張 博，尹時(shí)華

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,南寧 530021)

Prestin是一種特異存在于耳蝸外毛細(xì)胞(outer hair cell,OHC)的動(dòng)力蛋白，該蛋白在解釋哺乳動(dòng)物耳蝸的高度敏感性和頻率選擇性以及OHC的電動(dòng)特性機(jī)制上具有重要意義。近年來(lái)，關(guān)于Prestin在OHC的表達(dá)、定位以及Prestin與OHC電運(yùn)動(dòng)和耳蝸放大效應(yīng)之間的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。早期研究認(rèn)為采用全細(xì)胞電壓鉗技術(shù),在OHC細(xì)胞核平面以上的側(cè)膜區(qū)域能夠記錄到與電運(yùn)動(dòng)相關(guān)的非線性電容，在平面以下的側(cè)膜區(qū)域則不能記錄到明顯的非線性電容，因此，有人推測(cè)OHC細(xì)胞膜在細(xì)胞核平面以下部位無(wú)Prestin分布[1-4]。而近年來(lái)有人運(yùn)用熒光雙染及復(fù)合染色等方法觀察發(fā)現(xiàn)，Prestin不僅分布于成年大鼠和豚鼠OHC側(cè)膜，在細(xì)胞底部也有分布[5]。但有關(guān)Prestin在乳鼠耳蝸單離OHC細(xì)胞膜上的分布尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以Wistar乳鼠為研究對(duì)象,觀察Prestin在乳鼠耳蝸單離OHC細(xì)胞膜上的分布定位。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與OHC的分離:選擇出生7 d的Wistar乳鼠20只，雌雄不限，迅速斷頭，在解剖顯微鏡下取出耳蝸基底膜?；啄ぶ糜跐舛葹?.25 mg/mL的木瓜蛋白酶中，37 ℃孵育10～15 min，輕柔吹打后用加有10%胎牛血清的DMEM液終止消化。懸液經(jīng)離心后去上清液，加入1 mL培養(yǎng)液在37 ℃，5%CO2孵箱孵育24 h。4%多聚甲醛固定30 min，封閉液(10%山羊血清和1%BSA)30 min，1∶1 000一抗4 ℃過(guò)夜，1∶64 FITC兔抗羊IgG二抗(武漢博士德公司生產(chǎn))室溫下孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

熒光顯微鏡下顯示,經(jīng)Prestin抗體標(biāo)記的乳鼠單離OHC的側(cè)膜可見(jiàn)明顯的Prestin抗體陽(yáng)性染色;OHC基底部細(xì)胞膜亦見(jiàn)陽(yáng)性染色,但較弱(圖1);側(cè)膜與基底部膜結(jié)合部位未見(jiàn)陽(yáng)性染色。

圖1 熒光顯微鏡下基底部細(xì)胞膜部位(箭頭所示)

3 討 論

在耳蝸放大機(jī)制中，OHC能夠?qū)㈦娦盘?hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞長(zhǎng)度的機(jī)械性改變[6]。當(dāng)外界聲音引發(fā)耳蝸內(nèi)液體波動(dòng)及基底膜機(jī)械振動(dòng)時(shí),內(nèi)毛細(xì)胞和OHC表面的纖毛束可將這種機(jī)械刺激轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。其中OHC電位變化除小部分作為聲音信息傳入大腦外,大部分都通過(guò)引發(fā)胞體電運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)化為機(jī)械能,并反饋給基底膜,進(jìn)一步增強(qiáng)基底膜的振動(dòng),使內(nèi)毛細(xì)胞感受的機(jī)械刺激得以放大[7]。此過(guò)程中,OHC電運(yùn)動(dòng)成為關(guān)鍵。Prestin作為OHC的運(yùn)動(dòng)蛋白,是電運(yùn)動(dòng)和耳蝸放大效應(yīng)的分子基礎(chǔ),并特異性地在耳蝸OHC側(cè)膜上表達(dá),而在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞及心臟、腦、腎臟、肺和肌肉等重要組織中均未發(fā)現(xiàn)Prestin表達(dá)[8-10]。通過(guò)基因敲除動(dòng)物模型,也進(jìn)一步證實(shí)了Prestin是OHC電運(yùn)動(dòng)及耳蝸放大效應(yīng)所必需的運(yùn)動(dòng)蛋白[11]。

近年來(lái)，有人運(yùn)用熒光雙染及復(fù)合染色等方法觀察發(fā)現(xiàn)，成年大鼠和豚鼠OHC除了側(cè)膜有明顯的Prestin抗體陽(yáng)性染色之外，在OHC基底部的細(xì)胞膜上也有較強(qiáng)的陽(yáng)性染色，同時(shí)在細(xì)胞核平面以下的側(cè)膜即側(cè)膜與基底部細(xì)胞膜結(jié)合處也有陽(yáng)性染色的存在[5]。

本實(shí)驗(yàn)是以出生7 d乳鼠為研究對(duì)象,利用Prestin特異性抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察Prestin在乳鼠耳蝸單離OHC細(xì)胞膜上的表達(dá)與分布。本研究結(jié)果顯示：(1)OHC側(cè)膜存在較為均一的Prestin抗體陽(yáng)性染色；(2)OHC底端細(xì)胞膜亦見(jiàn)陽(yáng)性染色,但著色較弱；(3)側(cè)膜與底端細(xì)胞膜結(jié)合部位未見(jiàn)陽(yáng)性染色。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以推測(cè)：成年大鼠OHC基底部細(xì)胞膜以及細(xì)胞核平面以下的側(cè)膜上分布的Prestin蛋白不是一出生就存在的，而是逐步產(chǎn)生增多的。有文獻(xiàn)報(bào)道了Prestin的表達(dá)可被控制,并且在細(xì)胞生命周期中處于不間斷更新過(guò)程中，并推測(cè)OHC的基底部可能存在Prestin的儲(chǔ)存庫(kù)[5,12]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，儲(chǔ)存庫(kù)可能存在于OHC側(cè)膜，側(cè)膜上的Prestin在耳蝸OHC成熟過(guò)程中不斷增加，并向基底部膜擴(kuò)散，這也能比較好地解釋成年Wistar大鼠OHC細(xì)胞核平面以上的側(cè)膜、基底部膜和細(xì)胞核平面以下的側(cè)膜上Prestin密度逐漸減少這一現(xiàn)象。

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