為tRNA核酸轉移酶基因和Tn5564部分結構。肺炎克雷伯菌R2中rmtD下游為Ⅰ類整合子，兩側為IS26［25］;目前，rmtE只在牛源性大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)，尚在研究中［13］;大腸埃希菌ARS3的npmA上游是3個開放讀碼框orf3、orf4及orf5，下游為orf7和orf8。含二拷貝IS26元件，形成轉座單元［7］。

5 結語

目前，16SrRNA甲基化酶在不同國家、不同地區(qū)、不同菌種間分布具有明顯差異。此類酶最初發(fā)現(xiàn)于腸桿菌科中［8］，大腸埃希菌攜帶的種類最多，包括armA、rmtB、rmtE、npmA，肺炎克雷伯菌也已檢測到armA、rmtB，而在鮑曼不動桿菌中只檢測到armA。該類耐藥決定因子常與其他耐藥基因共同存在于質粒、轉座子等移動元件上，在不同菌種間廣泛傳播，導致多重耐藥菌株的流行，特別是多重耐藥鮑曼不動桿菌，使其對包括氨基糖苷類、碳青霉烯類等多種抗菌藥物耐藥。多重耐藥的機制及相關耐藥基因的播散成為微生物學、流行病學及臨床醫(yī)學關注的焦點。

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