王立暉袁永俊王 芃李培駿

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300222；2.西華大學(xué)，四川 成都 610039；3.溫州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)院，浙江 溫州 325000）

酪蛋白酶解液中β－酪啡肽－7的液相色譜檢測(cè)

王立暉1袁永俊2王 芃1李培駿3

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300222；2.西華大學(xué)，四川 成都 610039；3.溫州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)院，浙江 溫州 325000）

研究活性多肽β－酪啡肽－7的檢測(cè)。采用高效液相色譜法對(duì)胃蛋白酶解樣品中活性肽（β－酪啡肽－7）進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間發(fā)現(xiàn)水解0.5，1.5，2.5h的1，3，5號(hào)樣品含有β－酪啡肽－7。經(jīng)過(guò)重復(fù)進(jìn)樣，結(jié)果仍然一致。

液相色譜；β－酪啡肽－7；胃蛋白酶

酪蛋白來(lái)源于乳，含有人體必需的8種氨基酸及日常食物中的限制氨基酸賴(lài)氨酸、蛋氨酸等，是一種完全蛋白質(zhì)（PER值為2.5），能夠非常好的促進(jìn)生物體生長(zhǎng)發(fā)育［1］。牛乳中酪蛋白（casein），約占總蛋白的78.8%，根據(jù)氨基酸組成和電泳行為有所不同分為α、β、κ、γ4種結(jié)構(gòu)，其中β－酪蛋白占酪蛋白總量的28.2%。酪蛋白在動(dòng)物消化道中經(jīng)蛋白酶分解產(chǎn)生的肽段除了營(yíng)養(yǎng)功能外其特殊生物學(xué)活性已受到廣泛重視［2］。

具有特殊生物功能和生理作用的肽總稱(chēng)為生物活性肽，是目前營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)，包括酪蛋白經(jīng)蛋白酶水解后分離得到許多生物活性肽類(lèi)物質(zhì)［3］。酪啡肽是來(lái)源于β－酪蛋白所以也稱(chēng)β－酪啡肽。試驗(yàn)中胃蛋白酶的水解專(zhuān)一作用主要是針對(duì)苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸組成的肽鍵，對(duì)酪蛋白具有較好的水解度［4］。酪蛋白的酶解液中成分復(fù)雜，能否簡(jiǎn)便高效的檢測(cè)出目標(biāo)多肽成為研究熱點(diǎn)。農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心趙建國(guó)等［5］建立了一種較為便捷的分析方法即高壓反相液相色譜來(lái)測(cè)定乳中的酪蛋白的水解產(chǎn)物C12，獲得了一定的效果。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張?jiān)词纾?］以雜交瘤細(xì)胞株法與酪蛋白及其胃蛋白酶酶解消化液共同孵育并利用細(xì)胞活性鑒定法證明了酪蛋白經(jīng)胃蛋白酶處理后有阿片樣活性物質(zhì)釋放。上述方法均能對(duì)酪蛋白酶解液中的多肽進(jìn)行檢測(cè)但是檢測(cè)程序均比較復(fù)雜。本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)［7］的方法，對(duì)于酪蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解的產(chǎn)物是否含有目標(biāo)肽β－酪啡肽－7進(jìn)行檢測(cè)，旨在驗(yàn)證高效液相色譜法能夠有效的檢測(cè)出酪蛋白酶解液中的β－酪啡肽－7。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

干酪素：生化試劑，北京奧博生物技術(shù)責(zé)任有限公司；

胃蛋白酶（P－7000）：酶活性1∶10 000，美國(guó)Sigma公司；

甲醛：分析純，成都科龍化工試劑廠(chǎng)；

交聯(lián)葡聚糖Sephadex G－15：上海博耀生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，天津市博迪化工有限公司；

乙腈：色譜純，美國(guó)Methanol Fisher公司；

β－酪啡肽－7標(biāo)準(zhǔn)品：美聯(lián)西安生物科技有限公司；

其他試劑：均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

pH計(jì)：PHS－25型，上海雷磁儀器廠(chǎng)；

恒溫磁力攪拌器：78HW－1型，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)；

水浴恒溫振蕩器：SHA－B型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司

超聲波儀：AS5150A型，美國(guó)Ultrasonic公司；

高效液相色譜儀：SHIMADZU型，日本島津公司；

紫外－可見(jiàn)監(jiān)測(cè)器：SPD－10A型，日本島津公司；

紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)：TU－1800PC型，北京普析通用儀器有限公司；

微孔過(guò)濾膜：型號(hào)（0.45nmφ50），上海市新亞凈化器件廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 在酪蛋白底物濃度為10mg/mL，胃蛋白酶添加量為溶液總量1%，體系pH值為1.6，酶解溫度為55℃ 的條件下，分別水解0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5h制備7個(gè)樣品，再于4℃以4 000r/min離心10min，取上清液過(guò)濾，濾液于4℃保存?zhèn)溆茫?］。將交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G－15用水溶脹后裝入1.7cm×57.5cm的分離柱中，使用Tris－HCl緩沖液洗脫平衡，緩沖液用量一般為床體積量2～3倍。然后將制備的樣品分別進(jìn)柱分離。按照優(yōu)化的層析條件進(jìn)行分離，并參考分離標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行目標(biāo)峰的收集［9］。

1.3.2 樣品預(yù)處理 收集交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G－15柱分離的目標(biāo)峰，放入－74℃冰箱冷凍8h，然后放入冷凍干燥機(jī)，先打開(kāi)制冷裝置預(yù)冷到－54℃，然后把樣品依次快速放入干燥機(jī)，密封好，開(kāi)啟真空泵，真空冷凍干燥48h，取出樣品，記錄干重，待色譜檢測(cè)。

1.3.3 樣品檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比β－酪啡肽－7標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果（保留時(shí)間29.912s）。使用微孔濾膜過(guò)濾和超聲波儀對(duì)溶劑進(jìn)行預(yù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白水解

由表1可知，隨酶解時(shí)間的越長(zhǎng)，樣品水解度逐漸增大。

表1 樣品編號(hào)及水解度Table 1 Numbers and hydrolysis degree of Sample

2.2 樣品檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)文獻(xiàn)［7］建立的高效液相色譜檢測(cè)方法對(duì)于水解樣品1～7號(hào)進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，結(jié)果顯示2，4，6，7號(hào)樣品無(wú)明顯出峰，而1，3，5號(hào)樣品有明顯出峰，見(jiàn)圖1～3和表2。

圖1 樣品1色譜分析圖Figure 1 Sample No.1

圖2 樣品3色譜分析圖Figure 2 Sample No.3

圖3 樣品5色譜分析圖Figure 3 Sample No.5

表2 樣品分析結(jié)果Table 2 Result of Sample

對(duì)比β－酪啡肽－7標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果保留時(shí)間29.912s發(fā)現(xiàn)部分樣品中含有β－酪啡肽－7，即是水解0.5，1.5，2.5h的1號(hào)，3號(hào)，5號(hào)樣品，經(jīng)過(guò)重復(fù)進(jìn)樣，結(jié)果仍然保持一致。水解1.0，2.0，3.0，3.5h的樣品均未檢測(cè)出β－酪啡肽－7，分析可能是樣品中β－酪啡肽－7濃度過(guò)低，未達(dá)到試驗(yàn)限。β－酪啡肽－7的檢測(cè)結(jié)果，出現(xiàn)了斷點(diǎn)，未出現(xiàn)理想中的連續(xù)變化，可能有幾個(gè)原因：① 酶解試驗(yàn)中使用的胃蛋白酶（P－7000）純度欠佳，可能含有雜質(zhì)或其他混合酶類(lèi)，會(huì)對(duì)胃蛋白的精確切割位點(diǎn)產(chǎn)生影響。② 大量的非目標(biāo)產(chǎn)物即在不同水解時(shí)間生成的不同雜質(zhì)和多肽，可能會(huì)影響到分離與檢測(cè)。③ 在試驗(yàn)操作中可能有一些人為操作誤差或一些未知因素而造成比較大的誤差，可能影響了最后的結(jié)果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)［7］的高壓反相液相色譜分析方法來(lái)測(cè)定的酪蛋白的水解產(chǎn)物中的β－酪啡肽－7，但是檢測(cè)的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性還有待提高。使用RP－HPLC法鑒定水解液中多肽是目前國(guó)內(nèi)外最多用的方法，但是由于酶解液中蛋白質(zhì)片段的種類(lèi)多且黏度大，很難用一種方法實(shí)現(xiàn)高效的分離。采用更有效預(yù)處理方法、采用合適的流動(dòng)相調(diào)節(jié)劑、采用更高效的分離柱會(huì)有效的提高分離效率，有待于下一步研究。

1 張必武，樂(lè)國(guó)偉，施用暉，等.乳蛋白源阿片肽－β－酪啡肽［J］.飼料研究，2001（6）：13～14.

2 Yu VY.The role of dietary nuclcotides in neonatal and infant nutrition［J］.Singapore Med.J.，1998，39（4）：145～50.

3 張必武，樂(lè)國(guó)偉，施用暉，等.乳蛋白源阿片肽－β－酪啡肽［J］.飼料研究，2001（6）：13～14.

4 鄒思湘.酪蛋白源活性肽［J］.生命的科學(xué)，1993，13（1）：18～20.

5 張?jiān)词纾u思湘.乳源阿片肽活性物質(zhì)對(duì)動(dòng)物消化、代謝的影響［J］.中國(guó)飼料，2001（13）：14～15.

6 張?jiān)词?，陳偉華，鄒思湘.用HPLC測(cè)定酪蛋白酶解產(chǎn)物中的β－Casomorphin－7［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，1999，27（1）：37～38.

7 孫勇民.β－酪啡肽－7的高效液相色譜檢測(cè)［J］.食品工業(yè)，2008（3）：49～53.

8 王立暉.胃蛋白酶水解酪蛋白生成β－酪啡肽－7的研究［J］.中國(guó)釀造，2010（4）：64～67.

9 白泉，葛小娟，耿信篤，等.反相液相色譜對(duì)多肽的分離、純化與制備［J］.分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2002，30（9）：1 126～1 129.

Examination ofβ－Casomorphin－7from casein by pepsin

WANG Li－h(huán)ui1YUAN Yong－Jun2WANG Peng1LI Pei－Jun3

（1.Tianjin Modern Vocation Technology College，Tianjin300222，China；2.Xi Hua University，Chengdu，Sichuan610039，China；3.Wenzhou Instiute of Technology and Calibration，Wenzhou，Zhejiang325000，China）

This paper mainly research on the examination of active polypeptideβ－Casomorphin－7.Using HPLC chromatography on pepsin solution in a sample ofβ－Casomorphin－7detection.Compared with the results of standard retention time found the hydrolysis of 0.5h，1.5h，2.5h，No.1，No.3.No.5samples containing beta casomorphin 7，after repeated sampling，the results remained consistent.

HPLC；β－Casomorphin－7；pepsin

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.035

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（編號(hào)：0325127）

王立暉（1981－），男，天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，碩士。E－mail：wanglihui2008＠126.com

2011－08－01