董曉杰，徐蓓

（中國計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)所， 北京， 100013）

血清中葡萄糖的測量比對—ID-LC-MS／MS法*

董曉杰，徐蓓

（中國計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)所， 北京， 100013）

利用同位素稀釋-液相色譜-質(zhì)譜法(ID-LC-MS／MS)準(zhǔn)確測定血清中葡萄糖含量。以［13C6］葡萄糖為內(nèi)標(biāo)，用重量法準(zhǔn)確地與血清混合，離心沉淀蛋白后在堿性條件下與1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮反應(yīng)，以ZORBAX RX-SIL色譜柱分離，以乙腈-水（體積比25∶75）為流動相，使用電噴霧三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)測定，同位素稀釋的括號法進(jìn)行定量。采用美國NIST的血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 965b進(jìn)行了確證，并用該方法參加JCTLM關(guān)于血清中葡萄糖含量的國際比對，測量值與均值的相對偏差分別為1.1%(A樣)，1.8%(B樣)，結(jié)果在等效范圍內(nèi)。

同位素稀釋質(zhì)譜法；JCTLM國際比對；血清；葡萄糖

血清葡萄糖對高糖、低糖血癥的診斷、治療、愈后監(jiān)測具有重要意義，因此其含量測定是臨床實(shí)驗(yàn)室頻率最高的實(shí)驗(yàn)之一［1］。臨床工作中常發(fā)現(xiàn)不同的實(shí)驗(yàn)室、同一實(shí)驗(yàn)室不同時(shí)間檢測結(jié)果常因檢測儀器、試劑、校準(zhǔn)物、方法多樣性等原因缺乏可比性。通過建立準(zhǔn)確可溯源的血清葡萄糖測定參考方法，并用參考方法進(jìn)行比對測量，進(jìn)而考察已有參考方法的可比性，以保證量值傳遞結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，使檢驗(yàn)結(jié)果在準(zhǔn)確、科學(xué)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)統(tǒng)一、互認(rèn)［2］。

國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會（JCTLM）是在2002年由國際計(jì)量局（BIPM）、國際臨床化學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會（IFCC）、國際實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可委員會（ILAC）共同倡導(dǎo)成立的，旨在建立一個世界性的溯源系統(tǒng)平臺，推動和指導(dǎo)國際認(rèn)可和接受的檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)測量等效性的建立并溯源至適當(dāng)?shù)臏y量標(biāo)準(zhǔn)。它的工作成果表現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)布的國際計(jì)量局JCTLM數(shù)據(jù)庫和IFCC 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)參考實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量評價(jià)計(jì)劃（RELA ）的比對結(jié)果［3］。目前已經(jīng)有17家中國實(shí)驗(yàn)室通過該平臺考查自己的能力。本次比對是中國計(jì)量科學(xué)研究院第二次參加該計(jì)劃，通過比對證明了在血清葡萄糖測量方面的檢測能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：6410B型，美國Agilent公司；

渦旋振蕩器、離心機(jī)；

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 917b：純度為(99.7±0.2)%，美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院；

［13C6］葡萄糖：美國Cambridge Isotope Laboratories公司，標(biāo)示同位素豐度99%；

衍生試劑：1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP)：純度99%，美國Sigma公司；

無水乙醇、乙腈、氯仿：HPLC級，德國Merck公司；

血清樣品：SRM 965b血清；

由JCTLM/IFCC提供A、B兩個濃度水平的人血清凍干粉比對樣品（2010年）。

1.2 樣品前處理?xiàng)l件

樣品前處理方法參照了張?zhí)鞁傻龋?］建立的IDLC-MS／MS法測定血清葡萄糖的方法：以［13C6］葡萄糖為內(nèi)標(biāo)，用重量法準(zhǔn)確地與血清混合，用無水乙醇除去蛋白后與衍生試劑1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（調(diào)pH值至9）反應(yīng)，反應(yīng)后靜置冷卻至室溫，用乙酸溶液中和反應(yīng)系統(tǒng)。加入超純水和氯仿，旋渦振蕩萃取兩次，水相用0.22 μm的濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜的測定。

1.3 儀器條件

（1）色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX RX-SIL(150 mm×2.1 mm，5μm)；流動相：乙腈-水（含乙酸，pH=3.5）（體積比為25∶75），流速為0.3 mL／min；進(jìn)樣量：1 μL；色譜柱溫度：30℃。

（2）質(zhì)譜條件

ESI源，三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測定，正離子多重反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)模式。Fragmentor：165 V；CE：45 V；Delta EMV：600；霧化氣壓力：0.28 MPa；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：9 L／min；毛細(xì)管電壓：4 000 V；掃描時(shí)間：407 ms；括號法定量；MRM監(jiān)測的母離子、子離子分別為葡萄糖m／z511.3～175.2，［13C6］葡萄糖m／z517.3～175.2。

1.4 分析過程

每個樣品與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品同一批測定。分析時(shí)以低標(biāo)、樣品、高標(biāo)的次序進(jìn)樣，每個樣品或標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)進(jìn)樣測定3次，計(jì)算時(shí)以所得結(jié)果的均值作為一個有效數(shù)據(jù)。

1.5 結(jié)果計(jì)算

樣品中葡萄糖的濃度比和峰面積比在兩個校正標(biāo)準(zhǔn)之間符合線性關(guān)系，血清中葡萄糖的質(zhì)量濃度可由以下公式計(jì)算：

式中：

c——血清中葡萄糖的濃度，mmol／L；

IS——血清樣品中葡萄糖與標(biāo)記葡萄糖的峰面積比；

WH——高標(biāo)樣品中葡萄糖與標(biāo)記葡萄糖的質(zhì)量比；

WL——低標(biāo)樣品中葡萄糖與標(biāo)記葡萄糖的質(zhì)量比；

IL——低標(biāo)樣品中葡萄糖與標(biāo)記葡萄糖的峰面積比；

IH——高標(biāo)樣品中葡萄糖與標(biāo)記葡萄糖的峰面積比；

MIS——加入血清樣品中標(biāo)記葡萄糖的質(zhì)量，mg；

MSer——待測血清樣品的質(zhì)量，g；

Ds——血清的密度，g／mL。

1.6 方法驗(yàn)證

在測量比對樣品前用本法測定了美國NIST標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 965b水平3，平行測定3份。實(shí)測值與證書參考值6.575 mmol／L之間的相對偏差為0.4%，在標(biāo)準(zhǔn)值不確定度范圍內(nèi)，證明方法的準(zhǔn)確性良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 比對樣品測量結(jié)果

通過測定高標(biāo)校準(zhǔn)混合液、血清樣品以及低標(biāo)校準(zhǔn)混合液中葡萄糖與標(biāo)記葡萄糖峰面積比，以及相應(yīng)樣品對應(yīng)的質(zhì)量比，利用括弧法即可計(jì)算血清樣品葡萄糖的準(zhǔn)確含量。每個樣品均插在高、低標(biāo)校準(zhǔn)樣品中測量，至少保證從低到高、從高到低兩輪校準(zhǔn)測量。測量結(jié)果見表1、表2。

表1 血清樣品A中葡萄糖含量測量結(jié)果 mmol/L

2.2 測量結(jié)果不確定度

測量涉及凍干血清樣品復(fù)溶，樣品及校準(zhǔn)溶液、內(nèi)標(biāo)溶液的稱量，血清密度的測量等過程，各不確定分量評定結(jié)果見表3。

表2 血清樣品B中葡萄糖含量測量結(jié)果 mmol/L

表3 不確定度分量及合成不確定度 %

2.3 參加測量比對實(shí)驗(yàn)室測量結(jié)果

本次比對樣品中葡萄糖含量有兩個濃度，記為A樣、B樣。共有16個實(shí)驗(yàn)室參加此次比對，所有實(shí)驗(yàn)室的測量結(jié)果見圖1。由圖1可知，中國計(jì)量科學(xué)研究院測定結(jié)果在等效范圍內(nèi)。

表4給出了使用同位素稀釋質(zhì)譜法的各實(shí)驗(yàn)室的測量結(jié)果。中國計(jì)量科學(xué)研究院為92號，是唯一采用ID-LC-MS／MS的實(shí)驗(yàn)室。按質(zhì)譜方法統(tǒng)計(jì)，測量值與均值的差分別為1.1%(A樣)，1.8%(B樣)［5］，在等效范圍內(nèi)。

圖1 血清中葡萄糖濃度的比對結(jié)果圖

表4 血清中葡萄糖濃度的比對結(jié)果（同位素稀釋質(zhì)譜法）

［1］戴新華，齊韜，楊夢瑞，等.血清中葡萄糖含量的測定方法及其研究進(jìn)展［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2008，17(3)： 78-80.

［2］陳文祥，申子瑜，楊振華，等.臨床生化檢驗(yàn)參考方法的主要作用［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，31(3)： 245-249.

［3］徐蓓, 陳文祥. 臨床檢驗(yàn)溯源系統(tǒng)的建立// 2007中國計(jì)量論壇論文集 , 2007： 22-25.

［4］張?zhí)鞁桑瑥垈鲗?，張江濤，?同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定血清葡萄糖［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，33(1)： 75-80.

［5］http：//www.dgkl-rfb.de：81／4Daction／g_search_RELA?sel ectAnalyte=Glucose&submitplot=show+result+plot&ses sion_id=00000000000000000000&cur_year=2010&LabCode=000

International Comparison on the Determination of Serum Glucose by ID-LC-MS/MS

Dong Xiaojie， Xu Bei
(National Institute of Metrology，National Research Center for CRMs， Beijing 100013，China)

The determination of glucose in human serum by liquid chromatography-isotope dilution-mass spectrometry was described.［13C6］glucose as internal standard was added to serum samples and equilibrated with endogenous glucose. Serum proteins were removed by a precipitation with anhydrous ethanol. Serum glucose and the internal standard were then reacted with l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，separated by ZORBAX RX-SIL column using isocratic mobile phase of acetonitrile-water(volum ratio was 25∶75). A tandem mass spectrometer equipped with an electrospray ionization source operated in multiple reaction monitoring (MRM) mode，and the results of determination were calculated from peak area ratios by the bracketing method based on the theory of isotope dilution analysis. The method was validated by analyzing NIST serum reference material SRM 965b. International comparision of JCTLM for glucose content in serum was carried out by the method. The relative deviation between measured value and the mean were 1.1% (A sample)，1.8% (B sample).

isotope dilution; mass spectrometry; international comparison of JCTLM; serum; glucose

O624

A

1008-6145(2012)04-0081-03

10.3969／j.issn.1008-6145.2012.04.025

*國家科技支撐項(xiàng)目(2011BAI02B05)

聯(lián)系人：徐蓓；E-mail： xubei@nim.ac.cn

2012-04-21