何麗君，霍彩霞，楊彩玲，魏玉榮

（蘭州城市學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

絞股藍(lán)皂苷與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜研究

何麗君，霍彩霞，楊彩玲，魏玉榮

（蘭州城市學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

用熒光光譜技術(shù)研究了絞股藍(lán)皂苷與牛血清白蛋白（BSA）在pH＝7.40的Tris－HCl緩沖溶液中的相互作用；通過計(jì)算確定了絞股藍(lán)皂苷與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)，利用熱力學(xué)分析探討了絞股藍(lán)皂苷與BSA之間的結(jié)合方式；同時采用同步熒光技術(shù)考察了絞股藍(lán)皂苷對BSA構(gòu)象的影響.結(jié)果表明，絞股藍(lán)皂苷對牛血清白蛋白的熒光猝滅過程為靜態(tài)猝滅；二者主要靠疏水作用和靜電引力結(jié)合.

絞股藍(lán)皂苷；牛血清白蛋白；相互作用；熒光光譜

血清白蛋白是生物體內(nèi)含量最豐富的運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)，是生物體內(nèi)具有重要生理功能的大分子，并且血液中血清白蛋白濃度長期以來一直是檢驗(yàn)健康和疾病的指標(biāo).研究藥物等小分子物質(zhì)與血清蛋白相互作用的機(jī)理和作用過程，有助于認(rèn)識藥物的運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝過程，在毒理學(xué)、藥代動力學(xué)上有重要意義[1].

絞股藍(lán)皂苷（GPs）是絞股藍(lán)的主要有效成分，含有與人參皂苷結(jié)構(gòu)相同的四環(huán)三萜達(dá)瑪烷，有顯著降血脂、降血糖、平衡血壓、抗癌、抗疲勞、抗缺氧、抗衰老、促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝，強(qiáng)壯補(bǔ)益等作用，且無毒副作用[2].

作者利用熒光光譜技術(shù)，研究了模擬生理?xiàng)l件（pH＝7.40）下GPs與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，從獲得的光譜數(shù)據(jù)分析了它們的作用機(jī)理，鍵合常數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)及GPs對蛋白質(zhì)微環(huán)境的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

RF－5301PC型熒光分光光度計(jì)（日本，島津公司）、pHS－TP型酸度計(jì)，HH－S型恒溫水浴鍋.

牛血清白蛋白（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司），絞股藍(lán)皂苷（中國藥品生物制品檢定所），pH＝7.40的Tris－HCl緩沖溶液.Tris、HCl、氯化鈉等均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

以Tris－HCl緩沖溶液分別配制2.0×10－5mol·L－1的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液和3.9×10－4mol·L－1的絞股藍(lán)皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液都在4℃冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)所用溶液由此標(biāo)準(zhǔn)溶液配制而得.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光光譜測定

移取一定量的BSA溶液于1cm石英比色皿中，用微量進(jìn)樣器分別注入不同體積的GPs溶液.以280 nm為激發(fā)波長，在熒光分光光度計(jì)上記錄290～450nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜.

1.2.2 熒光滴定實(shí)驗(yàn)

移取1.997 6×10－6mol·L－1的BSA溶液3mL于1cm石英比色皿中，用微量進(jìn)樣器分別注入不同體積的GPs溶液，累加體積＜150μL，反應(yīng)時間為8min.以280nm為激發(fā)波長，在熒光分光光度計(jì)上分別記錄不同溫度下，290～450nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜.

1.2.3 同步熒光測定

改變發(fā)射波長λem與激發(fā)波長λex之間的波長差Δλ，λem＝λex＋Δλ，分別在Δλ＝15nm和Δλ＝60nm下測定BSA與GPs不同濃度下的發(fā)射峰強(qiáng)度及峰位.

2 結(jié)果與討論

2.1 絞股藍(lán)皂苷與BSA相互作用的熒光光譜

模擬人體生理?xiàng)l件，在pH＝7.40條件下，固定BSA濃度，改變GPs濃度，得到GPs與BSA相互作用的熒光光譜圖.由圖1可知，隨GPs濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度逐漸降低，這表示在加入GPs后，GPs與BSA發(fā)生了相互作用，生成了不發(fā)熒光的基態(tài)配合物，從而猝滅了BSA內(nèi)色氨酸殘基的熒光（大多數(shù)情況下可認(rèn)為蛋白質(zhì)的熒光主要來自色氨酸的貢獻(xiàn)）.同時，體系中BSA的最大發(fā)射峰從338nm輕微藍(lán)移到333nm，表明二者的相互作用使BSA發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境發(fā)生了變化.

2.2 熒光猝滅機(jī)理及猝滅常數(shù)的測定

引起B(yǎng)SA熒光猝滅的原因可能有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，動態(tài)猝滅過程遵循Stern－Volmer方程[3].

式中：F0和F分別為不存在和存在猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)，τ0為猝滅劑不存在時物質(zhì)的熒光壽命（對大多數(shù)生物分子τ0大約為10－8s）[4].KSV為動態(tài)猝滅常數(shù)，[Q]為猝滅劑的濃度，顯然有KSV＝Kqτ0，以Fo/F－1對[Q]作圖，可求得猝滅常數(shù)KSV及猝滅速率常數(shù)Kq.284K時，猝滅速率常數(shù)為2.994×1012L·mol－1·s－1；310K時，猝滅速率常數(shù)為1.913×1012L·mol－1·s－1.

一般認(rèn)為，各類猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)為2×1010L·mol－1·s－1[4].從結(jié)果可知，GPs對BSA熒光猝滅速率常數(shù)在1010以上，可以初步判斷加入GPs導(dǎo)致BSA熒光猝滅過程是以靜態(tài)猝滅為主.

圖1 絞股藍(lán)皂苷與BSA體系的熒光光譜圖Fig.1 The fluorescence spectra of the gypenoside－BSA system

圖2 絞股藍(lán)皂苷對BSA熒光猝滅的Stern－Volmer圖Fig.2 The Stern－Volmer curves of BSA quenched by gypenoside

動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅還可以依據(jù)猝滅常數(shù)隨溫度不同的變化來區(qū)別.對于動態(tài)猝滅，溫度升高，將增加有效碰撞的粒子數(shù)目，加劇電子的轉(zhuǎn)移，使熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大；若是靜態(tài)猝滅，溫度升高將降低復(fù)合物的穩(wěn)定性，使猝滅常數(shù)減小.圖2是284K和310K下GPs與BSA作用的Stern－Volmer擬合曲線，可以看到，隨溫度升高，Stern－Volmer方程的斜率減小，進(jìn)一步表明該過程是以靜態(tài)猝滅為主.

2.3 表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

小分子與大分子結(jié)合時其表觀結(jié)合常數(shù)Kb及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n由下式求出[5－6]：

F0和F分別為不存在和存在猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，Kb為BSA與GPs之間的表觀結(jié)合常數(shù)，[Q]為猝滅劑的平衡濃度，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù).由式（2）作出體系的關(guān)系圖.通過斜率和外推截距可以求出BSA與藥物之間的表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，結(jié)果見表1.

表1 GPs與BSA反應(yīng)形成絡(luò)合物的表觀結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Table 1 Binding constant Kband number of binding sites of the complexes formed in the reaction of gypenoside with BSA

由表1可看出，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近1，說明GPs與BSA可形成1個結(jié)合位點(diǎn).表觀結(jié)合常數(shù)為104數(shù)量級，表明GPs與BSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合，可以被蛋白質(zhì)運(yùn)輸和儲存.

2.4 結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力

藥物等有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子之間的作用力屬于分子間的弱相互作用力，主要包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力等.根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變ΔrHθm和熵變ΔrSθm的相對大小，可以判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型[7].

在溫度變化不大時，反應(yīng)的焓變和熵變可以看作一常數(shù)，通過熱力學(xué)公式：

式中K為猝滅常數(shù)KSV，R為氣體常數(shù)，計(jì)算出不同溫度下GPs與BSA作用的自由能變和熵變數(shù)據(jù)見表2.

2.5 同步熒光光譜

利用同步熒光光譜可以分析蛋白質(zhì)的構(gòu)象[8].由Δλ＝15nm所得到的同步熒光只顯示蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的光譜特性，而Δλ＝60nm的同步熒光只表現(xiàn)色氨酸殘基的熒光.從圖3中可看出，隨藥物濃度的增大，酪氨酸殘基熒光強(qiáng)度幾乎不變，GPs主要猝滅了BSA的色氨酸殘基的熒光（Δλ＝60nm），且其最大熒光發(fā)射峰出現(xiàn)很輕微的藍(lán)移，說明藥物的加入使蛋白的構(gòu)象發(fā)生一些變化.通過對蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的研究得知，蛋白質(zhì)分子在極性溶劑中發(fā)射的熒光光譜的波長比它在非極性溶劑中的長，即溶劑極性降低，熒光光譜發(fā)生藍(lán)移，根據(jù)這一規(guī)律可知色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性有所降低[9].

圖3 絞股藍(lán)皂苷與BSA體系的同步熒光光譜圖Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of the gypenoside－BSA system

3 結(jié)論

利用熒光光譜技術(shù)研究了生理?xiàng)l件下GPs與BSA的相互作用.發(fā)現(xiàn)GPs對BSA具有熒光猝滅作用，該猝滅過程屬于靜態(tài)猝滅.其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1，結(jié)合常數(shù)的數(shù)量級在104左右，說明GPs與BSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合.通過計(jì)算得到的熱力學(xué)數(shù)據(jù)，推斷出GPs與BSA之間主要靠疏水作用力和靜電引力結(jié)合.并通過同步熒光發(fā)現(xiàn)GPs對BSA的構(gòu)象有一定影響.

[1]MCMENAMY R H.Albumin structure、function and uses[M].Oxford：Dergamon Press，1977.

[2]李群峰.絞股藍(lán)的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].光明中醫(yī)，2009，24（12）：2396－2397.

[3]陳國珍.熒光分析法[M].北京：科學(xué)出版社，1990.

[4]許金鉤，王尊本.熒光分析法[M].北京：科學(xué)出版社，2006：67.

[5]張 勇，張貴珠，王月梅，等.光譜法研究絲裂霉素，血清白蛋白以及金屬離子間的相互作用[J].分析科學(xué)學(xué)報，2000，16（6）：445－449.

[6]魏曉芳，劉會洲.Triton X－100與牛血清白蛋白的相互作用[J].分析化學(xué)，2000，28（6）：699－701.

[7]ROSS P D，SUBRAMANIAN S.Thermodynamics of protein association reactions：forces contributing to stability[J].Biochemistry，1981，20（11）：3096－3102.

[8]楊曼曼，楊 頻，張立偉.熒光法研究咖啡酸類藥物與白蛋白的作用[J].科學(xué)通報，1994，39（1）：31－35.

[9]孫崇榮，李玉民.蛋白質(zhì)化學(xué)導(dǎo)論[M].上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，1991.

Fluorescence spectrometric study of the interaction between gypenoside and bovine serum albumin

HE Li－jun，HUO Cai－xia，YANG Cai－ling，WEI Yu－rong

（CollegeofChemistryandEnvironmentalScience，LanzhouCityUniversity，Lanzhou730070，Gansu，China）

The interaction between gypenoside and bovine serum albumin （BSA）in tris－HCl buffer solution（pH ＝7.40）was studied by means of fluorescence spectroscopy.Number of binding sites and binding constant for gypenoside and BSA were determined based on calculation；and their binding modes were explored based on thermodynamic analysis.In the meantime，the effect of gypenoside on the configuration of BSA was examined by means of synchronous fluorescence spectroscopy.It was found that gypenoside quenched the fluorescence of BSAviaa static quenching process，and hydrophobic and electrostatic interactions played a major role in the binding of gypenoside and BSA.

gypenoside；bovine serum albumin；interaction；fluorescence spectroscopy

O 657.39

A

1008－1011（2012）01－0067－04

2011－06－23.

甘肅省教育廳碩導(dǎo)項(xiàng)目（091113－07）.

何麗君（1973－），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)樗幬锓治?