張文利，馬 莉，辛 毅，徐躍飛，任 風(fēng)，馬郁芳，2

(1.大連醫(yī)科大學(xué)，2.遼寧省糖生物學(xué)與糖生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116044)

生物信息資源在恥垢分枝桿菌EmbB多克隆抗體制備中的應(yīng)用

張文利1，馬 莉1，辛 毅1，徐躍飛1，任 風(fēng)1，馬郁芳1，2

(1.大連醫(yī)科大學(xué)，2.遼寧省糖生物學(xué)與糖生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116044)

目的 建立通過生物信息學(xué)手段制備恥垢分枝桿菌(M.smegamatis)EmbB(Sm EmbB)多克隆抗體的方法。方法 應(yīng)用生物信息資源在Sm EmbB的N端尋找一段18個(gè)氨基酸的特異短肽，合成后將其與白喉類毒素分子相連，以所形成的復(fù)合物免疫動(dòng)物制備抗Sm EmbB的多克隆抗體。結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示獲得的抗體可特異地作用于Sm EmbB。結(jié)論 通過生物信息學(xué)手段制備多克隆抗體方法的建立解決了對(duì)蛋白質(zhì)功能研究中缺乏抗體的困擾，為特殊蛋白質(zhì)的抗體制備提供了借鑒。

恥垢分枝桿菌;EmbB;生物信息;多克隆抗體

細(xì)胞壁是分枝桿菌所特有的結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)菌的生命、形態(tài)、毒性傳播等非常重要。分枝桿菌細(xì)胞壁中具有兩種主要成分［1-2］，即 mAGP(mycolic acid-arabinogalactan-petidoglycan)和LAM(lipoarabinomannan)。mAGP是由分枝菌酸、阿拉伯聚糖半乳聚糖和肽聚糖三種成分組成，是細(xì)胞壁的核心成分，直接影響了細(xì)胞壁的完整性。LAM為分枝桿菌細(xì)胞壁中另一種主要成分，主要由與細(xì)胞質(zhì)膜相連的肌醇脂、甘露聚糖和阿拉伯聚糖三種成分組成，它與細(xì)菌的生命形態(tài)沒有直接相關(guān)性，但與細(xì)菌導(dǎo)致的免疫應(yīng)答及毒性傳播等有關(guān)。阿拉伯聚糖是細(xì)胞壁中兩種主要成分中共有的重要組成成分，在維持細(xì)胞壁的完整性及毒性方面起著重要作用。阿拉伯聚糖的生物合成是由多種糖基轉(zhuǎn)移酶參與完成的，目前已知有五種糖基轉(zhuǎn)移酶，即 EmbA、EmbB、EmbC、AftA和Rv1805，參與了分枝桿菌細(xì)胞壁中阿拉伯聚糖的生物合成［3-6］。其中EmbB和EmbA共同負(fù)責(zé)聚阿拉伯糖末端分支的合成［6-7］，具體功能與機(jī)制正在研究中。此外，EmbB也和抗結(jié)核藥物乙胺丁醇的耐藥菌株產(chǎn)生有關(guān)，資料表明EmbB基因的突變可導(dǎo)致抗乙胺丁醇耐藥菌株產(chǎn)生［8-10］。

EmbB在保持細(xì)菌細(xì)胞壁完整性、免疫以及抗結(jié)核藥物耐受性方面的影響，使其研究意義日益凸顯。但是，目前從蛋白質(zhì)水平對(duì)其研究甚少，一方面是由于市場(chǎng)上尚無針對(duì)分枝桿菌EmbB的特異性抗體出售;另一方面，由于EmbB為膜蛋白，且分子質(zhì)量大，表達(dá)很困難，迄今為止沒有表達(dá)并純化的Em-bB蛋白產(chǎn)生，因而也不能通過表達(dá)純化的蛋白免疫動(dòng)物而獲得其相應(yīng)的抗體。抗體的缺乏限制了對(duì)它的研究，目前只能借助一系列的化學(xué)分析手段，分析蛋白質(zhì)缺失后對(duì)聚阿拉伯糖結(jié)構(gòu)變化的影響。然而由于聚糖結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜和相似，現(xiàn)有的分析手段對(duì)它的分析也是有限的。基于此，本文以恥垢分枝桿菌(M.smegamatis，Sm)的 EmbB(Sm EmbB)作為研究對(duì)象，采用一種新的方法去獲得Sm EmbB的抗體:即應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，在Sm EmbB上尋找一段特異的約20個(gè)氨基酸的短肽，將其與一個(gè)大的免疫源片斷連接，進(jìn)而以此免疫復(fù)合物免疫動(dòng)物而獲得抗Sm EmbB的多克隆抗體。

1 材料

瓊脂糖和LB培養(yǎng)基(Invitrogen/GIBCO公司);卡那霉素和潮霉素(Sigma公司);預(yù)染的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Fermentas公司);硝酸纖維素膜(Pall公司);偶聯(lián)堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG抗體(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司);5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)、氮藍(lán)四唑鹽酸鹽(NBT)(Roche公司)。

高速低溫離心機(jī)和超速低溫離心機(jī)(美國貝克曼公司);JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(寧波海曙科生儀器廠);JM-250型電泳儀、MV-Ⅱ型垂直板電泳槽、ST-2型半干式轉(zhuǎn)移電泳儀(大連競(jìng)邁生物科技有限公司)。

清潔級(jí)8～12周齡雌性非孕 Balb/C小鼠，大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(遼)2008-0002。

2 方法

2.1 預(yù)測(cè) EmbB 蛋白

從專業(yè)的微生物基因組數(shù)據(jù)庫(TIGR)中獲取Sm EmbB序列信息，利用各種生物信息學(xué)資源對(duì)Sm EmbB進(jìn)行預(yù)測(cè)，包括二級(jí)結(jié)構(gòu)及模序預(yù)測(cè)、跨膜情況分析、序列的相似性比對(duì)分析，從而確定候選的短肽序列，計(jì)算候選肽段的疏水性參數(shù)，在整個(gè)基因組中進(jìn)行相似性分析，并最終確定該短肽。短肽的合理設(shè)計(jì)與正確的選擇對(duì)于制備有效而特異的Sm EmbB抗體是非常關(guān)鍵的。

2.2 短肽復(fù)合物的合成及抗血清的獲取

將已選擇的短肽進(jìn)行人工合成，并通過橋接分子馬來酸咪唑葵?；?N-羥琥珀酰亞胺與大分子化合物白喉類毒素相連接形成可用于免疫動(dòng)物的大分子復(fù)合物;選用生長(zhǎng)狀態(tài)良好的8～12周齡雌性非孕Balb/C小鼠，用含有人工合成短肽的大分子復(fù)合物對(duì)小鼠進(jìn)行免疫注射，共免疫3次，每隔2周再加強(qiáng)免疫注射1次，1周后采用摘眼球法采集血液，將抗血清在－20℃冰箱保存。

取血后，分離血清并用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定抗血清的滴度，以合成的含有Sm EmbB N端約20個(gè)氨基酸的短肽復(fù)合物包被ELISA板過夜，洗滌后加入獲得的抗血清孵育2 h，洗滌之后加入堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠 IgG抗體進(jìn)行孵育，之后以4-硝基苯磷酸二鈉顯色并測(cè)定其在405 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

2.3 抗血清特異性鑒定

2.3.1 菌株及其生長(zhǎng)條件 實(shí)驗(yàn)過程中所用到的embA基因敲除(ΔembA)、embB基因敲除(ΔembB)和embC基因敲除(ΔembC)的Sm菌株(M.smegmatis mc2155)均生長(zhǎng)在含有25μg/mL那霉素的LB液體或固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。攜帶表達(dá)有野生型Sm embB基因及具有點(diǎn)突變的Sm embB基因的embB基因敲除的Sm菌株則生長(zhǎng)在含有25μg/m卡那霉素和50μg/mL潮霉素的LB液體或固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。野生型Sm則生長(zhǎng)在不含有任何抗生素的LB液體或固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。

2.3.2 膜蛋白的提取及 Western Blot鑒定 生長(zhǎng)并收獲至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的上述相應(yīng)的Sm菌液2 L，用超聲方法破碎細(xì)菌(工作60 s，間歇90 s，10個(gè)循環(huán))后，4℃，15 000 r/min離心1 h收集上清;在4℃，55 000 r/min離心上清 2 h，沉淀即為細(xì)胞膜蛋白;用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，取膜蛋白樣品50μg進(jìn)行10% ～20%梯度SDS-PAGE電泳，電泳完畢后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，應(yīng)用免疫小鼠獲得的抗血清進(jìn)行免疫印記顯色。以含有引入了野生型embB基因及其embB點(diǎn)突變的Sm以及野生型的Sm，embA、embB、embC基因敲除的Sm以及野生型Sm為樣品，對(duì)免疫血清的特異性進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 對(duì)EmbB蛋白的預(yù)測(cè)

從 TIGR 基因組數(shù)據(jù)庫(http://cmr.jcvi.org/cgi-bin/CMR/CmrHomePage.cgi)中獲取 Sm EmbB蛋白序列，它是由1 093個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為117.978 kD。對(duì)所獲得的EmbB氨基酸序列進(jìn)行下面的分析:① 膜蛋白情況分析。首先將此序列在SOSUI等網(wǎng)站上對(duì)其進(jìn)行跨膜分析，如圖1所示，Sm EmbB為跨膜蛋白，有13個(gè)跨膜區(qū)，根據(jù)圖1的序列信息將跨膜區(qū)標(biāo)出，如圖2所示被方框所框的斜體灰色部分所示。膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域多由一些疏水性的氨基酸組成，故這些結(jié)構(gòu)域的部分不能作為短肽的候選部分;② 相似性分析。對(duì)Sm EmbB序列分析表明，它與另外兩種阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶Sm EmbA和Sm EmbC同源性很高，因而分別從TIGR上獲取Sm EmbA和Sm EmbC的氨基酸序列，并將這三種基因間進(jìn)行相似性比對(duì)分析，將大約20個(gè)氨基酸且序列相似性低的部分標(biāo)出(圖2中下劃線部分);③計(jì)算疏水性參數(shù)。計(jì)算被選中的短肽中的氨基酸疏水性參數(shù)，選取其中極性大的肽段作為候選;④BLAST分析。將候選肽段在TIGR中對(duì)所有基因組進(jìn)行相似性比對(duì)分析，選取其中沒有與其它基因組具有相似性或相似性很低的肽段。通過一系列的分析、預(yù)測(cè)，位于Sm EmbB氨基端、背景為灰色加重表示的18個(gè)氨基酸的肽段“SGEDAGKLQRTGYPDPNL”被選擇(如圖2所示)，送該肽段序列到生物公司進(jìn)行化學(xué)合成和拼接。

圖1 SOSUI網(wǎng)站對(duì)EmbB膜蛋白的預(yù)測(cè)Fig.1 The prediction of EmbB by SOSUI

圖2 Sm EmbB跨膜結(jié)構(gòu)分析以及可能的短肽候選序列Fig.2 The analysis on trans-membrane region and possible peptide candidates of Sm EmbB

3.2 Western blot方法鑒定多克隆抗體

應(yīng)用合成的短肽復(fù)合物免疫小鼠，獲得血清;應(yīng)用ELISA方法測(cè)定抗血清的抗體滴度，選用1∶2 000的稀釋抗體進(jìn)行后續(xù)的抗體特異性驗(yàn)證。

本研究中設(shè)計(jì)并合成的小分子短肽，由于分子質(zhì)量小，不足以激起機(jī)體的免疫應(yīng)答，因而將其與一個(gè)大分子的白喉類毒素相拼接，借助于白喉類毒素的免疫應(yīng)答作用而產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。由于白喉類毒素的分子質(zhì)量很大，為避免短肽結(jié)構(gòu)的抗原決定簇被白喉類毒素覆蓋，本研究中應(yīng)用了馬來酸咪唑葵酰基-N-羥琥珀酰亞胺作為橋接的“分子臂”而將兩段肽段連接，希望目的短肽能隨著白喉類毒素的免疫應(yīng)答作用而能產(chǎn)生相應(yīng)的目的抗體。上述ELISA檢測(cè)確認(rèn)有相應(yīng)的抗血清產(chǎn)生，但產(chǎn)生的抗血清是否能特異地作用于Sm EmbB，仍需進(jìn)一步的證實(shí)。本研究中應(yīng)用Western blot方法對(duì)其進(jìn)行確認(rèn)。

提取各種相關(guān)Sm的膜蛋白，用10% ～20%SDS-PAGE梯度膠進(jìn)行電泳，電泳完畢后將其從SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用獲得的血清作為抗體對(duì)膜進(jìn)行孵育，之后用偶聯(lián)有堿性磷酸酶的抗鼠IgG孵育，并用NBT/BCIP顯色。結(jié)果如圖3所示。從圖3中可知，野生型的Sm在約120 kD附近都有一條較弱的的條帶產(chǎn)生，與預(yù)期的Sm EmbB蛋白的大小(117.978 kD)一致，這是來自于基因組上Sm EmbB蛋白的表達(dá);而此120 kD處的條帶在embB基因敲除的菌株內(nèi)不能被檢測(cè)出，這與預(yù)期的結(jié)果一致，同時(shí)也說明本研究室所獲得的embB基因敲除的菌株內(nèi)Sm EmbB確已不存在;當(dāng)在embB基因敲除的恥垢分枝桿菌中引入功能性或點(diǎn)突變的Sm的embB基因，由于表達(dá)載體上強(qiáng)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)(上述的基因均構(gòu)建在pVV16載體上，這些基因的表達(dá)均受到pVV16上強(qiáng)啟動(dòng)子-Phs60的驅(qū)動(dòng)，可產(chǎn)生過表達(dá)的基因產(chǎn)物)，使Sm EmbB蛋白過表達(dá)，其表達(dá)量明顯多于細(xì)菌體內(nèi)的自然狀態(tài)，故在120 kD附近都有明顯的條帶產(chǎn)生;但從圖3結(jié)果中可見，除了在120 kD附近的條帶之外，在小分子的位置也有其它條帶被檢出，但條帶的強(qiáng)度較弱，這是由于由小鼠抗血清得到的抗體為多克隆抗體(霍亂類毒素也能產(chǎn)生其相應(yīng)的抗體)，因而也能與其它的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)色反應(yīng)，但是從Western blot的結(jié)果可知，在120 kD附近的條帶強(qiáng)度隨著自然狀態(tài)的Sm EmbB或過表達(dá)的Sm EmbB的有無而表現(xiàn)出有無或強(qiáng)弱，故可說明該抗體能特異地作用于Sm EmbB。因此，盡管有非特異條帶的存在，仍不影響對(duì)該抗體能夠特異性作用于Sm EmbB蛋白的認(rèn)定。通過Western blot方法的檢測(cè)，可確認(rèn)通過用生物信息資源獲得的Sm EmbB短肽，通過與大分子的霍亂類毒素連接后，能夠免疫動(dòng)物而獲得能作用于Sm EmbB的多克隆抗體，并可將此抗體用于對(duì)Sm EmbB蛋白的研究。

圖3 應(yīng)用 Western blot對(duì)EmbB多克隆抗體的鑒定(膜蛋白樣品均來自于相應(yīng)的Sm)Fig.3 Identification of EmbB polycolonal antibody by Western blot analysis(Lane 1-6 are membrane proteins from M.smegmatis)

目前也可通過基因克隆的方法制備多克隆抗體［11］。即將目的蛋白克隆并表達(dá)，經(jīng)親和色譜純化后作為免疫源去免疫動(dòng)物而得到相應(yīng)的多克隆抗體。在本研究中免疫的后續(xù)過程是與通過基因工程的方法獲取多克隆抗體是一致的，但不同在于免疫源的制備。本研究中的對(duì)象為Sm中的EmbB蛋白，它分子質(zhì)量大，且具有超過10次的跨膜結(jié)構(gòu)域，因而它的表達(dá)是非常困難的。事實(shí)上，我們也嘗試過不同的表達(dá)載體和表達(dá)菌株，但即使在包涵體中也沒有能檢測(cè)到含有EmbB的融合蛋白的表達(dá)，因而也不可能通過上述基因工程的方法獲得相應(yīng)的多克隆抗體?；诖耍狙芯恐袊L試選取Sm EmbB蛋白中一小段有特異性的肽，人工合成這段小肽，并將其與一個(gè)大分子物質(zhì)相連接而構(gòu)建出具有免疫源性的復(fù)合物，去制備相應(yīng)的抗體，并成功獲得了抗Sm EmbB抗體。

4 結(jié)論

本文應(yīng)用生物信息資源在Sm EmbB的N端上尋找一段特異性的短肽，并基于此短肽制備它的多克隆抗體。Sm EmbB蛋白多克隆抗體的成功產(chǎn)生，不僅為對(duì)Sm EmbB的研究提供了有利的工具，同時(shí)也為對(duì)其它缺乏特異性抗體的蛋白質(zhì)的研究提供了新思路:即可利用生物信息手段在研究對(duì)象上尋找一段特異的短肽，依據(jù)此短肽獲得它相應(yīng)的多克隆抗體。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，蛋白質(zhì)功能的重要性已經(jīng)越來越為人們所重視，因此對(duì)蛋白質(zhì)的直接研究尤為重要。而對(duì)于功能未知的、新的蛋白質(zhì)的研究，能夠擁有特異性檢測(cè)它的抗體是非常重要的，且是很必要的;特別是不能通過基因操作技術(shù)而得到表達(dá)的這樣一類蛋白質(zhì)，經(jīng)常由于缺少相應(yīng)的特異性抗體而限制了對(duì)它的研究。在此，本文建立了這種新的抗體制備方法，解決了對(duì)一些蛋白質(zhì)功能研究中缺乏抗體的困擾，為在蛋白質(zhì)水平的研究提供了新的思路和手段。雖然本文制備的是Sm EmbB的多克隆抗體，但相信對(duì)其它蛋白質(zhì)的抗體制備也有一定的指導(dǎo)和借鑒意義。

［1］Brennan PJ.Structure，function，and biogenesis of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis［J］.Tuberculosis(Edinb)，2003，83(1-3):91-97.

［2］Brennan P J，Nikaido H.The envelope of mycobacteria［J］.Annu Rev Biochem，1995，64:29-63.

［3］Alderwick L J，Radmacher E，Seidel M，et al.Deletion of Cg-emb in corynebacterianeae leads to a novel truncated cell wall arabinogalactan，whereas inactivation of Cg-ubiA results in an arabinan-deficient mutant with a cell wall galactan core［J］.JBiol Chem，2005，280(37):32362-32371.

［4］Alderwick L J，Seidel M，Sahm H，et al.Identification of a novel arabinofuranosyltransferase(AftA)involved in cell wall arabinan biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis［J］.J Biol Chem，2006，281(23):15653-15661.

［5］Berg S，Starbuck J，Torrelles J B，et al.Roles of conserved proline and glycosyltransferase motifs of EmbCin biosynthesis of lipoarabinomannan［J］.J Biol Chem，2005，280(7):5651-5663.

［6］Escuyer V E，Lety M A，Torrelles J B，et al.The role of the emb A and embB gene products in the biosynthesis of the terminal hexaarabinofuranosyl motif of Mycobacterium smegmatis arabinogalactan［J］.J Biol Chem，2001，276(52):48854-48862.

［7］Belanger A E，Besra G S，F(xiàn)ord M E，et al.The embAB genes of Mycobacterium avium encode an arabinosyl transferase involved in cell wall arabinan biosynthesis that is the target for the antimycobacterial drug ethambutol［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(21):11919-11924.

［8］Alcaide F，Pfyffer G E，Telenti A.Role of embB in natural and acquired resistance to ethambutol in Mycobacteria［J］.Antimicrob A-gents Chemother，1997，41(10):2270-2273.

［9］Plinke C，Rüsch-Gerdes S，Niemann S.Significance of mutations in embB codon 306 for prediction of ethambutol resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates［J］.Antimicrob Agents Chemother 2006，50(5):1900-1902.

［10］ Sreevatsan S，Stockbauer K E，Pan X，et al.Ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis:Critical role of embB mutations［J］.Antimicrob Agents Chemother，1997，41(8):1677-1681.

［11］張文利，申 慧，辛 毅，等.恥垢分枝桿菌glmU基因克隆、表達(dá)及多克隆抗體的制備［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2008，24(6):601-603.

Application of bioinformation in achieving polycolonal antibody of EmbB in M.smegmatis

ZHANG Wen-li1，MA Li1，XIN Yi1，XU Yue-fei1，REN Feng1，MA Yu-fang1，2
(1.Dalian Medical University，2.Glycobiology and Glycoengineering Key Lab of Liaoning Province，Dalian 116044，China)

Purpose To build up a new method to make polycolonal antibody of EmbB in M.smegmatis by utilizing bioinformation resource.Methods A peptide of Sm EmbB with 18 amino acids was designed based on to the analysis of bioinformation，and linked with Diphtheria Toxoid to form a complex which was utilized to immune mouse for getting Sm EmbB's polycolonal antibody.Results The antibody achieved can work on Sm EmbB well with being identified by Western blot.Conclusion This method can provide a new point of view to obtain polycolonal antibody for a certain protein without antibody available.

M.smegmatis;EmbB;bioinformation;polycolonal antibody

Q785

A

1005-1678(2012)06-0732-04

2011-12-07

遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(LT2010026)

張文利，女，副教授，微生物的糖生物化學(xué)及分子生物學(xué)，Tel:0411-86110312，E-mail:zhwenli2004@yahoo.com.cn; 馬郁芳，通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，Tel:0411-86110338，E-mail:yufang_ma@hotmail.com。