柏文琴，閆桂琴，李瑞艷，于志輝

(山西師范大學生命科學學院，山西 臨汾 041004)

大花萱草為百合科(Liliaceae)萱草屬(HemerocallisL.)多年生宿根草本，又叫多倍體萱草(HemetocallisfulvaVar.florepleno)，具短根狀莖和肉質(zhì)肥厚的紡錘狀塊根.葉基生，條形排成兩列，長度、寬度依品種不同而有差別.花葶粗壯，螺旋狀聚傘花序，著花數(shù)十朵，花冠漏斗狀，單朵花僅開1天，但一花開完它花繼放，花期長，花期在5-10月，依品種不同而不同.大花萱草具有較強的抗旱、抗寒、抗鹽堿、抗病蟲害、耐半蔭等特性.大花萱草可叢植于草坪中或于花壇、路旁栽植，是理想的觀花賞葉的地被植物.另外，大花萱草也是優(yōu)良環(huán)保植物，對二氧化硫有較強的抗性[1].

大花萱草結(jié)實率低，一般不采用種子繁殖，而是采用分蘗等無性繁殖方式進行增殖.但由于其速度慢，一般一株大花萱草每年僅可繁殖3～4株，個別品種每年繁殖1～2株，因而難以適應市場商品化生產(chǎn)的需求.利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)是解決大花萱草大量繁殖的最有效途徑.此外，組織培養(yǎng)技術(shù)也為大花萱草的品種選育提供了技術(shù)基礎(chǔ).而初代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)技術(shù)中的首要環(huán)節(jié)，前人對于大花萱草組織培養(yǎng)雖有研究[2-7]，但在初代培養(yǎng)這一環(huán)節(jié)缺乏系統(tǒng)的研究，而且不同品種、不同外植體得出的結(jié)論差異很大.本試驗選用大花萱草新品種“baltimore oriole”的7種不同外植體進行誘導的比較研究，以期篩選出較適宜的外植體材料與激素濃度及配比，為大花萱草快速繁殖提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1材料美國進口的大花萱草新品種“baltimore oriole”.

1.2 研究方法

1.2.1 外植體選擇及處理 選取生長健康、無病蟲害的大花萱草新品種“baltimore oriole”的葉片、根段、莖尖、花莖、花托、花瓣和子房7種外植體，用洗潔精清洗干凈后，用流水沖洗，75%乙醇處理30 s，0.1% HgCl2處理10 min(根和莖尖處理時間相應延長)，蒸餾水沖洗7～8次.滅菌處理后，葉片和花瓣，切成1 cm×1 cm大小；根和幼嫩花莖取0.5 cm長；花托切成0.5 cm×0.5 cm大??；莖尖切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大??；子房一切為二.將處理好的外植體分別接入表1培養(yǎng)基中培養(yǎng).

1.2.2 初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基 根據(jù)Heuser的報道[8]，選用MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基[9]，同時參閱前人有關(guān)萱草及其同屬、同科植物的愈傷組織的培養(yǎng)基配方[2-7]，以及預試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計了5種激素組合進行試驗(見表1)，每種培養(yǎng)基中均含有3%蔗糖，瓊脂0.6%，pH調(diào)至5.8～6.0.

表1 愈傷組織誘導培養(yǎng)基

1.2.3 繼代培養(yǎng)基 將莖尖誘導的叢生芽、花托、花莖和子房誘導的愈傷組織切成小塊接種到各自初代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，以考察初代培養(yǎng)物繼續(xù)生長狀況.

1.2.4 培養(yǎng)條件 25 ℃恒溫培養(yǎng)，每天光照12 h，光照強度為2 000～2 500 lx.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體初代培養(yǎng)結(jié)果及分析

2.1.1 葉片、花瓣和根段初代誘導結(jié)果 葉片和花瓣在5種培養(yǎng)基上的生長情況相似，僅有面積的擴大，而無愈傷組織產(chǎn)生，30 d后，均干枯死亡.根段經(jīng)過一段時間培養(yǎng)同樣干枯死亡.說明葉片、花瓣和根段不適宜作為大花萱草初代培養(yǎng)的外植體.

2.1.2 莖尖初代誘導結(jié)果 莖尖經(jīng)過30 d的培養(yǎng)，在5種培養(yǎng)基中均出現(xiàn)兩種情況：一種是莖尖直接長出獨苗，苗子濃綠，粗壯(見圖1)；另一種是一個莖尖長出2個甚至多個叢生芽，顏色略黃，較弱(見圖2).兩種情況都很少產(chǎn)生愈傷組織.不同的激素組合對莖尖產(chǎn)生的叢生芽數(shù)有很大的影響(見表2).

表2 莖尖在不同培養(yǎng)基中芽增殖結(jié)果

*增殖倍數(shù)=培養(yǎng)后芽數(shù)/外植體莖尖數(shù)

其中在A2培養(yǎng)基中芽增值倍數(shù)最高，為3.0，而在A5培養(yǎng)基中芽增殖倍數(shù)最低，僅1.4.說明莖尖是較適宜的初代培養(yǎng)外植體，合適的細胞分裂素和生長素濃度(6-BA濃度為2 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L)及比例(10/1)有利于誘導莖尖產(chǎn)生叢生芽.

2.1.3 花莖的愈傷組織誘導 花莖培養(yǎng)2周左右，與培養(yǎng)基接觸部位開始膨大，4周左右長出大量愈傷組織(見圖3)，并有少量芽點，5周左右愈傷組織分化出大量芽(見圖4).花莖在5種培養(yǎng)基中均能誘導形成質(zhì)地緊密、淡黃綠色的愈傷組織.但不同的激素組合對愈傷組織的誘導率有很大的影響.在A1、A2、A3、A4和A5中愈傷組織的誘導率分別為29.4%、66.7%、23.5%、17.8%和86.7%，在A5培養(yǎng)基中誘導率最高，而在A4培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導率最低.說明花莖是初代培養(yǎng)較適宜的外植體，合適的細胞分裂素和生長素濃度(6-BA濃度為0.5 mg/L，NAA濃度為0.1 mg/L)及比例(5/1)有利于誘導花莖產(chǎn)生愈傷組織.

圖1 莖尖萌發(fā)獨苗

圖2 莖尖長出叢生芽

2.1.4 子房和花托的愈傷組織誘導 子房和花托在5種培養(yǎng)基中1周左右開始膨大，但是很難形成愈傷組織，子房只在A3和A4培養(yǎng)基中有愈傷產(chǎn)生(見圖5)，誘導率分別為40%和20%.花托只在A3培養(yǎng)基中有愈傷產(chǎn)生，誘導率為29.4%，愈傷組織水浸狀、且質(zhì)地疏松(見圖6)，其余培養(yǎng)基中只有膨大而無愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間的延長，膨大的子房和花托逐漸干枯死亡.因此，雖然子房和花托外植體可以誘導產(chǎn)生愈傷組織，但是從誘導率和愈傷組織形態(tài)分析可知，子房和花托不適宜作為大花萱草初代培養(yǎng)的外植體.

圖3 花莖上誘導產(chǎn)生大量愈傷

圖4 愈傷組織上分化出芽

圖5 子房誘導產(chǎn)生愈傷組織

圖6 花托誘導產(chǎn)生愈傷組織

2.2愈傷組織及芽的繼代培養(yǎng)將花莖、子房和花托誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成合適大小接種到繼代培養(yǎng)基中，子房和花托產(chǎn)生的愈傷組織在培養(yǎng)過程中逐漸死亡，而花莖誘導的愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基后，愈傷組織不斷增加，上面的芽點逐漸長成一株株小苗，且不斷分化產(chǎn)生新的不定芽，每塊愈傷組織上約有4～5個芽(見圖7).莖尖誘導的芽在繼代培養(yǎng)基中不產(chǎn)生愈傷組織，只繼續(xù)產(chǎn)生叢生芽(見圖8)，但是芽的增殖倍數(shù)不高，每個周期約3倍左右.從繼代培養(yǎng)結(jié)果可以進一步證實莖尖和花莖是大花萱草初代培養(yǎng)的較適宜的外植體.

圖7 愈傷組織誘導出芽

圖8 芽誘導產(chǎn)生叢生芽

3 討論

植物愈傷組織的誘導主要受外植體本身、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境三大因素的調(diào)控.不同植物的器官和組織，其形態(tài)發(fā)生能力大不相同，即使同種植物不同外植體，所需要的營養(yǎng)和外源激素的濃度及比例也不相同，原因可能是由于它們的生理狀態(tài)和所處的生育時期不同，其內(nèi)源激素濃度和比例不同[10].因此在初代培養(yǎng)中選擇合適的外植體和適宜的激素濃度及比例是非常重要的.

莖尖是植物頂端的原生分生組織和它衍生的分生組織，具有非常旺盛的細胞分裂能力和很強的生命力.大花萱草新品種“baltimore oriole”的莖尖，在含2 mg/L 6-BA 和0.2 mg/L NAA的MS中，會形成叢生芽，增殖倍數(shù)達3.將叢生芽切割成幾份新的外植體，接入相同培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng).這種繁殖方式產(chǎn)生的芽遺傳性狀穩(wěn)定，是大花萱草快速繁殖的一種有效途徑[11].缺點是莖尖的剝離困難，而且損壞花苗，且由于與土壤接觸，葉片層層包裹，不易徹底滅菌，因而初代培養(yǎng)中污染率很高.因此，當繁殖優(yōu)良性狀的品種且有一定數(shù)量的種質(zhì)資源時，可選擇莖尖為外植體.

植物葉片、子房、花藥、胚珠、葉柄等成熟組織經(jīng)過恢復分生能力，誘導出愈傷組織，再從愈傷組織誘導不定芽.這種分化類型可能會發(fā)生變異，用于良種繁殖時應注意[8].本實驗選用葉片、根段、花莖、花托、花瓣和子房這幾種成熟組織進行愈傷組織的誘導，結(jié)果表明不同成熟外植體誘導愈傷組織的能力不同，葉片、根段和花瓣，在5種培養(yǎng)基中難以誘導出愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間延長，逐漸干枯死亡.花托和子房雖有一定數(shù)量的愈傷組織，但是誘導率很低，且在隨后的繼代培養(yǎng)中逐漸干枯死亡.花莖在0.5 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA的MS中，愈傷組織的誘導率最高，達到86.7%，而且繼代培養(yǎng)中愈傷組織全部能分化產(chǎn)生不定芽，每塊愈傷組織上平均有4～5個芽.因此，可以選用花莖作為大花萱草“baltimore oriole”繁殖的外植體，但是存在缺點：一是取材時間受限制，只能選擇每年的花期，而且要求花莖處于幼嫩階段；二是經(jīng)過愈傷組織階段，有變異的可能性.

因此，大花萱草“baltimore oriole”初代培養(yǎng)時，可根據(jù)實際情況，選擇花莖或莖尖作為外植體.不同外植體所需激素濃度和配比不同，花莖作為外植體較適宜的激素濃度是0.5 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA，莖尖作為外植體較適宜的激素濃度是2 mg/L 6-BA 和0.2 mg/L NAA.

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