劉金鳳，周 宇，楊武雙，馬 昂，鄭城微，勵(lì)佳憶，金 鑫

(1．廈門市中醫(yī)院 藥劑科，2．廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，3．廈門市中醫(yī)院 神經(jīng)外科，福建 廈門 361009)

油酰乙醇胺在小鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制

劉金鳳1，周 宇2，楊武雙3，馬 昂2，鄭城微2，勵(lì)佳憶2，金 鑫2

(1．廈門市中醫(yī)院 藥劑科，2．廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，3．廈門市中醫(yī)院 神經(jīng)外科，福建 廈門 361009)

目的 研究油酰乙醇胺(OEA)在腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制。方法 線栓法制備小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，缺血90 min后再灌注。應(yīng)用HPLC-MS/MS方法測(cè)定腦組織內(nèi)OEA的含量。給予OEA(5，10，40 mg/kg，ig)或OEA水解酶抑制劑URB597(1 mg/kg，ig)，觀察其對(duì)小鼠急性腦缺血再灌注損傷的影響。測(cè)定腦組織丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)的活性。觀察MK886對(duì)OEA抗脂質(zhì)過氧化損傷的影響。結(jié)果 腦缺血再灌注后6 h，損傷側(cè)腦內(nèi)OEA含量開始升高，再灌注后24 h升高最明顯。腦缺血再灌注后給予OEA(40 mg/kg)或URB597(1 mg/kg)可減少神經(jīng)功能缺失評(píng)分，減小腦梗死體積，減輕腦水腫程度。OEA可減少腦內(nèi)MDA含量，增加抗氧化酶SOD的活性。OEA這一抗氧化作用可被MK886所取消。結(jié)論 腦缺血再灌注可增加腦內(nèi)OEA的含量，OEA通過激動(dòng)PPARα，減輕脂質(zhì)過氧化損傷發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷作用。

油酰乙醇胺;腦缺血;再灌注損傷;脂質(zhì)過氧化

油酰乙醇胺(oleoylethanolamide，OEA)是一種內(nèi)源性脂質(zhì)分子，對(duì)腦缺血再灌注損傷具有治療作用，OEA(20，40 mg/kg)術(shù)前多次給藥及OEA(40 mg/kg)缺血前0．5 h或再灌注同時(shí)單次給藥可明顯改善小鼠神經(jīng)功能損傷，減小腦梗死體積和減輕腦水腫程度［1］。本研究在小鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷模型上，測(cè)定腦內(nèi)OEA的含量，并觀察外源性給予OEA或OEA水解酶抑制劑URB597對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用，并從氧化應(yīng)激的角度來探討OEA抗腦缺血再灌注損傷的可能機(jī)制。

1 材料

OEA及10-十一烯酰乙醇胺(內(nèi)標(biāo))由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院合成;URB597、MK886，美國(guó) Cayman Chemical公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

HP 1200高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司;Qtrap 3200質(zhì)譜儀，美國(guó)AB公司。

健康昆明種小鼠，♂，體重25～30 g，由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SYXK(閩)2008-0003。自然光照周期飼養(yǎng)，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。

2 方法

2．1 小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型制備

線拴法制備小鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型［2］，缺血90 min后拔出線栓，即形成再灌注，動(dòng)物術(shù)中及術(shù)后麻醉清醒前給予保溫，動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)對(duì)側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙即為模型制備成功。

2．2 動(dòng)物分組及給藥

為測(cè)定腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)腦內(nèi)OEA的含量，小鼠隨即分為6組:①假手術(shù)組(sham組):僅手術(shù)暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，不做缺血處理;②～⑥再灌注組:制模后缺血90 min后分別再灌注 1，3，6，12 和24 h。

為評(píng)價(jià)OEA及URB597對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的影響，小鼠隨機(jī)分為6組:①假手術(shù)組(sham組);②溶媒組(vehicle組):制模后缺血90 min后再灌注;③ ～⑤OEA 給藥組(O5、O10、O40組):腦缺血再灌注同時(shí)及再灌注后2 h，分別給予OEA 5，10，40 mg/kg灌胃;⑥URB597給藥組(U1組):腦缺血再灌注同時(shí)及再灌注后2 h，給予URB597 1 mg/kg灌胃。

為研究OEA抗腦缺血再灌注損傷作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組:①假手術(shù)組(sham組);②溶媒組(vehicle組);③OEA給藥組(O40組):腦缺血再灌注同時(shí)及再灌注后2 h，給予OEA 40 mg/kg;④MK886干預(yù)組(MK+O40組):在灌胃給予OEA(40 mg/kg)前30 min灌胃給予MK886 10 mg/kg。OEA及MK886臨用前用10%吐溫80生理鹽水配成相應(yīng)的濃度，按10 mL/kg灌胃給藥。假手術(shù)組和溶媒組以相同的方式給予相應(yīng)的溶媒。

2．3 HPLC-MS/MS法測(cè)定腦內(nèi)OEA含量

2．3．1 腦組織樣本制備 腦缺血90 min，再灌注后1，3，6，12 和24 h，在冰上快速分離出損傷側(cè)及損傷對(duì)照側(cè)腦組織，漂洗，稱重，測(cè)定前每100 mg組織加入含有內(nèi)標(biāo)的生理鹽水1 μL，用勻漿機(jī)制備腦組織勻漿，加入丙酮沉淀蛋白，4℃，離心10 min，取上清，N2吹干后，加入萃取液200 μL提取脂質(zhì)，取下層有機(jī)相，N2吹干氯仿，分析前樣品用甲醇100 μL復(fù)溶進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

2．3．2 HPLC-MS/MS 分析 參考已報(bào)道的方法［3］略加改進(jìn)，應(yīng)用HP 1200高效液相儀聯(lián)用3200 Q TRAP質(zhì)譜儀系統(tǒng)進(jìn)行OEA含量的測(cè)定，色譜柱采用 ODS-2 HYPERSIL C18柱(150 mm × 4．6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為水和甲醇，采用大氣壓化學(xué)電離正離子掃描方式，多反應(yīng)檢測(cè)模式檢測(cè)，應(yīng)用analyst 1．4．1分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和分析。

2．4 腦損傷的評(píng)價(jià)

2．4．1 神經(jīng)功能缺失評(píng)分 腦缺血后再灌注24 h、給予URB597 1 mg/kg及OEA 40 mg/kg再灌注后參照Longer 5分法［4］進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分。

2．4．2 腦梗死灶體積及腦水腫的測(cè)定 小鼠再灌注24 h和URB597 1 mg/kg再灌注后取腦，切成2 mm厚切片，將切片置于1%TTC溶液中避光37℃恒溫孵育20 min，4%多聚甲醛溶液中避光固定24 h后，應(yīng)用圖像分析處理軟件計(jì)算腦梗死體積及腦半球體積的近似值。

2．5 腦組織MDA含量及SOD、CAT活性的測(cè)定

腦缺血再灌注后24 h，取缺血側(cè)腦組織，用冰生理鹽水制成10%腦組織勻漿，離心取上清，置于－80℃保存，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，CAT活性采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定組織蛋白含量。

2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以(x±s)表示，采用 Prism 4 for windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較用單因素方差分析，當(dāng)方差分析有顯著性差異時(shí)，進(jìn)一步用q檢驗(yàn)作兩兩比較。

3 結(jié)果

3．1 腦缺血再灌后不同時(shí)間點(diǎn)腦內(nèi)OEA含量的變化

腦缺血再灌注后6 h，腦組織內(nèi)OEA的含量較對(duì)照側(cè)有升高趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;再灌注后12和24h，損傷側(cè)腦組織內(nèi)OEA含量較非損傷側(cè)明顯升高，分別升高達(dá)4和5倍。在腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)，非損傷側(cè)腦組織內(nèi)OEA含量沒有明顯變化。見圖1。

與損傷對(duì)側(cè)比較:1P ＜0．05，2P＜0．01Compared with injury contralateral:1P ＜0．05，2P ＜0．01

3．2 OEA及URB597對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的作用

腦缺血再灌后24 h，小鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，神經(jīng)功能缺失評(píng)分較假手術(shù)組明顯升高，URB597 1 mg/kg及OEA 40 mg/kg再灌注后給藥可減少神經(jīng)功能缺失評(píng)分(圖2A)。OEA 5和10 mg/kg無效，呈劑量依賴性。

腦缺血再灌注后24 h，損傷側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯的蒼白梗死灶和腦水腫，OEA 10，40 mg/kg再灌注后給藥可減小腦梗死和減輕腦水腫程度，OEA 5 mg/kg無效，呈劑量依賴性。URB597 1 mg/kg再灌注后給藥可明顯減小腦梗死體積，減輕腦水腫程度，與溶媒組相比降低腦梗死體積達(dá)90%(圖2B)，減輕水腫程度達(dá)80．4%(圖2C)。

3．3 OEA對(duì)腦內(nèi)MDA含量及SOD、CAT活性的影響

圖2 OEA及URB597對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺失評(píng)分(A)，腦梗死體積(B)，腦水腫程度(C)的影響(x ± s，n=8)Fig．2 Effect of OEA and URB597 on neurological deficit score(A)，infarct volume(B)and brain edema degree(C)after focal cerebral ischemia reperfusion in mice(x ± s，n=8)

腦缺血再灌注后24 h，小鼠腦組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物MDA含量明顯增加，SOD和CAT活性降低，OEA(40 mg/kg)腦缺血再灌注后給藥可降低腦內(nèi)MDA含量，提高SOD活性，對(duì)CAT活性無影響，MK886可阻斷OEA的抗脂質(zhì)過氧化損傷作用(表1)。

表1 OEA對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注后腦內(nèi)MDA含量，SOD和CAT活性的影響(x ± s，n=8)Tab．1 Effect of OEA on MDA content，SOD and CAT activity in brain tissue after focal cerebral ischemia reperfusion in mice(x ± s，n=8)

4 討論

我們研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后6 h，損傷側(cè)腦組織內(nèi)OEA含量開始增加，再灌注后24 h升高最明顯，而損傷對(duì)側(cè)腦組織OEA含量無明顯改變，提示腦缺血再灌注可升高腦內(nèi)OEA的水平，外源性給予OEA或應(yīng)用URB597(選擇性脂肪酸氨基水解酶抑制劑)內(nèi)源性增加腦內(nèi)OEA水平，可減輕大鼠神經(jīng)功能缺失，減小腦梗死體積，減輕腦水腫程度，對(duì)急性腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，腦缺血再灌注后損傷側(cè)腦組織內(nèi)OEA含量的升高可能和OEA的合成增加或降解減少有關(guān)。具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

通過外源性給予OEA及內(nèi)源性增加OEA水平來研究OEA在腦缺血再灌注中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后外源性給予OEA，劑量依賴性的發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷作用，最佳劑量為40 mg/kg，URB597可上調(diào)腦內(nèi)OEA水平，進(jìn)而產(chǎn)生一系列中樞效應(yīng)，如加強(qiáng)小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能［5］，促進(jìn)大鼠維持覺醒狀態(tài)［6］。我們的研究表明URB597再灌注后給藥與OEA類似，亦可發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷作用，并且比OEA具有更好的效果，只需1 mg/kg就可發(fā)揮類似的作用。

我們的研究結(jié)果還表明，OEA抗腦缺血再灌注損傷可能和其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)，氧化應(yīng)激損傷是急性腦卒中造成腦水腫和腦梗死的重要機(jī)制。腦缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生大量的自由基，而體內(nèi)SOD、CAT等抗氧化酶活性下降，導(dǎo)致氧自由基大量堆積，進(jìn)一步加重腦損傷［7］。OEA在發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷的同時(shí)，可明顯降低腦組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，提高SOD的活性，可對(duì)抗腦組織的脂質(zhì)過氧化損傷。PPARα拮抗劑MK886可取消OEA的抗氧化作用，說明OEA的抗氧化作用和其激動(dòng)PPARα相關(guān)。

總之，OEA對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與激動(dòng)PPARα，提高抗氧化酶活性，減輕腦缺血再灌注引起的脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)，外源性給予OEA或內(nèi)源性增加腦內(nèi)OEA可能是治療急性腦卒中的一條新的途徑。

［1］ 楊立朝，楊武雙，周 宇，等．油酰乙醇胺對(duì)小鼠局灶性腦缺血的保護(hù)作用［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(9):1219-1223．

［2］ Mao Y，Yang G Y，Zhou L F，et al．Focal cerebral ischemia in the mouse:description of a model and effects of permanent and temporary occlusion［J］．Brain Res Mol Brain Res，1999，63(2):366-370．

［3］ 鄭城微，金 鑫，沈燕慧，等．液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)大鼠體內(nèi)s-油酰丙醇胺的組織分布研究［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46(8):962-967

［4］ Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20(1):84-91．

［5］ Mazzola C，Medalie J，Scherma M，et al．Fatty acid amide hydrolase(FAAH)inhibition enhances memory acquisition through activation of PPAR-alpha nuclear receptors［J］．Learn Mem，2009，16(5):332-337．

［6］ Murillo-Rodriguez E，Palomero-Rivero M，Millan-Aldaco D，et al．Administration of URB597，oleoylethanolamide or palmitoylethanolamide increases waking and dopamine in rats［J］．PLoS One，2011，6(7):e20766．

［7］ Chrissobolis S，Miller a A，Drummond G R，et al．Oxidative stress and endothelial dysfunction in cerebrovascular disease［J］．Front Biosci，2011，16:1733-1745．

The protective effect of oleoylethanolamide on acute focal cerebral ischemia/reperfusion injury in mice and its mechanism

LIU Jin-feng1，ZHOU Yu2，YANG Wu-shuang3，MA Ang2，ZHENG Cheng-wei2，LI Jia-yi2，JIN Xin2
(1．Department of Pharmacy，Xiamen TCM Hospital，2．Faculty of Basic Medicine，Medical School，Xiamen University，3．Department of Neurosurgery，Xiamen TCM Hospital，Xiamen 361009，China)

Purpose To investigate the role of oleoylethanolamide(OEA)in focal cerebral ischemia reperfusion injury，and to illustrate its possible mechanisms．Methods Focal cerebral ischemia was induced by middle cerebral artery occlusion in mice for 90 min and then reperfusion．The contents of OEA in brain tissue following cerebral ischemia reperfusion were measured by HPLC-MS/MS．OEA(5，10，40 mg/kg)and URB597(1 mg/kg)were intragastrically administered at the sa me time of reperfusion and2 h after reperfusion respectively．The neurological deficit score，infarct volume and brain edema degree were determined 24 h after reperfusion．The contents of maiondialdehyde(MDA)and the activity of superoxide dismutase(SOD)and catalase(CAT)in brain tissue were measured．Results OEA content in brain tissue increased 6 h after reperfusion and markedly increased 24 h after reperfusion．OEA(40 mg/kg)and URB597(1 mg/kg)ameliorated neurological dysfunction，reduced infarct volume，attenuated brain edema degree and decreased the extravasations of EB．OEA(40 mg/kg)increased the activity of SOD and attenuated the lipid peroxidation in brain tissues．MK886 abolished this anti-oxidant effect of OEA．Conclusion The content of OEA in brain tissue increased following focal cerebral ischemia reperfusion in mice．OEA exerts protective effect against acute focal cerebral ischemia reperfusion injury by activating PPARα and reducing lipid peroxidation in brain tissue．

oleoylethanolamide;cerebral ischemia;reperfusion injury;lipid peroxidation

R961

A

1005-1678(2012)06-0758-04

2012-04-30

廈門市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(NO．3502Z20084022)

劉金鳳，女，本科，副主任藥師;楊武雙，通信作者，主任醫(yī)師，Tel:13959213145，E-mail:li200665@126．com。