汪彩華,鄭 平,胡安輝 (.浙江大學(xué)環(huán)境工程系,浙江 杭州 30029；2.北京天地人環(huán)保科技有限公司,北京0076)

硝化產(chǎn)物對(duì)硝化細(xì)菌混培物保藏特性的影響

汪彩華1,2,鄭 平1*,胡安輝1(1.浙江大學(xué)環(huán)境工程系,浙江 杭州 310029；2.北京天地人環(huán)?？萍加邢薰?北京100176)

采用添加硝化產(chǎn)物的方法,研究了饑餓保藏過程中硝化產(chǎn)物對(duì)硝化細(xì)菌混培物活性和相關(guān)性狀的影響.結(jié)果表明,饑餓保藏過程中添加亞硝酸鹽可改善硝化細(xì)菌混培物的保藏效果,并明顯降低硝化活性的衰減速率.缺氧條件下,4℃加5mmol/L亞硝態(tài)氮、4℃加5mmol/L硝態(tài)氮及4℃不加代謝產(chǎn)物3種保藏方法下的硝化活性均呈指數(shù)衰減,衰減速率分別為0.010d-1、0.020d-1、0.021d-1,半衰期分別為72.3、33.9、32.7d;硝化活性趨于穩(wěn)定時(shí),3種方法下的硝化活性保留率分別為18.7%、19.1%和15.1%,總菌體量保留率分別為62.0%、47.3%和58.7%;隨著饑餓保藏時(shí)間的延長(zhǎng),各方法下的硝化細(xì)菌混培物ATP含量和血紅素c含量均隨硝化活性的衰減而下降,混培物顏色也隨硝化活性的衰減而變黑.

硝化細(xì)菌混培物；硝化產(chǎn)物；保藏特性

硝化作用是多種生物脫氮技術(shù)的基礎(chǔ),是氨經(jīng)亞硝酸細(xì)菌氧化成亞硝酸,再經(jīng)硝酸細(xì)菌氧化成硝酸的一個(gè)系列反應(yīng)[1-2],除了涉及到氨、亞硝酸和硝酸等多種產(chǎn)物和基質(zhì)外,還涉及到生物催化劑—硝化細(xì)菌.由于硝化裝置中基質(zhì)氨濃度較高,硝化過程中常有亞硝酸和硝酸的積累,而當(dāng)亞硝酸和硝酸積累到一定濃度時(shí)會(huì)對(duì)硝化細(xì)菌活性產(chǎn)生抑制作用[3-5].

而隨著廢水生物脫氮工程的普及,對(duì)高效硝化菌種的需求日益增大.但至今為此,國內(nèi)對(duì)硝化細(xì)菌混培物保藏的研究還未見報(bào)道,國外也僅僅停留于研究低溫對(duì)硝化細(xì)菌混培物保藏的影響[6-8].亞硝酸鹽和硝酸鹽作為硝化作用的產(chǎn)物,積累到一定濃度會(huì)對(duì)硝化活性產(chǎn)生抑制作用,但若能在基質(zhì)缺乏的工況下仍對(duì)硝化活性有抑制作用,卻變成了是一件幸事.因此,設(shè)計(jì)了在硝化細(xì)菌混培物保藏過程中加入硝化產(chǎn)物的試驗(yàn),以探究硝化產(chǎn)物亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮是否可以對(duì)硝化細(xì)菌混培物的饑餓狀況起到正調(diào)控作用,從而有助于硝化菌種的保藏和應(yīng)用.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用硝化細(xì)菌混培物取自浙江某企業(yè)短程硝化池(總?cè)莘e2.5m3),該短程硝化池采用模擬廢水(其成分詳見文獻(xiàn)[9])運(yùn)行,并已在自然環(huán)境溫度下穩(wěn)定運(yùn)行一年半,混培物濃度為2～3gMLVSS/L,容積負(fù)荷達(dá) 1.5～2kg/(m·d),沉降比為15%.

1.2 保藏試驗(yàn)

硝化細(xì)菌混培物用自來水洗滌 3次后自然沉降潷水,分別在3個(gè)1L的玻璃瓶(R1、R2、R3)中分裝800mL沉降潷水后的混培物和100mL模擬廢水,使 3個(gè)瓶中的最終氨氮濃度均為5mmol/L,混培物濃度均為 19.72gMLSS/L、13.48gMLVSS/L;再分別在 R1中另加入亞硝態(tài)氮,R2中加入硝態(tài)氮,使其終濃度均為 5mmol/L;最后將 3個(gè)玻璃瓶(R1、R2、R3)用鋁箔封口并置于 4℃冰箱中保藏,每隔 1個(gè)月取混培物測(cè)定活性和其他相關(guān)指標(biāo).模擬廢水成分為MgSO4· 7H2O 0.3g/L, KHCO32.0g/L, KH2PO40.01g/L, CaCl2·2H2O 0.0056g/L,微量元素Ⅰ、Ⅱ各1mL/L[2].

1.3 活性測(cè)定

活性測(cè)定所用的模擬廢水成分同上,氨氮濃度為50mg/L,pH值控制在7.7～7.8.每20mL模擬廢水中加入 2.5g濕硝化細(xì)菌混培物后曝氣2min使溶解氧達(dá)到飽和,再在 30℃下用溶解氧自動(dòng)記錄儀記錄溶解氧的消耗情況,每隔 2s記錄一次,直至溶解氧降為0.5mg/L.另設(shè)不加基質(zhì)的對(duì)照試驗(yàn),用同樣的方法測(cè)定硝化細(xì)菌混培物的耗氧速率.

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

SS、VSS(總菌體量)、SV30采用國標(biāo)法[10]; COD采用EVOVI ET99718COD儀快速測(cè)定;pH值采用pHS－9V型酸度計(jì)測(cè)定;DO采用YSI 58型溶解氧儀測(cè)定(外接自動(dòng)記錄儀);硫化物采用亞甲基藍(lán)分光光度法測(cè)定;硫酸鹽采用鉻酸鋇分光光度法測(cè)定.

ATP:熒光素酶法[11-12].取 1g濕硝化細(xì)菌混培物于2mL雙蒸水中制成菌懸液,再于沸水浴中煮1h的4.5mL提取劑(20mmol/L Tris、2mmol/L EDTA, pH值7.75)中加入0.5mL菌懸液,共同煮10min,冷卻后于10,000g、4℃下離心4min,取上清夜待用.25℃下,向2mL計(jì)數(shù)瓶中加入1mL緩沖液(0.05mol/L Tris-HAc、0.01mol/L MgSO4· 7H2O、2mmol/L EDTA,pH值7.75)后,再加入樣品提取液、熒光素和熒光素酶,混合后立即于熒光分光光度計(jì)中測(cè)定發(fā)光值.

血紅素:吡啶血紅素分光光度法.取 1g濕硝化細(xì)菌混培物懸浮于25mL 10mmol/L、pH值為7.5的磷酸緩沖液中,再于800W功率下超聲破碎20min,最后于 15,000g、4℃條件下離心 15min,取上清液進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定方法詳見文獻(xiàn)[13].

掃描電鏡觀察:取適量混培物樣品于2.5%戊二醛溶液中 4℃固定過夜,經(jīng) 0.1mol/L pH值為7.0磷酸緩沖液洗滌3次后用1%鋨酸溶液固定1～2h, 接著用0.1mol/L pH 7.0磷酸緩沖液洗滌3次,再用梯度濃度乙醇(包括 50%、70%、80%、90%和 100%)進(jìn)行脫水處理,脫水處理后的樣品用1:1乙醇醋酸異戊酯處理30min,用純醋酸異戊酯處理 1～2h.最后將樣品置于臨界點(diǎn)干燥,鍍膜后用XL30型環(huán)境樣品掃描電鏡(荷蘭Philips公司)觀察結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 硝化產(chǎn)物對(duì)硝化活性和總菌體量的影響

2.1.1 硝化產(chǎn)物對(duì)硝化活性的影響 高濃度氨氮的硝化裝置中,當(dāng)代謝產(chǎn)物亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮積累到一定濃度時(shí)會(huì)對(duì)硝化細(xì)菌活性產(chǎn)生抑制作用.添加不同代謝產(chǎn)物后硝化活性隨饑餓保藏時(shí)間的變化如圖1.

從圖 1可看出,在保藏過程中,硝化細(xì)菌混培物活性呈指數(shù)衰減,活性衰減速率和半衰期見表1.饑餓保藏120d后,各保藏方法的硝化活性均趨于穩(wěn)定,R1(4℃加 5mmol/L亞硝態(tài)氮)、R2(4℃加 5mmol/L硝態(tài)氮)和 R3(4℃不加硝化產(chǎn)物)的活性保留率分別為 18.7%,19.1%和15.1%.雖然硝化活性趨于穩(wěn)定時(shí) 3者表觀上顯示的活性保留率相差不多,但比較3者的半衰期發(fā)現(xiàn),R1的半衰期遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于R2和R3,分別是兩者的2.13倍和2.21倍,這一結(jié)果說明添加亞硝態(tài)氮可以暫時(shí)緩解硝化細(xì)菌混培物因饑餓所致的不利影響,但添加硝態(tài)氮的效果不明顯.亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮雖然同為硝化作用代謝產(chǎn)物,但在硝化細(xì)菌混培物的饑餓保藏過程中所起作用不同,饑餓保藏中加入亞硝態(tài)氮可明顯緩解硝化細(xì)菌的饑餓狀況,而加入硝態(tài)氮卻沒有這種效用.究其原因可能有:一是本試驗(yàn)所用硝化細(xì)菌混培物取自短程硝化池,除了優(yōu)勢(shì)菌——氨氧化細(xì)菌外還含有亞硝酸氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌,在短程硝化工藝的長(zhǎng)期馴化過程中反硝化細(xì)菌還原硝態(tài)氮的能力被慢慢弱化,相反還原亞硝態(tài)氮的能力卻被逐漸加強(qiáng),保藏過程中加入的亞硝態(tài)氮可在亞硝酸鹽還原酶的作用下還原成NO[14-15],NO進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成NO2,缺氧條件下 NO2成為氨單加氧酶的共基質(zhì),從而發(fā)生厭氧氨氧化反應(yīng)[16],而一般氨氧化細(xì)菌的厭氧氨氧化速率僅有好氧氨氧化速率的1/10[2],因此減少了硝化細(xì)菌對(duì)氨氮的需求量;二是某些氨氧化細(xì)菌胞內(nèi)也含有亞硝酸鹽還原酶[12],同樣可以將亞硝態(tài)氮還原成NO而發(fā)生厭氧氨氧化反應(yīng).所以,在氨氮供應(yīng)不足的情況下外加亞硝態(tài)氮可起正調(diào)控.

圖1 硝化活性隨保藏時(shí)間的變化Fig.1 The change of nitrifying activity during preservation

2.1.2 硝化產(chǎn)物對(duì)總菌體量的影響 隨著饑餓保藏時(shí)間的延長(zhǎng),硝化細(xì)菌混培物發(fā)生解體,菌體濃度逐漸下降,試驗(yàn)中總菌體量隨保藏時(shí)間的變化如圖2所示.

表1 不同保藏方法下硝化活性衰減速率和半衰期Table 1 The decay rate and half-life of nitrifying activity under different preservation conditions

圖2 總菌體保留率隨保藏時(shí)間的變化量Fig.2 The change of total biomass during preservation

從圖2可知,在饑餓保藏過程中,總菌體保留率隨保藏時(shí)間的延長(zhǎng)而減少,且前60d的衰減速率要明顯比后90d大.保藏的前60d, R1、R2、R3的總菌體量分別下降 22.6%、34.0%、31.8%,而后90d僅分別下降19.8%、22.3%、18.2%.保藏150d后,R1、R2和R3的總菌體量保留率分別為57.6%、42.7%和50.0%,但保藏過程中3者的總衰減速率始終為 R2＞R3＞R1.這一結(jié)果表明, 在硝化細(xì)菌混培物保藏過程中,加入亞硝態(tài)氮不僅可以減緩硝化活性的衰減,而且可以減緩菌體的衰減,但加入硝態(tài)氮的情況卻與此相反,原因有待深入研究.但可說明經(jīng)饑餓保藏后存活下來的硝化細(xì)菌具有抗性強(qiáng)、活性高的特性,而用總菌體量作為硝化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)會(huì)產(chǎn)生虛高現(xiàn)象.

2.2 硝化產(chǎn)物對(duì)硝化細(xì)菌混培物性狀的影響

2.2.1 硝化產(chǎn)物對(duì)生化性狀的影響 血紅素是硝化細(xì)菌中血紅蛋白的重要輔基,ATP則是硝化細(xì)胞中重要的能量載體,因此兩者的含量可以反映硝化細(xì)菌的生理狀況.饑餓保藏時(shí),硝化細(xì)菌混培物中血紅素c和ATP含量保留率與時(shí)間的關(guān)系見表2.

表2 保藏過程中血紅素c和ATP保留率的變化Table 2 The change of heme c and ATP during preservation

饑餓保藏過程中,各種方法下的硝化細(xì)菌混培物血紅素c含量和ATP含量均隨保藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降,且兩者的衰減速率均隨硝化活性衰減速率的變化而變化,但兩者的總體衰減速率要小于硝化活性的總體衰減速率,這與實(shí)驗(yàn)室已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符.這也進(jìn)一步證明,硝化細(xì)菌混培物血紅素c含量和ATP含量可用于定性的表示硝化細(xì)菌混培物的硝化活性,但與硝化活性間不具有線性相關(guān)性.

2.2.2 硝化產(chǎn)物對(duì)物化性狀的影響 饑餓保藏過程中,混培物上清液中可溶性 COD(SCOD)和混培物沉降比(SV30)隨時(shí)間的變化如圖3所示.由圖3(a)可知, R1、R2和R3的SCOD值均隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,且 R3的增長(zhǎng)速率明顯快于R1和R2,但相比于菌體衰減理論COD值,3者混培物上清液中增加的SCOD均可忽略不計(jì),增加的最大SCOD值也僅為菌體衰減理論COD值的0.24%,進(jìn)一步證明饑餓情況下活菌會(huì)利用死亡菌體水解產(chǎn)物的推測(cè)是正確的.由圖3(b)可知,R1、R2和R3的SV30值下降速率均是先快后慢,但隨保藏時(shí)間的延長(zhǎng)3者間的變化差異不大,且在試驗(yàn)期間SV30值沒有像實(shí)驗(yàn)室溫度保藏試驗(yàn)[17]一樣最終趨于穩(wěn)定.

圖3 SCOD和SV30值隨時(shí)間的變化Fig.3 The change of SCOD and SV30during preservation

2.2.3 硝化產(chǎn)物對(duì)形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 保藏過程中,硝化細(xì)菌混培物顏色和菌群結(jié)構(gòu)均發(fā)生了明顯變化.由圖4可知,各方法下的混培物顏色隨保藏時(shí)間的延長(zhǎng)均從下至上逐漸變黑,但不同方法間又有一些差異.R1和R2中的混培物保藏60d后出現(xiàn)混培物上浮現(xiàn)象,且可見明顯的氣泡,但隨著保藏時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)此現(xiàn)象又消失,而 R3中自始至終都無此現(xiàn)象;另外,保藏過程中 R1和R2的混培物顏色變化速率相比于 R3來說是先慢后快.測(cè)定混培物中的硫化物含量發(fā)現(xiàn),混培物中的硫化物含量與顏色變化成正相關(guān).這主要是因試驗(yàn)用硝化細(xì)菌混培物中含有部分反硝化細(xì)菌,其可以以死亡菌體產(chǎn)生的有機(jī)物為電子供體,以加入或產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮為電子受體發(fā)生反硝化反應(yīng),而隨硝化產(chǎn)物的逐漸減少反硝化作用會(huì)慢慢減弱.缺氧環(huán)境中,某些氨氧化細(xì)菌可利用反硝化作用產(chǎn)生的NO或NO2取代氨氧化過程中氧氣的常規(guī)電子受體地位而發(fā)生厭氧氨氧化反應(yīng),從而減少了硝化細(xì)菌對(duì) O2的需求,降低了硫酸鹽被還原的速度,所以硝化細(xì)菌混培物保藏初期加有硝化產(chǎn)物的混培物顏色變化較不加硝化產(chǎn)物要慢,而當(dāng)反硝化作用減弱時(shí)混培物顏色變化速率加快并最終與不加硝化產(chǎn)物趨于一致.

從圖5可以看出,與保藏前相比,R2和R3中的絲狀菌比例增加,絮體結(jié)構(gòu)變得松散,而 R1中的絲狀菌不但沒有增加反而有下降的趨勢(shì),絮體結(jié)構(gòu)更加緊密.表明硝化細(xì)菌混培物的饑餓保藏過程中加入亞硝態(tài)氮可以保持球菌的優(yōu)勢(shì)地位.

圖4 混培物顏色隨保藏時(shí)間的變化Fig.4 The change of color during preservation

圖5 保藏過程中混培物結(jié)構(gòu)的變化的掃描電鏡圖像Fig.5 SEM graph of change of mixed culture structure

3 結(jié)論

3.1 在硝化細(xì)菌混培物饑餓保藏過程中,亞硝態(tài)氮可明顯降低硝化活性的衰減速率.4℃加5mmol/L亞硝態(tài)氮、4℃加5mmol/L硝態(tài)氮、4℃3種保藏方法的硝化活性衰減速率分別為0.010d-1、0.020d-1、0.021d-1,半衰期分別為72.3、33.9、32.7d.

3.2 在硝化細(xì)菌混培物饑餓保藏過程中,總菌體量用作硝化活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)會(huì)產(chǎn)生虛高現(xiàn)象.活性趨于穩(wěn)定時(shí),采用4℃加5mmol/L亞硝態(tài)氮、4℃加5mmol/L硝態(tài)氮、4℃ 3種方法保藏的硝化細(xì)菌混培物活性保留率分別為18.7%、19.1%、15.1%,總菌體量保留率分別為 62.0%、47.3%和58.7%.

3.3 在硝化細(xì)菌混培物饑餓保藏過程中,混培物血紅素c含量和ATP含量可用于定性表征硝化活性.4℃加 5mmol/L亞硝態(tài)氮、4℃加5mmol/L硝態(tài)氮、4℃ 3種保藏方法的血紅素c和ATP含量均隨硝化活性的衰減而下降.

3.4 在硝化細(xì)菌混培物饑餓保藏過程中,硝化產(chǎn)物可減慢混培物變黑速度.保藏前期,4℃加5mmol/L亞硝態(tài)氮和4℃加5mmol/L硝態(tài)氮兩方法的硫化物生成速度慢于4℃方法.

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Influence of nitration product on the preservation characteristics of mixed nitrifying culture.

WANG Cai-hua1,2, ZHENG Ping1*, HU An-hui1(1.Department of Environmental Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China；2.Beijing Tiandiren Environment and Technology Corporation limited, Beijing 100176, China). China Environmental Science, 2011,31(10)：1663～1668

Influence of nitration product on the preservation characteristics of mixed nitrifying culture was studied. Nitrite could decrease the decay rate of nitrifying activity, and also improve the other characteristics during the starvation period. Under the anaerobic conditions of 4℃ with 5mmol/L nitrite, 4 ℃ with 5mmol/L nitrate and 4℃, the decay rate of nitrifying activity was 0.010/d, 0.020/d and 0.021/d, and the half-life was 72.3, 33.9 and 32.7d, respectively. After 5months’ preservation, the relative activity survival and relative biomass survival were 18.7%, 19.1%, 15.1%, and 62.0%, 47.3%, 58.7%, respectively. With storage time prolonging and the activity decayed, the heme c and ATP contents decreased, and the mixed nitrifying culture changed to black gradually.

mixed nitrifying culture；nitration product；preservation characteristics

X 703.1

A

1000-6923(2011)10-1663-06

2011-01-22

國家“863”項(xiàng)目(2009AA06Z311);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30770039)

* 責(zé)任作者, 教授, pzheng@zju.edu.cn

汪彩華(1983-),女,安徽省安慶市人,浙江大學(xué)環(huán)境工程系碩士研究生,主要從事廢水生物處理方面的研究.發(fā)表論文4篇.