石文波，高天翔，胡蘊(yùn)鈺，許 聰，陶 俊，趙大球

(揚(yáng)州大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

褪黑素(melatonin， MT)是一種吲哚類小分子，化學(xué)名稱為N-乙?；?5-甲氧基色胺(N-acetyl-5-methoxytryptamine)。自1958年首次由牛的松果體組織中分離提取之后，褪黑素目前已在細(xì)菌、真菌以及各種動植物中均被發(fā)現(xiàn)[1]。與動物相比，植物上褪黑素研究起步較晚，直到1995年Dubbels等[2]和Hattori等[3]才在單子葉與雙子葉植物中發(fā)現(xiàn)了褪黑素的存在。由于結(jié)構(gòu)上和生長素具有高度相似性以及具有清除自由基的能力[4-5]，褪黑素往往被認(rèn)為是一種全新的植物生長調(diào)節(jié)劑和生長刺激劑，發(fā)揮著廣泛的生理作用，其中最主要的是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育[6]和增強(qiáng)植株抗逆性[7]。目前，褪黑素已在大田農(nóng)作物、園藝植物上廣泛應(yīng)用[8-9]，而在觀賞花卉上涉及較少。

芍藥(PaeonialactifloraPall.)是原產(chǎn)于我國的傳統(tǒng)名花，其栽培歷史超過4 000年，遠(yuǎn)在夏代就在宮廷中用于觀賞[10]。由于芍藥花大色艷、花型端莊、花香襲人，且正常花期又在5月，常被歐美國家作為婚禮鮮花使用，現(xiàn)已成為國際市場上廣受青睞的高檔切花[11]。根據(jù)我國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，花莖挺直程度是衡量芍藥切花品質(zhì)最基本的也是最重要的品質(zhì)指標(biāo)[12]。而我們在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，大量花色、花型表現(xiàn)優(yōu)異的品種卻在花莖品質(zhì)上表現(xiàn)欠佳，容易彎曲、倒伏，挺直程度差。而在物理學(xué)上，植物的莖稈強(qiáng)度可作為植物莖稈挺直程度的衡量標(biāo)準(zhǔn)[13]。本課題組前期圍繞芍藥花莖挺直程度的問題，通過對芍藥不同發(fā)育時期花莖的形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁組分含量進(jìn)行觀測，明確了花莖強(qiáng)度是由其組織中加厚的次生細(xì)胞壁來控制，木質(zhì)素是影響芍藥花莖強(qiáng)度的主要細(xì)胞壁組分[14]。此外，硅、鈣等礦質(zhì)元素處理均能顯著增強(qiáng)芍藥花莖強(qiáng)度，提高木質(zhì)素含量[15-16]。

近期研究發(fā)現(xiàn)，外源噴施褪黑素能夠顯著增強(qiáng)陸地棉莖稈中木質(zhì)素含量，從而提高了植株對黃萎病抗性[17]。而在芍藥上，褪黑素是否能夠通過調(diào)控木質(zhì)素的合成來影響芍藥花莖強(qiáng)度至今未見報道。本研究選擇10個不同花莖挺直程度的芍藥品種為材料，測定花莖機(jī)械強(qiáng)度、植株形態(tài)指標(biāo)、植株光合特性、花莖木質(zhì)素與褪黑素含量，旨在明確花莖強(qiáng)度與褪黑素含量的關(guān)系，為后期芍藥切花莖稈品質(zhì)的改良奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

基于本課題組前期關(guān)于芍藥花莖機(jī)械強(qiáng)度聚類分析結(jié)果[18]，選用栽植于揚(yáng)州大學(xué)國家芍藥種質(zhì)資源庫中的花莖強(qiáng)度低的芍藥品種玫瑰紫、粉珠盤、桃花飛雪、春曉、紫花剪絨和花莖強(qiáng)度高的芍藥品種山河紅、雪原紅花、紫袍、勝富貴、金輝為材料，在盛花期測定完植株高度、光合特性后，將剪取的植株迅速帶回實驗室，而后剪取花朵以下12 cm莖稈測定相關(guān)形態(tài)指標(biāo)，并置于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 花莖強(qiáng)度測定

采用莖稈強(qiáng)度測定儀(NK-2，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司)測定花莖強(qiáng)度，每個品種測定10支。

1.2.2 植株形態(tài)指標(biāo)測定

株高由米尺在田間測定，采用游標(biāo)卡尺(X-2， 深圳量天下計量儀器有限公司)和天平(T500，常熟雙杰測試儀器廠)分別測定花徑、花質(zhì)量、莖粗和莖質(zhì)量，相關(guān)指標(biāo)測定以花蕾以下12 cm花莖為對象，每個品種測定10支。

1.2.3 植株光合特性測定

利用便攜式光合儀(LI-6400，美國Li-Cor)于當(dāng)?shù)貢r間上午8:30進(jìn)行測定，葉片選取芍藥頂端向下第四節(jié)處。數(shù)值穩(wěn)定后通過系統(tǒng)記錄凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、細(xì)胞間CO2濃度(Ci)和氣孔導(dǎo)度(Gs)4個光合參數(shù)。

1.2.4 花莖木質(zhì)素含量測定

花莖木質(zhì)素含量采用試劑盒進(jìn)行測定(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)。先將樣品 80 ℃烘干至恒重，粉碎，過40目篩獲取干樣。稱取5 mg干樣(記為W)于10 mL試管中，對照管不加。然后加入1 000 μL試劑一和40 μL高氯酸，用封口膜密封，充分混勻，80 ℃水浴40 min，每隔10 min振蕩一次，然后自然冷卻。加入1 000 μL試劑二，充分混勻。取上清液40 μL加入1 960 μL試劑三。取1 mL于微量比色皿中，使用紫外分光光度計(Alpha1502，上海譜元儀器有限公司)測定280 nm處吸光值D。分別記為D空白管和D測定管。ΔD=D測定管-D空白管。木質(zhì)素含量(mg·g-1，以干重計)=0.029 4×(ΔD-0.006 8)÷W×50。

1.2.5 花莖褪黑素含量測定

花莖褪黑素含量采用植物褪黑素試劑盒進(jìn)行測定(上海橋杜生物科技有限公司)。將芍藥莖稈加液氮用研缽研磨均勻，稱取0.1 g樣品凍干粉，置于1.5 mL離心管中，加入1 mL磷酸緩沖溶液，搖晃均勻。將樣品置于冰上，使用超聲波細(xì)胞破碎儀100 W，超聲30 s，隨后樣品勻漿在4 ℃下10 000 ×g離心10 min，取上清備用。先將試劑盒室溫平衡20 min，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加入50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、50、100、200、400、800 pg·mL-1。樣品孔中先加10 μL待測樣本上清，再加入40 μL樣品稀釋液(10倍稀釋)。然后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中均加入100 μL辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，重復(fù)洗板5次。而后每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。孵育后每孔加入50 μL終止液，而后放入酶標(biāo)儀(SpectraMax M5，美國Molecular Devices)中，在450 nm波長處測定各孔的D值，15 min內(nèi)測定。利用測得標(biāo)準(zhǔn)曲線計算褪黑素含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)整理采用Excel 2016軟件完成，圖片采用Sigma Plot 10.0軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 花莖強(qiáng)度

本研究選取了10個芍藥品種為材料，從圖1可以看出，芍藥品種玫瑰紫、粉珠盤、桃花飛雪、春曉和紫花剪絨的花莖顯著彎曲，花朵下垂，而芍藥品種山河紅、雪原紅花、紫袍、勝富貴和金輝的花莖挺直。

通過對花莖強(qiáng)度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)花莖彎曲的芍藥品種花莖強(qiáng)度平均值為10.14 N，花莖挺直的芍藥品種花莖強(qiáng)度平均值為18.33 N(圖2)。其中，勝富貴的花莖強(qiáng)度最高，達(dá)到19.88 N，為花莖強(qiáng)度最低品種紫花剪絨的2.26倍。

2.2 植株形態(tài)指標(biāo)

在對不同花莖強(qiáng)度芍藥品種的株高、莖粗、莖質(zhì)量、花質(zhì)量和花徑等植株形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行測定后發(fā)現(xiàn)，高花莖強(qiáng)度芍藥品種的莖粗與莖質(zhì)量均高于低花莖強(qiáng)度芍藥品種，尤其是莖粗，前者的均值超出后者36.3%；而株高、花徑和花質(zhì)量等指標(biāo)在不同芍藥品種間表現(xiàn)不一，高花莖強(qiáng)度芍藥品種雖然大部分高于低花莖強(qiáng)度品種，但差異不明顯(表1)。

圖1 不同花莖強(qiáng)度芍藥品種的花莖形態(tài)Fig.1 Morphology of inflorescence stems in P. lactiflora cultivars with different inflorescence stem strength

圖2 不同芍藥品種的花莖強(qiáng)度Fig.2 Inflorescence stem strength of P. lactiflora cultivars

2.3 植株光合特性

不同花莖強(qiáng)度芍藥品種的植株光合特性也存在差異(圖3)。高花莖強(qiáng)度芍藥品種的Pn、Gs和Tr均高于低花莖強(qiáng)度芍藥品種，尤其是花莖強(qiáng)度最高品種勝富貴的3個光合參數(shù)均最高。而就Ci值而言，除金輝外，高花莖強(qiáng)度芍藥品種同樣高于低花莖強(qiáng)度芍藥品種。

2.4 花莖木質(zhì)素含量

木質(zhì)素是影響芍藥花莖強(qiáng)度的主要細(xì)胞壁組分[14]。本研究采用紫外分光法對不同花莖強(qiáng)度芍藥品種的花莖木質(zhì)素含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)高花莖強(qiáng)度芍藥品種的花莖木質(zhì)素含量均高于低花莖強(qiáng)度芍藥品種(圖4)。低花莖強(qiáng)度芍藥品種的平均花莖木質(zhì)素含量為91.96 mg·g-1，而高花莖強(qiáng)度芍藥品種的平均花莖木質(zhì)素含量則為109.98 mg·g-1，它比低花莖強(qiáng)度芍藥品種高出了19.6%。在這10個品種中，勝富貴的花莖木質(zhì)素含量最高，達(dá)到121.48 mg·g-1，而紫花剪絨的花莖木質(zhì)素含量最低，僅為87.9 mg·g-1。

2.5 花莖褪黑素含量

本研究又采用酶聯(lián)免疫法對不同花莖強(qiáng)度芍藥品種的花莖褪黑素含量進(jìn)行了測定，其變化與花莖木質(zhì)素含量基本一致，高花莖強(qiáng)度芍藥品種的花莖褪黑素含量均高于低花莖強(qiáng)度芍藥品種(圖5)。低花莖強(qiáng)度芍藥品種的平均花莖褪黑素含量為776.67 pg·g-1，而高花莖強(qiáng)度芍藥品種的平均花莖褪黑素含量僅為1 179.45 pg·g-1，它比低花莖強(qiáng)度芍藥品種高出了45.7%。在這10個品種中，勝富貴的花莖褪黑素含量依然最高，達(dá)到1 449.67 pg·g-1，而桃花飛雪的花莖褪黑素含量最低，僅為607.57 pg·g-1。

隨后，將花莖強(qiáng)度、花莖木質(zhì)素含量、花莖褪黑素含量3者之間的相關(guān)性進(jìn)行了進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)花莖強(qiáng)度與花莖木質(zhì)素含量之間的相關(guān)性系數(shù)為0.87，達(dá)到顯著水平；花莖強(qiáng)度與花莖褪黑素含量之間的相關(guān)性系數(shù)為0.71；而花莖木質(zhì)素含量與花莖褪黑素含量之間的相關(guān)性系數(shù)為0.81，同樣達(dá)到顯著水平。

表1 不同花莖強(qiáng)度芍藥品種的形態(tài)指標(biāo)

圖3 不同花莖強(qiáng)度芍藥品種的光合特性Fig.3 Photosynthetic characteristics of P. lactiflora cultivars with different inflorescence stem strength

圖4 不同花莖強(qiáng)度芍藥品種的木質(zhì)素含量Fig.4 Lignin content of P. lactiflora cultivars with different inflorescence stem strength

圖5 不同花莖強(qiáng)度芍藥品種的褪黑素含量Fig.5 Melatonin content of P. lactiflora cultivars with different inflorescence stem strength

3 討論

作為植物體三大營養(yǎng)器官之一，莖不僅能夠為整個植物體協(xié)調(diào)養(yǎng)分、水分的輸導(dǎo)，還起著機(jī)械支撐的重要作用[19]。莖稈強(qiáng)度與植株形態(tài)特征之間存在顯著的相關(guān)性，尤其是莖粗和株高。一般來說，莖粗與莖稈強(qiáng)度之間呈顯著正相關(guān)，而株高在不同植物間則表現(xiàn)不一，這在農(nóng)作物的抗倒伏育種中已經(jīng)得到廣泛的研究[20-21]。在觀賞植物向日葵上的研究同樣顯示，莖粗是影響莖稈強(qiáng)度的主要形態(tài)指標(biāo)[22]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高花莖強(qiáng)度芍藥品種的莖粗與莖質(zhì)量均顯著高于低花莖強(qiáng)度品種，這與前人的研究相一致[18]。莖粗是次生細(xì)胞壁厚度的外在體現(xiàn)，莖質(zhì)量則代表著莖稈中貯藏物質(zhì)的含量，高花莖強(qiáng)度芍藥品種具有較高的莖粗與莖質(zhì)量表明芍藥花莖的微觀結(jié)構(gòu)與物質(zhì)組成對其強(qiáng)度具有重要影響。此外，芍藥株高、花質(zhì)量與花徑雖然與花莖強(qiáng)度也呈正相關(guān)，但均未達(dá)到顯著水平，表明隨著芍藥花質(zhì)量與花徑的增加，可能誘導(dǎo)了花莖提供更高的強(qiáng)度來支撐花朵，但這不是花莖變強(qiáng)的主要原因。

植物莖稈的化學(xué)構(gòu)成，特別是細(xì)胞壁組分及其含量與莖稈強(qiáng)度之間有著緊密聯(lián)系。植物細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠、多糖和蛋白質(zhì)組成，是一個強(qiáng)大的纖維網(wǎng)絡(luò)，為細(xì)胞、組織和整個植物提供機(jī)械支持[23]。在這些組分中，木質(zhì)素通過滲透到纖維素結(jié)構(gòu)之間的空隙中，不僅對維管植物的水分運輸和防御病原體起著至關(guān)重要的作用，而且有利于增強(qiáng)細(xì)胞壁的強(qiáng)度，賦予植物莖稈剛性[24]。大量針對大田作物的研究表明，較高的木質(zhì)素含量是莖稈抗倒伏性的基礎(chǔ)，抑制木質(zhì)素的合成往往會顯著降低植株的莖稈強(qiáng)度，使其倒伏率明顯上升[25-26]。在觀賞花卉非洲菊上，Perik等[27]也發(fā)現(xiàn)較高的木質(zhì)素含量使非洲菊在瓶插時不易彎曲，擁有更長的觀賞期。在本研究中，高花莖強(qiáng)度芍藥品種的花莖木質(zhì)素含量顯著高于低花莖強(qiáng)度品種，木質(zhì)素含量與莖稈強(qiáng)度之間呈顯著正相關(guān)，這與我們前期的研究結(jié)果相一致[16]。光合作用是植物獲得碳水化合物的源泉[28]。植物莖稈碳水化合物的積累與運轉(zhuǎn)受葉片光合能力影響，而充足的碳水化合物為木質(zhì)素的合成提供了碳源，經(jīng)過木質(zhì)素代謝途徑最終聚合成木質(zhì)素，最終決定了植物莖稈的強(qiáng)度[29-30]。如劉婷[31]對大豆的遮陰脅迫中發(fā)現(xiàn)光合能力的降低使得大豆莖稈中碳水化合物蔗糖及木糖含量均顯著減少，最終降低了莖稈中木質(zhì)素含量，抗折力也顯著減弱。在本研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)高花莖強(qiáng)度芍藥品種的光合參數(shù)Pn、Tr、Ci、Gs均明顯高于低花莖強(qiáng)度品種，擁有更強(qiáng)的光合能力，這可能是高花莖強(qiáng)度芍藥品種莖稈具有更高的木質(zhì)素含量的碳源基礎(chǔ)。

近年來，關(guān)于褪黑素的報道越來越多，人們認(rèn)為植物體從色氨酸代謝到褪黑素一般需要經(jīng)過4個連續(xù)的酶促反應(yīng)，涉及的4個酶分別為色氨酸脫羧酶(tryptophan decarboxylase， TDC， EC 4.1.1.28)、色胺-5-羥化酶(tryptamine 5-hydroxylase， T5H， EC 1.1.13、血清素氮-乙酰轉(zhuǎn)移酶(serotonin nacetyltransferase， SNAT， EC 2.3.1.87)和咖啡酸-氧-甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeic acid O-methyltransferase， COMT， EC2.1.1.68)[32-33]。其中COMT在木質(zhì)素特異代謝途徑中也起著重要的作用，Byeon等[34]推測植物體內(nèi)木質(zhì)素和褪黑素之間存在拮抗或者協(xié)同的關(guān)系?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在不同的植物上褪黑素對于植物體內(nèi)木質(zhì)素合成調(diào)控效應(yīng)不同，如在陸地棉上其上調(diào)了木質(zhì)素合成[17]，而在竹筍與獼猴桃上則產(chǎn)生了抑制作用[35-36]。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)高花莖強(qiáng)度芍藥品種花莖中褪黑素含量均高于低花莖強(qiáng)度品種，同時褪黑素含量與木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)，這表明芍藥花莖褪黑素和木質(zhì)素可能存在協(xié)同作用。此外，大量研究表明，褪黑素能夠保護(hù)葉片葉綠體，促進(jìn)光合作用，增加光合碳化效率[37-38]，這揭示了高花莖強(qiáng)度芍藥莖稈中較高的褪黑素含量還可能導(dǎo)致其具有更高的光合能力，從而促進(jìn)莖稈中木質(zhì)素的合成與積累，最終獲得更高的花莖強(qiáng)度。