吳書奇 史卉玲 席琳 喬楊 麗娟 張玲 馬春暉

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

乳酸菌是一類可利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱［1］。乳酸菌種類很多，目前在細(xì)菌分類學(xué)上被分為乳桿菌屬(Lactobaci llus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)，芽孢桿菌屬(Bacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串球菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、利斯特氏菌屬(Listeria)等30幾個(gè)屬［2］。按發(fā)酵過程中的產(chǎn)物不同，可分為同型乳酸發(fā)酵菌(同型乳酸菌)和異型乳酸發(fā)酵菌(混合乳酸菌)兩大類［3］。乳酸菌用途廣泛，它令食物美味，并延長保存期，還可以作為保健用品和藥品，同時(shí)乳酸菌在飼料工業(yè)中也起著重要的作用。目前合理利用牧草和作物秸稈是當(dāng)今家畜飼料學(xué)研究的主要課題之一，尤其是在青貯飼料制備這一領(lǐng)域，已經(jīng)有很多國家如歐盟國家和美國的研究者對乳酸菌在青貯飼料制備中的應(yīng)用進(jìn)行了大量深入的研究，乳酸菌在家畜飼養(yǎng)和飼料中有著重要的作用，特別是應(yīng)用于青貯飼料的調(diào)制［2，4］。由于南疆地區(qū)氣候干燥，降雨量少，不適宜植被生長，牧草缺口比較大，但綠洲區(qū)秸稈資源豐富，通過秸稈青貯，充分利用好這些秸稈資源，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益，將有助于節(jié)約糧食資源。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菑那噘A玉米中分離乳酸菌，篩選出pH下降快，產(chǎn)乳酸多的乳酸菌菌株，并且通過形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)方法進(jìn)行了初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

取阿拉爾十團(tuán)牛場青貯窖玉米秸稈青貯，放入自封袋中扎好。記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等。

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(Bioteke corporation);X －gal、IPTG、瓊脂糖;氨芐青霉素、溶菌酶、蛋白酶K(Takara公司);DL2000(西安沃爾森公司);引物由華大基因合成;TIANamp Bacteria DNA Kit(天根生化科技有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、1.0mL 吐溫 80、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀 2.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、蒸餾水1 000mL，121℃滅菌20 min，pH 6.2 －6.4，固體培養(yǎng)基加入瓊脂15.0 g/L。

LB培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0g、氯化鈉10.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH為7。固體培養(yǎng)基加入瓊脂15.0 g/L。

1.1.4 儀器與設(shè)備

上海博迅實(shí)業(yè)有限公司HPX－9162MPE電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海申安醫(yī)療儀器廠LDZX－50KB立式壓力蒸汽滅菌器，HANNA PH211臺(tái)式酸度計(jì)，Heal Force高速冷凍離心機(jī)，金壇THZ－8B汽浴恒溫?fù)u床，中科美菱DW－HW318超低溫冰箱，博迅SW－CJ－1FD潔凈工作臺(tái)，TECHNE TC－512 PCR儀，DYY－10C型電泳儀，Tanon凝膠成像儀。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

菌株的篩選與純化取10 g樣品放入液體MRS培養(yǎng)基，室溫發(fā)酵24 h后，從上清液中吸取1mL液體，加入 9 mL 的無菌水中，梯度稀釋 10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，取 10－3，10－4，10－5，涂布于固體MRS平板分離培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)72 h，觀察描述菌落特征，挑取單菌落，在固體MRS培養(yǎng)基繼續(xù)劃線純化，至少純化兩次，直至出現(xiàn)單菌落，且菌落特征和菌體特征均一為止［5－6］。挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后，儲(chǔ)存于30%甘油管中，－80℃低溫冰箱凍存。

1.2.2 產(chǎn)酸速率的測定 將劃線分離菌株接種于裝盛有30 mL MRS液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，37℃靜置培養(yǎng)72 h，測量發(fā)酵液的pH值。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 生理生化鑒定

篩選的乳酸菌菌株在MRS培養(yǎng)基上活化24 h后，根據(jù)東秀珠，凌代文等介紹的方法，將分離純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶試驗(yàn)，然后按照乳酸菌的屬鑒定程序區(qū)分乳酸菌不同的菌屬［7］。

通過菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)及生理生化反應(yīng)結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》中相關(guān)分類標(biāo)準(zhǔn)比較，可初步鑒定篩選菌株屬種［8］。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

1.3.2.1 乳酸菌分離株菌株基因組的提取，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行基因組提取。

1.3.2.2 引物的序列為 27f:5＇－ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3＇1492r:5＇－GGTTACCTTGTT ACGACTT －3＇

1.3.2.3 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的檢測與序列測定

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL:10×PCR buffer 2.0 μL;dNTP(2.5 mM)1 μL;Primers(20 μM):Forward 1.0 μL;Reverse 1.0 μL;Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.5 μL;DNAtemplate(50 ng/μL)0.5 μL;加水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件如下:預(yù)變性，95 ℃，3 min;變性，94 ℃，1 min;退火，53 ℃，1 min;引物延伸，72℃，1 min20 s，30個(gè)循環(huán);延伸，72℃，8 min。16S rRNA的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物上樣量為5 μL，電泳緩沖液使用0.5 ×TAE，100 V 電泳30 min，EB(0.5 μg/mL)染色后在紫外燈下觀察結(jié)果，PCR產(chǎn)物為約1.5 kb大小的電泳條帶，凝膠成像儀下觀察拍照。

測序工作由天根生化科技(北京)有限公司完成。用NCBI的Blast程序?qū)⒌玫?6S rDNA序列與GenBank中已知的16S rRNA序列進(jìn)行比較鑒定，找出與目的基因序列同源性高的已知分類的菌種，提取其16S rRNA序列，使用軟件SeqPup，錄入菌株的16S rRNA序列和從GenBank數(shù)據(jù)庫中提取的標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA序列，進(jìn)行多序列匹配排列，用軟件 Mega 4.1 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［9］。

圖1 不同菌株的pH值變化情況

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離與保存

采用傳統(tǒng)的分離純化方法從青貯樣品中共分離出4株菌，菌株分別標(biāo)記為菌株D、菌株F、菌株J、菌株L，純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 乳酸菌產(chǎn)酸速率的測定

通常在實(shí)際生產(chǎn)中，青貯飼料發(fā)酵初期，迅速降低的pH值可以抑制原料中酵母菌、霉菌以及腐敗菌的生長，產(chǎn)酸速率是衡量乳酸菌活力的重要指標(biāo)。將實(shí)驗(yàn)篩選的4個(gè)菌株做一個(gè)發(fā)酵試驗(yàn)，按照3%的接種量轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀測pH值，初步篩選產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株。由圖1可以看出，發(fā)酵48 h后菌株F與菌株J產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。淘汰菌株D和菌株L，選擇pH值下降快、產(chǎn)酸量多的菌株F與菌株J保留，進(jìn)行進(jìn)一步的菌株鑒定。

將純化好的菌珠F與菌株J接種分別加入高壓滅菌的MRS液體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔8 h測定其pH值變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌珠F與菌株J在發(fā)酵24 h后pH值穩(wěn)定在4.0以下，適宜于做青貯乳酸菌。

圖2 菌株F和菌侏J的產(chǎn)酸速率的測定

2.3 菌株鑒定

2.3.1 生理生化鑒定

菌株F，菌落不透明，白色微黃;經(jīng)革蘭氏染色后在油鏡下觀察，細(xì)胞球形，成鏈狀;菌株F接觸酶反應(yīng)為陽性。菌株J白色，圓形，菌落中央隆起，表面光滑、濕潤，邊緣整齊;經(jīng)革蘭氏染色后在油鏡下觀察，菌株J細(xì)胞為直桿狀，成對分布，菌株J接觸酶反應(yīng)為陽性。菌株F和菌株J均可在鹽性條件(6.5%的NaCl)下生長。

2.3.2 乳酸菌菌株16S rRNA序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化樹建立

菌株F與菌株J提取基因組后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1500bp左右有一條清晰條帶，和預(yù)期結(jié)果一致。

圖3 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖4 菌株F與系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹

經(jīng)過Blast序列比對，分別挑選與菌株F和菌株J序列同源性在98%以上的標(biāo)準(zhǔn)菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株F和菌株J在系統(tǒng)發(fā)育上屬于厚壁菌門Firmicutes，芽孢桿菌綱 Bacilli，芽孢桿菌目 Bacillales;菌株F為Staphylococcus;菌株J屬于芽孢桿菌科Bacillacea，芽孢桿菌屬Bacillus。因此推測菌株F為葡萄球菌屬，菌株J為芽孢桿菌屬。

3 討論

16S rRNA具有功能與進(jìn)化上的同源性，其序列進(jìn)化變異頻率緩慢，在結(jié)構(gòu)上極具保守性，并且其分子大小適中，攜帶有充分的生物信息，因此16S rRNA的序列檢測已被成功地建立為一種鑒定微生物種、屬、家族的標(biāo)準(zhǔn)方法［10］。

本試驗(yàn)從青貯玉米中篩選出兩株菌，菌株F和菌株J，經(jīng)過形態(tài)特征、生理生化鑒定和16S rRNA序列分析方法鑒定，初步確定F為葡萄球菌屬，J為芽孢桿菌屬，且兩株菌在發(fā)酵試驗(yàn)中24 h后pH值下降到4以下，產(chǎn)酸能力均很強(qiáng)，乳酸菌的初步分離和鑒定是本項(xiàng)研究的第一步工作，但作為添加劑的應(yīng)用還需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)篩選出產(chǎn)酸能力強(qiáng)的兩株菌，初步確定菌株F為屬于葡萄球菌屬，菌株J屬于芽孢桿菌屬，且兩株菌在24 h內(nèi) pH值下降到4以下，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，可以作為秸稈青貯添加菌株，對促進(jìn)南疆秸稈資源的青貯利用，緩解飼草不足具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。

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