胡健饒，章麗梅，史雨紅，陳 炯

（1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310036；2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江寧波 315211）

胡健饒1，章麗梅1，史雨紅2，陳 炯2

（1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310036；2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江寧波 315211）

該研究從寧波市象山港魚養(yǎng)殖區(qū)患病魚腎臟中分離到1株優(yōu)勢(shì)菌Mm041，人工回感試驗(yàn)確定該菌株為致病菌株，測(cè)定其對(duì)魚的半致死量為3.0×106CFU.通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征鑒定，并結(jié)合細(xì)菌16SrRNA基因序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定Mm041為美人魚發(fā)光桿菌.藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)氯霉素、羧芐青霉素、頭孢哌酮（先鋒必）高度敏感.

魚；美人魚發(fā)光桿菌；鑒定

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌EscherichiacoliTG1由該試驗(yàn)保存，T4DNA連接酶、pMD19－T Simple Vector和Ex Taq DNA聚合酶均購(gòu)自Takara公司，Gel Extraction Kit購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，Plasmid MiniKit購(gòu)自O(shè)mega公司.細(xì)菌鑒定管和藥敏紙片購(gòu)自杭州天河微生物試劑有限公司.引物合成及測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成.

1.2 病原菌的分離

1.3 病原菌的人工回感試驗(yàn)和半致死量測(cè)定

將菌株Mm041接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于28℃過(guò)夜培養(yǎng)，用0.9%的滅菌生理鹽水洗滌菌體，經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)法確定菌懸液濃度為3.0×109CFU/mL，10倍梯度稀釋后備用.試驗(yàn)共分6個(gè)組（5個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組），每組12尾魚，試驗(yàn)水溫為（20±1）℃.馴養(yǎng)7d后，試驗(yàn)組每尾魚分別腹腔注射0.1mL10倍梯度稀釋的菌懸液，對(duì)照組每尾腹腔注射等劑量的滅菌生理鹽水.注射后每日觀察試驗(yàn)魚的發(fā)病癥狀和死亡情況，并對(duì)死亡魚體進(jìn)行解剖和病原菌的再分離.采用Aliu和Nwude［2］改進(jìn)的寇氏法計(jì)算Mm041在20℃左右時(shí)對(duì)平均體重約150g魚的半致死量：lgLD50＝Xk－d（∑Pi－0.5），其中Xk為最大劑量對(duì)數(shù)，d為相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量之差數(shù)，Pi為死亡率，i為組號(hào).

1.4 病原菌體形態(tài)觀察

觀察菌株Mm041在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和TCBS平板上菌落的形態(tài)特征，并取純培養(yǎng)物制備相應(yīng)的涂片，革蘭氏染色后于普通光鏡下觀察菌體的形態(tài)和大小.對(duì)Mm041進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染，晾干后，透射電鏡觀察其個(gè)體形態(tài)、大小和鞭毛結(jié)構(gòu)等.

1.5 生理生化特征鑒定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［3］和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》［4］中的形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo)，對(duì)分離菌株Mm041進(jìn)行鑒定.

1.6 16S rRNA基因的擴(kuò)增、測(cè)序和分析

1.6.1 基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用已報(bào)道的細(xì)菌16SrRNA基因通用擴(kuò)增引物［5］進(jìn)行PCR擴(kuò)增.采用Wilson［6］所描述的方法提取分離菌株的基因組DNA.PCR反應(yīng)體系為：基因組DNA 0.5μL，10×Ex Taq PCR緩沖液（含MgCl2）2.5μL，dNTP混合物（各2.5mol/L）2μL，上下游引物（10pmol/L）各1μL和Ex Taq DNA聚合酶1 U，補(bǔ)充滅菌水至總體積25μL.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min.

1.6.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測(cè)序

1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收目的條帶后，將純化后的PCR產(chǎn)物克隆至pMD19－－T Simple Vector，并轉(zhuǎn)化E.coliTG1，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后抽提質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增鑒定獲得陽(yáng)性克隆.陽(yáng)性克隆送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序.

1.6.3 序列分析

將獲得的16SrRNA基因序列進(jìn)行BLAST分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/），選取10株與Mm041同源性相似的細(xì)菌16SrRNA基因序列，采用ClustalW軟件（http：//clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）對(duì)Mm041與10株細(xì)菌16SrRNA基因序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，采用MEGA 4.0軟件（Neighborjoining法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹.

1.7 藥物敏感性試驗(yàn)

取100μL Mm041菌懸液（3×109CFU/mL）涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，用滅菌鑷子分別取藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，28℃恒溫培養(yǎng)16～18h，測(cè)定抑菌圈直徑大小，根據(jù)說(shuō)明書標(biāo)準(zhǔn)判斷Mm041對(duì)各類抗生素的敏感性和抗藥性.

2 結(jié) 果

2.1 分離菌株的致病性

2.2 菌體的形態(tài)及生理生化特征

供試純培養(yǎng)菌菌株Mm041的形態(tài)特征為革蘭氏陰性，在鏡下可見(jiàn)菌體粗短、兩端鈍圓、呈桿狀、多單個(gè)散在和個(gè)別成雙排列的革蘭氏陰性菌.大小多在（0.6～1.0）×（1.0～2.0）μm的桿菌（見(jiàn)圖1）.可運(yùn)動(dòng)，經(jīng)透射電鏡觀察，絕大多數(shù)菌體具一根長(zhǎng)的極生單鞭毛（見(jiàn)圖1）.將Mm041在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上28℃培養(yǎng)24h后，菌落呈圓形，半透明，直徑約1.5mm，邊緣整齊，中央隆起，表面光滑濕潤(rùn).在TCBS瓊脂平板上能生長(zhǎng)，菌落呈綠色，菌落圓形光滑、邊緣整齊、較隆起.

生理生化特征鑒定結(jié)果見(jiàn)表1.Mm041為氧化酶、接觸酶、脲酶等陽(yáng)性；V－P試驗(yàn)和靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性、鳥氨酸脫羧酶陰性；利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖等，且發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；對(duì)弧菌抑制劑O/129（2，4－二氨基－6，7－二異丙基喋啶磷酸鹽）（150μg或10μg）敏感.參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［3］和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》［4］，菌株Mm041生化特征與美人魚發(fā)光桿菌最為接近.

圖1 菌株Mm041的透射電鏡照片（15000 x）Fig.1 The transmission electron microscope image of the strain Mm041（15000x）

表1 Mm041分離菌的理化特性Tab.1 Physiological and chemical characteristics of the isolated strain Mm041

2.3 細(xì)菌16SrDNA擴(kuò)增及序列分析

以菌株Mm041的基因組DNA為模板，采用已報(bào)道的細(xì)菌16SrRNA基因通用擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段克隆后測(cè)序，其16SrRNA基因序列EMBL登錄號(hào)為FR687000.

細(xì)菌16SrRNA基因核苷酸序列比較分析表明，Mm041與美人魚發(fā)光桿菌核苷酸序列同源性最高，為98.8%～99.6%，與其它發(fā)光桿菌屬成員同源性分別為94.7%～96.8%，與弧菌屬成員為92.4%～95.1%.16SrRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，Mm041與美人魚發(fā)光桿菌系統(tǒng)進(jìn)化相關(guān)性最高，與同屬的其它成員進(jìn)化相關(guān)性次之，與同科的弧菌屬成員進(jìn)化相關(guān)性較遠(yuǎn)，但與同屬其他成員進(jìn)化相關(guān)性較遠(yuǎn)（圖2），說(shuō)明菌株Mm041為美人魚發(fā)光桿菌（即原弧菌屬的美人魚弧菌）的一個(gè)分離物.

圖2 基于部分弧菌科成員16SrRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by the nucleotide sequences of 16SrRNA genes from some bacterias of Vibrionaceae

2.4 藥物敏感性

在所測(cè)試的10種抗菌藥物中，Mm041對(duì)新生霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素（氨芐西林）、青霉素G、先鋒霉素V（頭孢唑啉）等5種藥物均具有耐藥性，對(duì)鏈霉素和丁胺卡那霉素中毒敏感，而對(duì)氯霉素、羧芐青霉素、頭孢哌酮（先鋒必）高度敏感.

3 討 論

美人魚發(fā)光桿菌包括美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種（P.damselaesubsp.damselae）（即原來(lái)的美人魚弧菌）和美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種（P.damselaesubsp.piscicida）兩個(gè)亞種.廣泛存在于海水及海產(chǎn)動(dòng)物中.1981年Love等［7］首次從患皮膚潰瘍病的少女魚病灶處分離到了美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種，即海魚弧菌.目前，已報(bào)道美人魚發(fā)光桿菌感染皮革龜（Dermochelyscoriacea，leatherback turtles）［8］、樽鼻海豚（Tursiopstruncates，bottlenose dolphins）［9］、五條（Seriolaquinqueradiata，yellowtail）［10］、金頭鯛（Sparusaurata，gilthead sea bream）［11］、大菱鲆（Scophthalmusmaximus，turbot）［12］、澳洲龍魚（Lates calcarifer，barramundi）［13］等.此外，從患病蝦、蟹和鱉中也分離到美人魚發(fā)光桿菌［14－16］.可以引起多種海水魚的敗血病，也可以感染人體，能致人傷口感染，引起感染性腹瀉［17］.

文章綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析，表明分離到的Mm041菌株為美人魚發(fā)光桿菌的一個(gè)分離物，進(jìn)一步證明了美人魚發(fā)光桿菌具有廣泛的致病性.此外，該分離物對(duì)新生霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素（氨芐西林）、青霉素G和先鋒霉素V（頭孢唑啉）耐藥，而對(duì)氯霉素、羧芐青霉素和頭孢哌酮（先鋒必）高度敏感，與其他作者分離到的美人魚發(fā)光桿菌藥敏感性略有差異［16，18］，這可能由于養(yǎng)殖戶頻繁使用各類抗生素，導(dǎo)致細(xì)菌變異對(duì)部分藥物產(chǎn)生耐藥性.因此在用藥進(jìn)行病害防治時(shí)，最好能對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)后再選擇合適藥物進(jìn)行治療.

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Isolation and Identification of A Pathogenic Bacterium Causing Ulcer Disease of Miiuy Croaker（MiichthysMiiuy）

HU Jian－rao1，ZHANG Li－mei1，SHI Yu－h(huán)ong2，CHEN Jiong2

（1.College of Life and Environment Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China；
2.Ministry of Education Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

The experment islated，a dominant bacterial species，termed as Mm041from the kidney of a diseased miiuy croaker（Miichthysmiiuy）.By artificial infection tests，Mm041was characterized to be the pathogenic bacterium causing ulcer disease of miiuy croaker，and its LD50was 3.0×106CFU.Based on the biological characteristics and 16srRNA sequence analysis，Mm041was classified as an isolate ofPhotobacteriumdamselae.The result of the antibiotic sensitivity test show that Mm041is highly sensitive to chloramphenicol，carbenicillin and cefoperazone.

Miichthysmiiuy；Photobacteriumdamselae；identification

S943

A

1674－232X（2011）05－0444－05

10.3969/j.issn.1674－232X.2011.05.011

2010－03－20

浙江省科技廳科研計(jì)劃項(xiàng)目（2009C32059；2010C32090）.

胡健饒（1967—），男，浙江蕭山人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物生理學(xué)研究.E－mail：hujianrao＠126.com