李明梅

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)

高效液相色譜法測(cè)定麝香風(fēng)濕片中烏頭堿的含量

李明梅

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)

目的 建立麝香風(fēng)濕片中烏頭堿含量的高效液相色譜測(cè)定方法。方法 采用Agilent C18柱(4．6 mm×150 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0．05%磷酸溶液(含 0．04%三乙胺)(68∶32);流速 0．8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):235 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。結(jié)果 烏頭堿在0．200 6～20．06 μg/mL濃度范圍與峰面積呈良好線性關(guān)系，r=0．999 9，最低檢測(cè)限約為2 ng，平均回收率為97．7%。結(jié)論 此方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適合于麝香風(fēng)濕片中烏頭堿的含量測(cè)定。

麝香風(fēng)濕片;烏頭堿;含量測(cè)定;高效液相色譜法

麝香風(fēng)濕片主要由制川烏、全蝎、烏梢蛇、地龍、蜂房、麝香、黑豆等組成，用于風(fēng)濕寒痹，關(guān)節(jié)疼痛，手足拘攣等［1］。其中川烏所含的烏頭堿具有很強(qiáng)毒性［2］。

根據(jù)國(guó)家藥典委員會(huì)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥)提高工作技術(shù)要求(2006．8．29)的規(guī)定，制劑中如果含有有毒成分，尤其是有效劑量與中毒劑量相對(duì)接近的成分，應(yīng)規(guī)定含量上下限。關(guān)于烏頭堿限量及含量測(cè)定的問(wèn)題，如果處方用到的是生川烏、生草烏，必須按要求做限量檢查或含量測(cè)定，并規(guī)定上下限。如果用到的是制川烏、制草烏，附子、附片，外用藥可不做限量檢查。藥材中酯型生物堿的限量檢查的方法不適用于成藥，可建立 HPLC方法測(cè)定烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿，并制訂合理的上下限。

根據(jù)現(xiàn)行的麝香風(fēng)濕片標(biāo)準(zhǔn)，在其檢查項(xiàng)中只列了烏頭堿的限量檢查(薄層色譜法)［1］，并且該限量檢查的上限與2010版藥典有關(guān)制川烏中烏頭堿限量的規(guī)定存在較大的差距。為此，本研究建立了測(cè)定麝香風(fēng)濕片中烏頭堿含量的高效液相色譜(HPLC)法，以便替代限量檢查，對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行更有效地控制。

1 儀器與試藥

G1311A四元高效泵液相測(cè)定儀;G1314B紫外檢測(cè)器;Agilent1200色譜工作站;CS-9301PC薄層掃描儀;Waters2695高效液相色譜儀。

烏頭堿對(duì)照品(批號(hào):110720-200410)，中國(guó)藥品生物制品檢定所;麝香風(fēng)濕片(批號(hào):090102，090325，090428，081217，091120，091207)，汕頭市萊達(dá)制藥有限公司;甲醇、磷酸、三乙胺均為色譜純;其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 溶液配制

2．1．1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 取烏頭堿對(duì)照品約10 mg，精密稱(chēng)定，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。配制的烏頭堿儲(chǔ)備液濃度為2．006 mg/mL。

2．1．2 麝香風(fēng)濕片供試品溶液 取麝香風(fēng)濕片20片，除去包衣，精密稱(chēng)定總量后，將片劑置于研缽中研成細(xì)粉，取約4 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，加氨試液2 mL潤(rùn)濕，再精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL，稱(chēng)定重量，超聲30 min。放冷，再稱(chēng)定重量，用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙獠⒍肯♂屩? mL，微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2．1．3 陰性樣品溶液 按麝香風(fēng)濕片處方［1］，制成缺制川烏的模擬制劑，按2．1．2項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2．2 色譜條件

色譜柱:Agilent C18色譜柱(4．6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0．05%磷酸溶液(含 0．04% 三乙胺)(68∶32);流速:0．8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):235 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)以烏頭堿峰計(jì)在3 000以上。

分別精密量取2．006 μg/mL烏頭堿對(duì)照品溶液、麝香風(fēng)濕片供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。陰性樣品溶液色譜圖中，在烏頭堿對(duì)照品峰相應(yīng)位置無(wú)色譜峰，供試品溶液烏頭堿色譜峰與其相鄰峰能達(dá)到基線分離。其它成分對(duì)烏頭堿含量測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 烏頭堿對(duì)照品溶液(A)、麝香風(fēng)濕片供試品溶液(B)和陰性樣品溶液(C)HPLC圖

2．3 方法學(xué)考察

2．3．1 線性范圍考察 取烏頭堿對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成濃度為0．200 6 ～20．06 μg/mL 的系列對(duì)照品溶液，分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，按2．2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)。以濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:C=6．80×10－4A－2．36 × 10－4，r=0．999 9。結(jié)果表明烏頭堿在0．200 6 ～20．06 μg/mL 濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2．3．2 精密度試驗(yàn) 精密吸取2．006 μg/mL烏頭堿對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，并同時(shí)在兩臺(tái)液相色譜儀上測(cè)定，測(cè)得峰面積RSD(n=6)分別為0．7%和0．6%。結(jié)果表明該方法具有良好的精密度和重復(fù)性。

2．3．3 檢測(cè)限考察 取2．006 μg/mL烏頭堿對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)谛旁氡葹?時(shí)，烏頭堿檢測(cè)限為2 ng。

2．3．4 溶液穩(wěn)定性 試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，烏頭堿對(duì)照品溶液室溫放置不很穩(wěn)定，需在冰箱保存。取麝香風(fēng)濕片供試品溶液(冰箱保存)，分別在 0，2，4，6 h測(cè)定峰面積，RSD為0．31%，可見(jiàn)，冰箱保存時(shí)，供試品溶液至少在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．3．5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的麝香風(fēng)濕片(批號(hào)090325)細(xì)粉適量，精密稱(chēng)定，加烏頭堿對(duì)照品液，照含量測(cè)定方法操作，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。平均回收率為97．7%，RSD為0．54%

表1 烏頭堿加樣回收率的試驗(yàn)結(jié)果

2．4 樣品含量測(cè)定

取麝香風(fēng)濕片，按2．1．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2．2 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，取 2．006 μg/mL烏頭堿對(duì)照品溶液，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算即得。6批麝香風(fēng)濕片(批號(hào):090102，090325，090428，081217，091120，091207)中的烏頭堿的含量分別為 2．18，2．20，2．19，2．31，2．23，2．36 μg/片，平均含量為 2．24 μg/片，RSD 為 3．27%。

3 討論

3．1 溶劑的選擇

［3-5］，曾選擇甲醇、乙醇和二氯甲烷等溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明烏頭類(lèi)生物堿在乙醇中拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，對(duì)稱(chēng)系數(shù)達(dá)不到理想值;在二氯甲烷中比較穩(wěn)定，但在紫外檢測(cè)時(shí)存在極接近的干擾峰，影響目標(biāo)成分的響應(yīng);在甲醇中不穩(wěn)定，但不影響烏頭類(lèi)生物堿的紫外吸收。故本次實(shí)驗(yàn)選用甲醇為溶劑，因?yàn)躅^堿在甲醇溶液中不很穩(wěn)定，故樣品的甲醇溶液不能久置，需盡快測(cè)定，其在0℃冰箱中保存較穩(wěn)定。

3．2 流動(dòng)相的選擇

烏頭堿分子極性較強(qiáng)，比較適合用高效液相色譜分析，常用的流動(dòng)相有甲醇-水-氯仿-三乙胺系統(tǒng)、甲醇-水-氯仿-二乙胺系統(tǒng)和甲醇-水-乙睛系統(tǒng)等。由于本品成分復(fù)雜，經(jīng)文獻(xiàn)查找，0．04%三乙胺可以滿(mǎn)足烏頭堿與雜質(zhì)峰的分離，且得到較好的峰形［6］，并在流動(dòng)相中加入少量酸，可使分離達(dá)到目的，并使流動(dòng)相的 pH值在色譜柱的適合范圍內(nèi)［7］。故選擇了甲醇-0．05%磷酸溶液(含0．04%三乙胺)(68∶32)作為流動(dòng)相，得到了較好的分離效果。

3．3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道烏頭類(lèi)生物堿在230～240 nm下有較大吸收［8］，經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)在235 nm測(cè)定效果最佳，基線也較穩(wěn)定，因此選擇該波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

3．4 提取條件的選擇

樣品的處理:烏頭類(lèi)生物堿的提取采用2010版中國(guó)藥典所用的方法，氨水潤(rùn)濕后用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)提取。由于最后的溶劑選擇了甲醇，因此在最后步驟中采用了超聲使烏頭堿溶解，提高實(shí)驗(yàn)的精確度。

本文建立了麝香風(fēng)濕片中烏頭堿的HPLC測(cè)定方法，測(cè)定了6批麝香風(fēng)濕片中烏頭堿的含量，平均含量為2．24 μg/片，可為麝香風(fēng)濕片中烏頭堿含量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

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Research on the HPLC method for determining the content of aconitine in Shexiang Fengshi tablets

LI Ming-mei
(Yancheng Health Vocational Technical College，Yancheng 224005，China)

Purpose To develop a method for deteminating aconitine in Shexiang Fengshi tablets by HPLC．Methods The Agilent C18(4．6 mm ×150 mm，5 μm)was used．With a mobile phase of methanol-0．05%phosphoric acid solution(contained 0．04%triethylamine)(68∶32)，the flow rate was 0．8 mL/min，the detection wavelength was 235 nm，the column temperature was 30 ℃，and the injection was 10 μL．Results The linearity of peak area was good in the range of 0．200 6-20．06 μg/mL(r=0．999 9)．The average recovery was 97．7%．Conclusion This method is convenient and accurate．The results of experiment were satisfactory．

Shexiang Fengshi tablet;aconitine;determination;HPLC

R927．2

A

1005-1678(2012)06-0836-03

2012-07-12

李明梅，女，副教授，主要研究方向:化學(xué)分析，藥物分析。