楊 輝, 黃 原

(陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710062)

鄭氏比蜢線粒體基因組全序列的測(cè)定與分析

楊 輝, 黃 原?

(陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710062)

采用長(zhǎng)距PCR 擴(kuò)增及保守引物步移法測(cè)定并注釋了鄭氏比蜢(Pielomastax zhengi)的線粒體基因組全序列。鄭氏比蜢的線粒體基因組全長(zhǎng)15 602 bp, A+T 含量為71.8%, 37個(gè)基因位置與飛蝗的一致, 基因間隔序列共計(jì)10處47 bp, 間隔長(zhǎng)度從1～20 bp不等; 有14對(duì)基因間存在52 bp重疊, 重疊堿基數(shù)在1～8 bp之間。蛋白質(zhì)基因的起始密碼子均為昆蟲典型的起始密碼子ATN。ND5 基因使用了不完全終止密碼子T, 其余基因均為典型的TAA或TAG。除 tRNASer(AGN)的 DHU 臂缺失外, 其余21個(gè)tRNA 基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)均屬典型的三葉草結(jié)構(gòu), 但在鄭氏比蜢中有5個(gè)tRNA(tRNACys、tRNALys、 tRNAPhe、 tRNAProtRNAArg)基因變異較大, 無(wú)法采用常規(guī)算法預(yù)測(cè)出來(lái), 表現(xiàn)在這5個(gè)tRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的TψC臂僅有3～4對(duì)配對(duì)堿基, tRNALys和tRNAArg的反密碼臂僅有4對(duì)配對(duì)堿基。預(yù)測(cè)的 lrRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)總共有 6 個(gè)結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域Ⅲ缺失), 44 個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。預(yù)測(cè)的 srRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含3 個(gè)結(jié)構(gòu)域, 30 個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。比較鄭氏比蜢、西藏飛蝗(Locusta migratoria tibetensis)和疑鉤額螽(Ruspolia dubia)rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)后，發(fā)現(xiàn)鄭氏比蜢與西藏飛蝗的更相似。A+T 豐富區(qū)中存在一個(gè)被認(rèn)為與復(fù)制及轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的 Ploy(T)結(jié)構(gòu)。

蜢總科; 鄭氏比蜢; 線粒體基因組; RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

后生動(dòng)物線粒體基因組通常是編碼 37個(gè)基因(13個(gè)蛋白質(zhì)基因、22個(gè)tRNA基因及2個(gè)rRNA基因)和1個(gè)控制區(qū)(也稱A+T豐富區(qū))的細(xì)胞器基因組(Wolstenholme, 1992; Ding et al, 2007)。線粒體DNA具有多拷貝數(shù)、母系遺傳、突變率高、極少發(fā)生重組等特性, 已被廣泛地運(yùn)用于分子進(jìn)化、系統(tǒng)地理學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等方面的研究(William et al,2001)。根據(jù) NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/ORGANELLES/mztax_short.html)的統(tǒng)計(jì), 截至2010年 11月, 已測(cè)出全線粒體基因組的昆蟲綱種類有223種, 其中直翅目昆蟲34種。由于測(cè)序的類群相對(duì)較少, 所選物種的特殊進(jìn)化模式及系統(tǒng)樹中可能的長(zhǎng)枝吸引等問題, 利用線粒體基因組數(shù)據(jù)推斷直翅目系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化地位還存在一定的困難(Gao et al, 2009)。另外, 已測(cè)的34種直翅目昆蟲大部分是螽斯總科和蝗總科的, 還缺乏蜢總科的代表種類, 因而增加這些類群中有關(guān)線粒體基因組全序列數(shù)據(jù)將有利于建立比較穩(wěn)健的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

鄭氏比蜢(Pielomastax zhengi)屬于直翅目蜢總科(Eumastacoidea)枕蜢科(Episactidae)。蜢總科是一類較罕見而又原始的小型昆蟲, 其中一些種類還被認(rèn)為是第三紀(jì)的孑遺種類。它們的大多數(shù)種類生活在熱帶和亞熱帶的灌木叢或林區(qū)內(nèi)(Huang et al,2009)。本文測(cè)定并注釋了鄭氏比蜢線粒體基因組全序列, 并對(duì)其編碼的22個(gè)tRNA和大小亞基rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)做了預(yù)測(cè)和分析, 以期為直翅目昆蟲線粒體譜系基因組學(xué)提供新的數(shù)據(jù)資料。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本采集及總DNA的提取

鄭氏比蜢標(biāo)本于2009年8月采集于河南內(nèi)鄉(xiāng)縣寶天曼自然保護(hù)區(qū), 保存于無(wú)水乙醇。總DNA采用酚-氯仿抽提法：將后足股節(jié)肌肉置于 600 μL 勻漿緩沖液(0.01 mol/L Tris, pH 7.8; 5 mmol/L EDTA,5% SDS, 50 ng proteinase K/μL)中研磨, 65 ℃水浴消化 3～5 h。用平衡酚(pH 7.6～7.8)提純2次, 再用 CI(氯仿∶異戊醇=24∶1)提純一次。最后用?20 ℃預(yù)冷的 100%乙醇沉淀和 70%乙醇洗滌總DNA, 保存于?20 ℃。

1.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

本研究所采取的測(cè)序策略是長(zhǎng) PCR產(chǎn)物步移法測(cè)序, 如有測(cè)序效果不佳或不能夠測(cè)通的區(qū)域,再做 sub-PCR來(lái)補(bǔ)齊缺口。首先, 通過四對(duì)長(zhǎng)距PCR(L-PCR)引物將線粒體基因組擴(kuò)增為 4條相互重疊的片段(片段A、A2、B1和B2), 4個(gè)片段的上下游引物序列見表1(Liu et al, 2006), 長(zhǎng)距PCR反應(yīng)體系的總體積是 15 μL, 包括 10×反應(yīng)緩沖液 1.5 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、2.5mmol/L dNTPs 3 μL,10 μmol/L 上、下游引物各 2μL、5 U/μL LA-TaqDNA聚合酶0.15～0.35 μL、總DNA為模板1 μL。然后,加ddH2O至終體積15 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)條件如下：93 ℃預(yù)變性 2 min→(92 ℃10 s, 48 ℃ 30 s, 68 ℃8 min)共 15 個(gè)循環(huán)→(92 ℃ 10 s, 48 ℃30 s, 68 ℃8 min +20 s)共 15個(gè)循環(huán)→68 ℃ 7 min→4 ℃保存。其次, 用 12對(duì)保守引物以片段 A、A1、B1和 B2為模板再擴(kuò)增320～3 175 bp的短片段, 具體信息見表2 (Simon et al, 2006)。短片段擴(kuò)增體系總體積為25 μL, 包括 10×反應(yīng)緩沖液 2.5 μL、25 mmol/L MgCl23 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL, 10 μmol/L 上、下游引物各4 μL、5 U/μL TaqDNA聚合酶0.15～0.35 μL和長(zhǎng)片段產(chǎn)物(作為DNA模板)1 μL。然后,加ddH2O至終體積25 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)? 94 ℃2 min→(94℃×30 s＋38～55 ℃×30 s＋72 ℃×1 min)共 30 個(gè)循環(huán)→72 ℃×7 min→4 ℃ forever。最后, 通過12條sub-PCR產(chǎn)物測(cè)序?qū)⑷笨谘a(bǔ)齊, 使基因組連接成環(huán)。

表1 長(zhǎng)PCR擴(kuò)增引物序列Tab. 1 Primer sequences for long PCR amplication

表2 補(bǔ)充擴(kuò)增片段的引物對(duì)Tab. 2 The partial pair primers for the mitogenome complement fragment amplification

1.3 序列拼接、注釋和分析

使用Staden Package 1.7 (Bonfield et al, 1995)進(jìn)行序列拼接和注釋, 通過與威廉劍角蝗Acrida_willemsei(NC_011303)線粒體 DNA序列進(jìn)行比對(duì)確定蛋白質(zhì)基因、tRNA基因和rRNA基因的位置,使用 MEGA 4.0 統(tǒng)計(jì)線粒體基因組堿基組成、蛋白質(zhì)基因密碼子使用頻率等。使用 tRNAScan-SE ver.1.21進(jìn)行 tRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。參考已發(fā)表的李氏大足蝗 srRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和 lrRNA二級(jí)結(jié)構(gòu),對(duì)鄭氏比蜢線粒體基因組 srRNA和lrRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(Gao et al, 2009)。

2 結(jié) 果

2.1 線粒體基因組組成與基因排列

鄭氏比蜢線粒體基因組序列已提交到GenBank,登錄號(hào)為JF411955。本研究共測(cè)得41條可用序列,拼接后的序列總長(zhǎng)度為 1 5618 bp, 序列覆蓋度1.98倍, 除去兩端重疊序列得到鄭氏比蜢線粒體基因組的總長(zhǎng)度為 1 5602 bp。它由13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(protein-coding genes, PCGs)、22 個(gè) tRNA 基因、2 個(gè) rRNA 基因(lrRNA 和 srRNA)組成, 基因排列順序(圖 1)與蝗總科昆蟲的排列順序相同, 也存在tRNAAsp(D)和tRNALys(K)的倒置現(xiàn)象(Huang et al, 2010)。 基因排列非常緊密, 存在 14 處共 52 bp的基因重疊, 重疊區(qū)長(zhǎng)度 1～8 bp 不等; 基因間隔序列總長(zhǎng)度為47 bp, 共計(jì)10 處, 大小 1～20 bp之間, 基因間隔最大的在 tRNALys與 ATP8之間和ND5與 tRNAHis之間, 分別是 20 bp和10 bp; 既沒有重疊, 也沒有間隔的基因?qū)灿?jì) 4 處。其中tRNAGln、tRNACys、tRNATyr、tRNAPhe、tRNAHis、tRNAPro、tRNALeu、tRNAVal和 ND1、ND4、ND4L、ND5 以及16s rRNA、12srRNA基因位于N鏈上, 其余23 個(gè)基因位于J 鏈上, 具體信息見表3。

圖1 鄭氏比蜢線粒體基因組結(jié)構(gòu)Fig. 1 The map of the Pielomastax zhengi mitogenome

2.2 線粒體基因組的堿基組成及密碼子使用

鄭氏比蜢線粒體基因組的堿基組成具有很強(qiáng)的AT 偏向性, 在4種堿基中, A含量最多, G含量最少。J鏈的堿基含量為: A(39.4%) ＞ T(32.4%) ＞C(15.6) ＞ G(12.6%), AT(71.8%)遠(yuǎn)大于 CG(28.2%),這種現(xiàn)象普遍存在于蛋白質(zhì)基因、tRNA和 rRNA基因, 尤其在A+ T 富集區(qū)。鄭氏比蜢的13個(gè)蛋白質(zhì)基因最常用的起始密碼子是 ATG, 其次是 ATC和 ATT。除COⅢ、ND3、CytB和ND1以TAG作為終止密碼子, ND5的終止密碼子為不完全的T外,其 8個(gè)蛋白質(zhì)基因的終止密碼子都為完整的 TAA,具體信息見表 3。鄭氏比蜢線粒體基因組兩條鏈上編碼的蛋白質(zhì)密碼子使用情況存在差異, 即 J 鏈編碼基因偏向于使用第3位點(diǎn)為A的密碼子, 而N鏈偏向于使用第3位點(diǎn)為U的密碼子。

表3 鄭氏比蜢線粒體基因組組成Tab. 3 Gene organization of the Pielomastax zhengi mitochondrial genome

2.3 tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

鄭氏比蜢線粒體基因組有 22種 tRNA, 其中14種位于重鏈上, 8種位于輕鏈上。用 tRNAScan-SE 1.21 預(yù)測(cè)出鄭氏比蜢16個(gè) tRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu),其余 6 個(gè) tRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)是通過與威廉劍角蝗Acrida willemsei(NC_011303)比對(duì)確定其在整個(gè)基因組上的位置后繪出。在所預(yù)測(cè)的22 種tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中總共出現(xiàn)了37處錯(cuò)配, 其中有32對(duì)為GU錯(cuò)配; 其余 5對(duì)錯(cuò)配中：2對(duì) UU 錯(cuò)配發(fā)生在tRNAAla和 tRNAPhe的氨基酸接受臂和反密碼子臂;1對(duì)AC錯(cuò)配發(fā)生在tRNAMet的氨基酸接受臂; 1對(duì)AA錯(cuò)配發(fā)生在tRNALys的氨基酸接受臂; 1對(duì) UC錯(cuò)配發(fā)生在 tRNAPro的氨基酸接受臂。除了tRNAAsp、tRNAVal和tRNASerAGN(S)的反密碼環(huán)是9個(gè)堿基外, 其余的反密碼環(huán)均為7個(gè)堿基(圖2)。

圖2 鄭氏比蜢線粒體基因組tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 2 The tRNA secondary structures of the Pielomastax zhengi mitogenome

2.4 rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

鄭氏比蜢線粒體基因組的lrRNA和srRNA分別位于tRNALeu(L-CUN)和tRNAVal(V), 以及tRNAVal(V)和D-loop之間, 其長(zhǎng)度分別是1 301 bp和795 bp。兩個(gè)rRNA 基因的A+T含量為75.2%, 高于整個(gè)基因組的平均A+T含量(71.8%), G含量(15.1%)是C含量(9.8%)的近兩倍。以短額負(fù)蝗和西藏飛蝗的lrRNA和srRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)對(duì)鄭氏比蜢的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示, 鄭氏比蜢 lrRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)總共有6個(gè)結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域Ⅲ缺失)和44個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。srRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域和30個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖2)。鄭氏比蜢的lrRNA和srRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與短額負(fù)蝗和西藏飛蝗基本相似, 只在少數(shù)位置存在差異。

2.5 A+T豐富區(qū)

鄭氏比蜢的 A+T豐富區(qū)位于 srRNA與tRNAIle(I)之間, 全長(zhǎng) 839 bp, A+T 含量為 82.1%,明顯高于全基因組的平均水平(71.8%)。在鄭氏比蜢的A+T豐富區(qū)發(fā)現(xiàn)一段 Poly(T)(T stretch), 且能形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖4)。

3 討 論

3.1 基因排列順序

圖3 鄭氏比蜢rRNA(lrRNA和 srRNA)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 3 The secondary structures of mitochondrial rRNAs (lrRNA and srRNA)of Pielomastax zhengi

圖4 A+T富集區(qū)Poly(T)及附近序列所形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)Fig. 4 Stem-loop structure at the poly- T stretch in the A+T rich region of Pielomastax zhengi mitogenome

在直翅目昆蟲線粒體基因組的研究中發(fā)現(xiàn)蝗亞目的蝗總科、蚤螻總科和蚱總科基因排列次序相同, 都發(fā)生了 KD 倒置現(xiàn)象, 即 tRNAAsp(D)排在tRNALys(K)基因上游(DK 排列) (Ballard & Dean,2001)。蜢總科的變色烏蜢為 KD 排列, 與蝗亞目其他總科不同, 而與多數(shù)螽亞目昆蟲的排序方式相同(Huang et al, 2010)。然而, 本研究所測(cè)得鄭氏比蜢的基因排列順序仍然與蝗總科的排列順序相同,即也發(fā)生了KD 倒置現(xiàn)象, 形成這種排列方式的原因是由于DK這二個(gè)基因所對(duì)應(yīng)的 DNA片段發(fā)生了倒置。目前關(guān)于 DNA片段倒置產(chǎn)生的原理, 最有說(shuō)服力的是Mark和Nick的觀點(diǎn), 即雙鏈斷裂和重新結(jié)合模型(Zhong et al, 2005; Ye et al, 2008)。關(guān)于蜢總科昆蟲的線粒體基因組排列順序有三種可能：(1)大部分蜢總科線粒體基因組排列順序與蝗亞目的相同; (2)大部分蜢總科線粒體基因組排列順序與螽亞目的相同; (3)蜢總科昆蟲的線粒體基因組排列順序是隨機(jī)的。蜢總科昆蟲線粒體基因組排列究竟屬于那種可能, 還有待研究更多蜢總科物種的線粒體基因組進(jìn)一步證實(shí), 但偏向第一種情況的可能性更大, 因?yàn)轵炜偪评ハx無(wú)論從形態(tài)上分類還是從分子系統(tǒng)上劃分都表明與蝗亞目昆蟲的親緣關(guān)系更近。

3.2 tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖5 鄭氏比蜢、西藏飛蝗和疑鉤額螽rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較Fig. 5 The comparison of rRNA secondary structures among Pielomastax zhengi, Locusta migratoria tibetensis and Ruspolia dubia

大部分直翅目昆蟲線粒體基因組通過 tRNAScan-SE 1.21可以預(yù)測(cè)出20個(gè)tRNA基因。本研究的鄭氏比蜢只能預(yù)測(cè)出16個(gè)tRNA基因, 除了在大部分直翅目昆蟲都不能預(yù)測(cè)出來(lái)的 tRNAser(UCN)以外,還有5個(gè)tRNA 基因沒有預(yù)測(cè)出來(lái)。通過比較分析發(fā)現(xiàn), 除了 tRNAser(UCN)不具有典型的三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)外, 鄭氏比蜢其余的5個(gè)tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)雖然具有典型的二級(jí)結(jié)構(gòu), 但是也存在一些差異, 即典型的三葉草結(jié)構(gòu)的T￠C臂有5對(duì)配對(duì)堿基, 而這5個(gè)tRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的T￠C臂只有3～4對(duì)配對(duì)堿基; 另外, tRNALys和tRNAArg的反密碼臂只有4對(duì)配對(duì)堿基。這些結(jié)構(gòu)特征可能是導(dǎo)致5個(gè)tRNA基因沒能預(yù)測(cè)出來(lái)的原因。另外, 預(yù)測(cè)的 22種tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中總共出現(xiàn)了 37處錯(cuò)配, 其中 32對(duì)為GU錯(cuò)配。有人認(rèn)為線粒體基因組tRNA基因的部分錯(cuò)配可以通過 RNA編輯校正, 不會(huì)引起氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)上的障礙(Yokobori ＆ P??bo, 1995; Dang et al, 2008)。

3.3 rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)模型對(duì)于理解核苷酸的替換模式和評(píng)估 rRNA系統(tǒng)發(fā)育信息的可靠性非常重要(Shi et al, 2008)。預(yù)測(cè)的鄭氏比蜢 lrRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)總共有 6 個(gè)結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域Ⅲ缺失)和44 個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖2 B); srRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含 3 個(gè)結(jié)構(gòu)域和30 個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖2 A)。lrRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域IV和V比較保守, srRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域I和II變異比較大。本文將鄭氏比蜢的rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與蝗亞目西藏飛蝗的rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和螽亞目疑鉤額螽的rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)(Zhou et al, 2007; Jiang, 2010)進(jìn)行了比較, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們lrRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有四處存在明顯差異(圖3), srRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有6處存在明顯差異。由此可見lrRNA要比srRNA更保守一些。另外, 通過它們r(jià)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較發(fā)現(xiàn),鄭氏比蜢rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與疑鉤額螽rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的差異明顯大于鄭氏比蜢rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與西藏飛蝗rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的差異(圖5)。因而,鄭氏比蜢與西藏飛蝗的親緣關(guān)系可能更近, 也就是與蝗亞目昆蟲的親緣關(guān)系更近。

3.4 A+T富集區(qū)

目前對(duì) A+T 富集區(qū)域的研究關(guān)注主要集中于所包含的復(fù)制相關(guān)的調(diào)控信息?，F(xiàn)在公認(rèn)的是昆蟲的線粒體 N鏈的復(fù)制起點(diǎn)(ON)位于控制區(qū)內(nèi), J鏈的復(fù)制則是在輕鏈的復(fù)制完成97%之后才開始, 即認(rèn)為OJ(J 鏈的復(fù)制起點(diǎn))位于距離ON97% mtDNA長(zhǎng)度的位置上(Goddard & Wolstenholme, 1978; Saito et al, 2005)。Saito et al(2005)以果蠅為主要研究對(duì)象,同時(shí)也對(duì)10個(gè)目的20種昆蟲的A+T富集區(qū)進(jìn)行了研究。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 前期的相關(guān)研究認(rèn)為, 由于ON位于控制區(qū)內(nèi), 加之其上游的一段 Poly(T)結(jié)構(gòu),它可能與復(fù)制起點(diǎn)的識(shí)別有關(guān)(ye et al, 2008)。本研究所分析的鄭氏比蜢 A+T 富集區(qū)也有那樣一段Poly(T)結(jié)構(gòu), 應(yīng)該也與復(fù)制起點(diǎn)的識(shí)別有關(guān)。

Ballard JWO, Dean MD. 2001. The mitochondrial genome: mutation,selection and recombination[J].Curr Opin Genet Dev, 11: 667-672.

Bonfield JK, Smith KF, Staden R. 1995. A new DNA sequence assembly program [J].Nucleic Acids Res, 24: 4992-4999.

Dang JP, Liu N, Ye W, Huang Y. 2008. Complete mitochondrial genome sequence ofGastrimargus marmoratus(Thunberg) (Orthoptera :Acridoidea) [J].Acta Entomol Sin, 51(7): 671-680. [黨江鵬, 劉 念,葉 偉, 黃 原. 2008. 云斑車蝗線粒體基因組全序列測(cè)定與分析.昆蟲學(xué)報(bào), 51(7): 671-680.]

Ding FM, Shi HW, Huang Y. 2007. Complete mitochondrial genome and secondary structures of lrRNA and srRNA ofAtractomorpha sinensis(Orthoptera, Pyrgomorphidae) [J].Zool Res, 28(6): 580-588. [丁方美,師紅雯, 黃 原. 2007. 短額負(fù)蝗線粒體基因組及其 lrRNA 和srRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析. 動(dòng)物學(xué)研究, 28(6): 580-588]

Gao J, Cheng CH, Huang Y. 2009. Analysis of complete mitochondrial genome sequence ofAeropus licentiChang [J].Zool Res, 30(6):603-612. [高佳, 程春花, 黃原. 2009. 李氏大足蝗線粒體全基因組序列分析. 動(dòng)物學(xué)研究, 30(6):603-612].

Goddard JM, Wolstenholme DR. 1978. Origin and direction of replication in mitochondrial DNA molecules fromDrosophila melanogaster[J].Proc Natl Acad Sci USA, 75(8): 3886-3890.

Huang Y, Liu N, Lu HM, 2010. Research progress in mitochondrial genomes of the Orthoptera insects [J].Acta Entomol Sin, 53(5) :581-586. [黃原, 劉念, 盧慧甍. 直翅目昆蟲線粒體基因組研究進(jìn)展.昆蟲學(xué)報(bào), 53(5) : 581-586.]

Huang JH, Huang Y, Zhou SY. 2009. Check list of Chinese species of superfamily Eumastacoidea (Orthoptera: Caelifera) [J].J Guangxi Normal Univ, 27(1): 84-87. [黃建華, 黃 原, 周善義. 2009. 中國(guó)蜢總科昆蟲名錄. 廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào), 27(1): 84-87.]

Jiang DY. 2010. Determination and analysis of four complete mitochondrial genome sequences of locust populations [D]. College of Life Sciences,Xi’an Shaanxi Normal University. [江東洋. 2010. 中國(guó)四種飛蝗線粒體基因組序列的測(cè)定與分析 [D]. 西安: 陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院.]

Liu N, Hu J, Huang Y. 2006. Amplification of grasshoppers complete mitochondrial genomes using long PCR [J].Chn J Zool, 41: 61-65.[劉念, 胡 靖, 黃 原. 2006. 應(yīng)用長(zhǎng) PCR 擴(kuò)增蝗蟲線粒體全基因組.動(dòng)物學(xué)雜志, 41: 61-65.]

Saito S, Tamura K, Aotsuka T. 2005. Replication origin of mitochondrial DNA in insects[J].Genetics, 171(4): 1695-1705.

Shi HW, Ding FM, Huang Y. 2008. Complete sequencing and analysis of mtDNA inPhlaeoba albonemaZheng [J].Chn J Biochem Mol Biol, 24(7): 604-611.

Simon C, Buckley TR, Frati F, Stewart JB, Beckenbach AT. 2006.Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA [J].Annu Rev Ecol Evol Syst, 37:545–579.Wolstenholme DR, 1992. Animal mitochondrial DNA: structure and evolution [J].Int Rev Cytol, 141: 173-216.

Yokobori S, P??bo S. 1995. Transfer RNA editing in land snail mitochondria [J].Proc Natl Acad. Sci USA, 92: 10432-10435.

Ye W, Dang JP, Xie LD, Huang Y. 2008. Complete mitochondrial genome ofTeleogryllus emma(Orthoptera: Gryllidae) with a new gene order in Orthoptera [J].Zool Res, 29(3): 236-244. [葉 偉, 黨江鵬, 謝令德,黃 原. 2008. 黃臉油葫蘆線粒體基因組：一種新的基因排列方式.動(dòng) 物 學(xué) 研 究, 29(3):236-244.]

Zhong J, Li G, Liu ZQ, Li QW, Wang YQ. 2005. Gene rearrangement of mitochondrial genome in the vertebrate [J].Acta GenetSin, 32(3):322-330. [鐘 婧, 李 光, 劉忠權(quán), 李慶偉, 王義權(quán). 2005. 脊椎動(dòng)物線粒體DNA 的基因重排. 遺傳學(xué)報(bào), 32 (3): 322-330.]

Zhou ZJ, Huang Y, Shi FM. 2007. The mitochondrial genome ofRuspolia dubia(Orthoptera: Conocephalidae) contains a short A+T-rich region of 70 bp in length [J].Genome, 50: 855-866.

Analysis of the complete mitochondrial genome sequence ofPielomastax zhengi

YANG Hui, HUANG Yuan?

(School of Life Sciences,Shaanxi Normal University,Xi’an710062,China)

The complete mitochondrial genome sequence ofPielomastax zhengiwas determined by using long PCR and conserved primer walking approaches. The results showed that the entire mitochondrial genome ofPielomastax zhengiis 15 602 bp long with A+T content of 71.8%. All 37 genes are conserved in the positions observed in those ofLocusta migratoria. All the genes are closely assembled by leaving 10 intergenic spacers in between. Those intergenic spacers are 47 bp in total (excluding the A+T rich region), with individual size ranges from 1 bp to 20 bp. In addition,there are a total of 52 bp overlapping sequences among 14 genes, ranging from 1?8 bp. All protein-coding genes start with a typical initiation codon in insects, ATN. Twelve protein-coding genes use the usual TAA and TAG termination codons, whereas, the ND5 genes have an incomplete termination codon (T). Except the tRNASer (AGN), whose DHU arm is absent; all the other 21 tRNA genes have typical clover-leaf secondary structures. But inPielomastax zhengi, the secondary structures of five tRNA (tRNACys, tRNALys, tRNAPhe, tRNAPro, tRNAArg) genes can not be predicted by the conventional methods as they have only 3?4, rather than 5 base pairs in the TψC arm, while, the tRNALysand tRNAArghave only 4 base pairs in the anticode arm. The predicted secondary structures of lrRNA and srRNA have 6 domains with 44 helices and 3 domains with 30 helices, respectively. The results of the rRNA secondary structure comparison showed thatPielomastax zhengiis more closely related withLocusta migratoria tibetensisthanRuspolia dubia. Like most insects, the mitochondrial genome ofPielomastax zhengihas a non-coding A+T rich region containing a polythymidine stretch, which may be involved in the replication and/or translation initiation of other genes.

Eumastacoidea;Pielomastax zhengi; Mitochondrial genome; RNA secondary structure

Q969.26; Q754

A

0254-5853-(2011)04-0353-10

10.3724/SP.J.1141.2011.04353

2011-01-06；接受日期：2011-03-28

自然基金資助項(xiàng)目(30670279；30970346)

?通訊作者(Corresponding author)，E-mail: yuanh@snnu.edu.cn

楊輝，碩士研究生，研究方向：基因組學(xué)