沈錫權， 趙永威， 吳祖芳＊， 翁佩芳

（1.寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211；2.寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211）

腌制莧菜梗的微生物菌群結構及其品質(zhì)

沈錫權1，2， 趙永威1，2， 吳祖芳＊1，2， 翁佩芳1，2

（1.寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211；2.寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211）

腌制莧菜梗是浙東傳統(tǒng)的特色腌制食品，了解其細菌種群結構并探討對亞硝酸鹽等理化品質(zhì)的影響，以確保腌制食品的安全性。采用16S r DNA基因克隆文庫的方法，對腌制成熟的莧菜梗中細菌組成結構多樣性進行了分析，共檢測出了乳桿菌、類香菌、弓形桿菌等6個菌屬，其中乳桿菌屬占優(yōu)勢為總數(shù)的83.9%。與此同時，測定了腌制莧菜梗體系亞硝酸鹽等一些理化指標，腌制成熟時p H值為4.35，鹽度為5.5，亞硝酸鹽質(zhì)量分數(shù)為3.99 mg／kg（未超標），細菌和乳酸菌濃度分別為8.8×106CFU／m L和1.6×106CFU／m L。

腌制莧菜梗；16S r DNA克隆文庫；菌群結構；品質(zhì)

浙東傳統(tǒng)的特色腌制食品以寧波地區(qū)的臭莧菜梗、臭冬瓜和臭芋艿蕻（俗稱“三臭”）最為著名，其歷史淵源深遠，清代范寅在《越諺》中對莧菜的描寫有“其梗如蔗，段之腌之，氣臭味佳，最下飯”；寧海西鄉(xiāng)民間有“無臭不下飯”的說法，可見這類食品獨特的風味與具有增進食欲的魅力。俗語又說：“六月莧，當雞蛋，七月莧，金不換”，由此可見其營養(yǎng)價值之高。據(jù)現(xiàn)代營養(yǎng)分析，莧菜富含鈣、磷、鐵、胡蘿卜素和多種維生素［1－2］。由于這些食品風味獨特、營養(yǎng)豐富，是浙江沿海一帶著名的傳統(tǒng)特色腌制食品，深受民眾喜愛。但是莧菜易富集硝酸鹽，如腌制條件控制不好會使亞硝酸鹽含量超標以及有害菌群的生長從而危害人體健康［3－4］；而長期以來人們對這類傳統(tǒng)腌制菜的食用安全性缺乏深入認識，對臭莧菜梗的細菌菌群結構更是缺乏了解。目前對食品的菌相分析常采用傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)，然后進行鑒定的方法，受培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方法等條件的限制，難以客觀準確地表現(xiàn)出樣品中原有的菌落體系［5－6］。分子生物學技術的日益發(fā)展使得微生物多樣性分析的精度和廣度不斷提高，在分子微生態(tài)研究中已體現(xiàn)出重要的應用價值。燕平梅等［7］基于16S rDNA克隆文庫法研究了發(fā)酵甘藍鹵水中微生物，得出4種獨特的菌落，即Lactobacillus acidifarinae、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、融合乳桿菌（Weissella confusa）和足球菌屬的種（Pediococcus sp.），用這種分子方法發(fā)現(xiàn)了常規(guī)分離培養(yǎng)技術未鑒定的乳酸菌Lactobacillus acidifarinae。Tamara等［8］用 DGGE 法 和16S r DNA克隆文庫法研究了加納和巴西咖啡豆發(fā)酵過程中的微生物菌群多樣性，發(fā)現(xiàn)體系中含有許多傳統(tǒng)方法所未培養(yǎng)出的細菌。作者采用16S r DNA克隆文庫法，解析腌制莧菜梗微生物菌群結構，并結合國家標準對亞硝酸鹽等一些理化指標、細菌總數(shù)和乳酸菌總數(shù)進行了測定，為腌制莧菜梗的品質(zhì)控制和食用安全性提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料腌制用莧菜梗：購于寧波農(nóng)貿(mào)市場；Fast DNA SPIN Kit試劑盒，擴增用PCR體系（10×Buffer、MgCl2、d NTPs、Ex－Taqpolymer－ase）、載體p MD18－T、E.coliDH5α感受態(tài)細胞和DNA Marker：購于大連寶生物工程有限公司；DNA回收試劑盒、引物：由生工生物工程（上海）有限公司提供。

1.1.2 儀器pH計、可見分光光度計、梯度PCR儀、Alphalmger 2200凝膠成像系統(tǒng)等。

1.1.3 培養(yǎng)基MRS固體培養(yǎng)基，PCA固體培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，選擇性LB培養(yǎng)基（Amp＋）按文獻［8］配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 莧菜梗的腌制莧菜梗的腌制按傳統(tǒng)腌制工藝進行。將新鮮的莧菜梗清洗干凈后稱重。然后切成邊長6 cm左右的小段，用水浸泡24 h左右，等水起白泡，即把莧菜梗撈起，洗凈并瀝干，然后按照12.5 kg莧菜梗加0.7 kg食鹽的比例加入食鹽。最后用塑料紙封口，放于陰涼處發(fā)酵20 d左右即可，作為菌群分析用樣品。

1.2.2 樣品總DNA提取純化采用Fast DNA SPIN Kit試劑盒，按說明書步驟對腌制莧菜梗鹵水樣品50 m L進行總DNA的提取。

1.2.3 PCR擴增PCR擴增所用的反應體系為：10×Buffer 5μL、25 mmol／L的 MgCl25μL、2.5 mmol／L的d NTP 8μL、10μmol／L的上下游引物各1.0μL ，具體為27F（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和 1492R（5′－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′）、模板 DNA 1.0μL、5 U／μL的Ex－TaqDNA聚合酶0.4μL，用無菌dd H2O補足50μL體系。PCR反應的循環(huán)條件為：95℃預變性3 min，30個循環(huán)（94℃變性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸1 min 30 s），72℃最后延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用純化試劑盒切膠純化。

1.2.4 16S r DNA克隆文庫的構建將PCR產(chǎn)物純化后與p MD18－T載體在4℃連接過夜，轉化感受態(tài)細胞E.coliDH5α。用引物M13F和M13R隨機檢測出60個陽性克隆進行測序。

1.2.5 基因序列的鑒別測序結果采用DAMBE、DNAstar、MEGA 4.1等軟件進行編輯分析，并把編輯好的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比對，分析出克隆所屬物種的系統(tǒng)位置和與之最近似的種類。

1.2.6 分析方法鹽度、p H值和亞硝酸鹽質(zhì)量分數(shù)的測定：取莧菜梗的腌制鹵水，按文獻［9］進行測定；細菌總數(shù)以及乳酸菌總數(shù)變化情況的測定：取莧菜梗的腌制鹵水，利用稀釋倒平板法測定鹵水中細菌總數(shù)以及乳酸菌總數(shù)的變化情況。

2 結果與分析

2.1 細菌16S r DNA克隆文庫的構建

將來自腌制莧菜梗樣品的58個陽性克隆子的測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，克隆子與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知細菌的16S rDNA序列相似性均在95%以上，檢測出樣品共含有6個菌屬，見圖1。即乳桿菌屬（Lactobacillus）、類香菌屬（Myroides）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、片球菌屬（Pediococcus）和產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes），其中乳桿菌屬有51個克隆子，占總菌數(shù)的83.9%，其余5個屬細菌占16.1%。為方便分析，把差異在0.5%之內(nèi)的序列作為一個分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU），樣品可分成15個OTU，腌制后臭莧菜梗樣品的細菌群落組成測定結果見表1。

圖1 NJ法構建腌制莧菜梗中細菌16S r DNA克隆文庫序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Establishment of phylogenetic tree based on the neighbour－joining analysis of 16S r DNA sequence in fermented amaranth stem

表1 16S r DNA克隆文庫法對腌制臭莧菜梗樣品的細菌群落組成分析結果Tab.1 Analytical results of bacterial community composition for fermented amaranth stem based on 16S r DNA clone library

續(xù)表1

2.2 鹽度、p H和亞硝酸鹽的測定

對腌制莧菜梗樣品的鹽度和p H值進行了測定，分別為5.5%和4.35；亞硝酸鹽質(zhì)量分數(shù)為3.99 mg／kg。

2.3 細菌總數(shù)以及乳酸菌總數(shù)的測定

對腌制莧菜梗樣品的細菌總數(shù)和乳酸菌總數(shù)進行測定，分別為8.8×106CFU／m L和1.6×106CFU／m L。

3 結語

采用16S r DNA基因克隆文庫方法較好地反映了腌制成熟的莧菜梗樣品細菌的多樣性，從組成菌屬組成可以看出，菌群結構較簡單，樣品共含有6個菌屬，其中乳桿菌屬占總菌數(shù)高達83.9%，其余5個屬細菌占16.1%。在對樣品分成的15個分類操作單元（OTU）中，乳桿菌屬可分為9個OTU，其中A1型數(shù)量最多共38個克隆子（占樣品總數(shù)65.5%），在NCBI上進行序列比對分析，與Lactobacillus casei（干酪乳桿菌）（登錄號：AB690233）最相似，相似性在99.5%～100%，干酪乳桿菌在乳酸菌種類中組成重要地位，屬于益生菌，因此，食用腌制莧菜梗對于改善人體腸道微生物組成結構是有益的。

硝酸鹽和亞硝酸鹽是食品加工的常用的添加劑，能使產(chǎn)品呈現(xiàn)良好色澤、防腐以及增強風味的作用［10－11］；但亞硝酸鹽具有危害性，可使血液中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，使得血紅蛋白的攜氧能力下降，引起組織缺氧，并對周圍血管有擴張作用；亞硝酸鹽還可以與食物或胃中的仲胺類物質(zhì)作用轉化為亞硝胺，可引起食管癌、胃癌、肝癌和大腸癌等［14］，是強致癌物質(zhì)之一；因此，亞硝酸鹽作為腌制菜食用安全最重要的控制指標之一。在蔬菜加工中亞硝酸鹽的主要來源途徑之一是硝酸鹽被某些細菌還原生成。張加春等［12］對大白鼠舌表硝酸鹽還原菌進行了研究，結果顯示腸桿菌科、葡萄球菌屬、莫拉氏菌屬和奈瑟氏球菌屬為優(yōu)勢菌，因此，控制這些細菌種類對于含硝酸鹽較高的食品物料中亞硝酸鹽質(zhì)量分數(shù)的減少具有重要作用。先期在對蔬菜腌制過程菌群組成及其動態(tài)變化研究結果表明，蔬菜中腸桿菌科細菌分布較多；另外，有文獻報道一些乳酸菌種屬能夠降解亞硝酸鹽，一方面通過產(chǎn)生酶蛋白來降解，另一方面乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸降低環(huán)境中的p H也能使亞硝酸鹽得到降解［13］；因此，要使腌制蔬菜產(chǎn)品中亞硝酸鹽處于較低水平，關鍵在于如何讓乳酸菌占優(yōu)勢而抑制腸桿菌科細菌生長。從腌制成熟莧菜梗細菌組成多樣性分析結果可以看出，腌制成熟后乳桿菌為優(yōu)勢菌，比例高達83.9%，這對腌制樣品亞硝酸鹽質(zhì)量分數(shù)的控制起到了關鍵的作用。

另一方面，腌制覓菜梗的亞硝酸鹽含量與腌制時間、腌制方法和溫度有關［3］，這種變化實際上由微生物組成種群變化有關。腌制時間初期亞硝酸鹽含量增高，腌制7～8 d時質(zhì)量分數(shù)最高，隨后逐漸下降；而亞酸鹽質(zhì)量分數(shù)隨腌制的溫度升高而增加。先期在研究榨菜、雪菜及冬瓜低鹽腌研究中發(fā)現(xiàn)，腌制初期腸桿菌科細菌較多，亞硝酸鹽質(zhì)量分數(shù)不斷升高，當乳酸菌數(shù)量占優(yōu)勢時亞硝酸鹽質(zhì)量分數(shù)不斷下降；而傳統(tǒng)的高鹽濃度腌制工藝，其食鹽質(zhì)量濃度達12 g／d L以上時，亞硝酸鹽產(chǎn)生受到抑制，這些條件都在于調(diào)控腸桿菌科細菌和乳酸菌的生長情況，因此，高鹽、密封和添加發(fā)酵劑等操作方式均能有效控制亞硝酸鹽的形成。為安全起見，采用傳統(tǒng)的覓菜梗腌制方法，需經(jīng)10 d以上方可食用［14］。由本研究樣品的p H值和亞硝酸鹽質(zhì)量分數(shù)分析結果，腌制莧菜梗樣品低p H以及乳桿菌屬細菌占絕對優(yōu)勢，抑制了腸桿菌科細菌的生存和生長，使得雖然低鹽體系但亞硝酸鹽質(zhì)量分數(shù)遠未超標。

4 結論

1）16S r DNA基因克隆文庫法測定腌制莧菜梗樣品的菌群結構，共檢測出6個菌屬，即乳桿菌屬（Lactobacillus）、類香菌屬（Myroides）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、片球菌屬（Pediococcus）和產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes），其中乳桿菌屬有51個克隆子，占總菌數(shù)的83.9%，其余5個屬細菌占16.1%。

2）腌制莧菜梗樣品的鹽度和p H值為5.5%和4.35，亞硝酸鹽質(zhì)量分數(shù)為3.99 mg／kg，未超標。

3）腌制莧菜梗樣品的細菌和乳酸菌含量分別為8.8×106CFU／m L和1.6×106CFU／m L。

（References）：

［1］楊瑞因，李曙軒.菜用莧菜營養(yǎng)成份變異初探［J］.浙江大學學報，1991，17（2）：205－207.

YANG Rui－ying，LE Shu－xuan.Preliminary studies on the variation of nutrients of vegetable amaranths［J］.Acta Agriculturae Universitatis Zhejiangensis，1991，17（2）：205－207.（in Chinese）

［2］于淑玲.藥食保健野菜－莧菜的開發(fā)利用［J］.資源開發(fā)與市場，2010，26（2）：141－142.

YU Shu－ling.Development and utilization of amaranth in wild food and medicine health care［J］.Resource Development ＆Market，2010，26（2）：141－142.（in Chinese）

［3］張永，張國紅.一起食用霉覓菜梗引起食物中毒的調(diào)查［J］.浙江預防醫(yī)學，1999，S1：47.

ZHANG Yong，ZHANG Guo－h(huán)ong.Investigation of food poisoning caused by fermented amaranth stem［J］.Zhejiang Journal of Preventive Medicine，1999，S1：47.（in Chinese）

［4］王萍，操璟璟，劉佳佳.安慶市售葉菜類蔬菜硝酸鹽含量的調(diào)查及污染評價［J］.安慶師范學院學報：自然科學版，2009，15（3）：75－77.

WANG Ping，CAO Jing－jing，LIU Jia－jia.Investigation and evaluation of nitrate pollution of leafy vegetables in anqing city［J］.Journal of Anqing Normal College：Natural Science Edition，2009，15（3）：75－77.（in Chinese）

［5］楊小鵑，吳清平，張菊梅，等.多重PCR檢測無公害畜禽肉和水產(chǎn)品中4種致病菌［J］.微生物學通報，2005，32（3）：95－101.

YANG Xiao－juan，WU Qing－ping，ZHANG Ju－mei，et al.Simultaneous detection of common food－borne bacterial pathogens in innocuous poultry and seafood by multiplex PCR assay［J］.Microbiology China，2005，32（3）：95－101.（in Chinese）

［6］陳燕，蘇秀榕，宋益銀，等.生食蚶類細菌的生理生化特性研究［J］.水產(chǎn)科學，2009，28（1）：20－23.

CHEN Yan，SU Xiu－rong，SONG Yi－yin，et al.Physiological and biochemical characteristics in bacteria from uncooked ark shells［J］.Fisheries Science，2009，28（1）：20－23.（in Chinese）

［7］燕平梅，張慧，薛文通，等.16S rRNA基因序列方法分析傳統(tǒng)發(fā)酵菜中乳酸菌多樣性［J］.中國食品學報，2007，7（2）：119－123.

YAN Ping－mei，ZHANG Hui，XUE Wen－tong，et al.Determination of lactic acid bacterial diversity in the traditional fermented vegetable by 16S r RNA sequence analysis［J］.Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2007，7（2）：119－123.（in Chinese）

［8］Tamara G A，Zoi P，Hugo H，et al.Diversity of the total bacterial community associated with Ghanaian and Brazilian cocoa bean fermentation samples as revealed by a 16 S r RNA gene clone library［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2010，87：2281－2292.

［9］尹利端，韓北忠，黃晶晶，等.蘿卜泡菜發(fā)酵過程中食鹽對微生物變化的影響［J］.中國釀造，2005，114（3）：19－21.

YIN Li－duan，HAN Bei－zhong，HUANG Jing－jing，et al.Effect of salt on microbial changes in pickled radish［J］.China Brewing，2005，114（3）：19－21.（in Chinese）

［10］Chow C K，Hong C B.Dietary vitamin E and selenium and toxicity of nitrite and nitrate［J］.Toxicology，2002，180：195－207.

［11］何燕飛，李和生，董亞輝，等.腌魚中硝酸鹽還原菌的篩選及系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（8）：213－215.

HE Yan－fei，LI He－sheng，DONG Ya－h(huán)ui.Screening and phylogenetic analysis of nitrate－reducing bacteria in salted fish［J］.Science and Technology of Food Industry，2011，32（8）：213－215.（in Chinese）

［12］張加春，李紅，何斌，等.大白鼠舌表硝酸鹽還原菌研究［J］.云南大學學報：自然科學版，1998，20（S4）：516－518.

ZHANG Jia－chun，LI Hong，HE Bin，et al.Nitrate reducing bacteria on rat tongue［J］.Journal of Yunnan University：Natural Science Edition，1998，20（S4）：516－518.（in Chinese）

［13］張慶芳，遲乃玉，鄭燕.乳酸菌降解亞硝酸鹽機理的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28（8）：27－31.

ZHANG Qing－fang，CHI Nai－yu，ZHENG Yan.The study on mechanism of nitrite degradation by lactic acid bacteria［J］.Food and Fermentation Industries，2002，28（8）：27－31.（in Chinese）

［14］龔鋼明，管世敏.乳酸菌降解亞硝酸鹽的影響因素研究［J］.食品工業(yè)，2010，5：6－8.

GONG Gang－ming，GUAN Shi－min.Study on influencing factors of degradating nitrite by lactic acid bacteria［J］.Food Industry，2010，5：6－8.（in Chinese）

A Preliminary Study of Microbial Community Structure and Its Quality of Pickled Amaranth Stem

SHEN Xi－quan1，2，ZHAO Yong－wei1，2，WU Zu－fang＊1，2，WENG Pei－fang1，2

（1.School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology，Ministry of Education，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

Fermented amaranth stem is a special traditional characteristics pickled food in east Zhejiang provice，and it is necessary to understand the microbial community structure and influence on physical and chemical properties such as nitrite concentration of fermented amaranth stem to ensure food safety.The bacterial community diversity of fermented amaranth stem was investigated based on the method of 16S rDNA clone library.The results indicated that 6 bacterial communities in sample were detected includingMyroides，ArcobacterandLactobacillus，etc.The predominant community was identified asLactobacillus，which account for 83.9%in total 16S rDNA sequences.In the mean time，the pH value，salinity and nitrite concentration of pickled product of amaranth stem were also detected，they are 4.35，5.5%and 3.99 mg／kg，respectively.The population of bacteria and lactic acid bacteria were 8.8×106CFU／mL and 1.6×106CFU／m L，respectively.These data are within national standard.The research results can provide microbial and theory identification for process parameters of fermented amaranth stem.

fermented amaranth stem，16S r DNA colone library，microbial community structure，characters

＊通信作者：吳祖芳（1963－），男，浙江奉化人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品生物工程技術方面的研究。E－mail：wuzufang06＠yahoo.com.cn

TS 205

A

1673－1689（2012）05－0486－06

2012－01－05

國家自然科學基金項目（31171735，31071582）；寧波市農(nóng)業(yè)擇優(yōu)委托項目（2010C10017）。

沈錫權（1980－ ），男，浙江奉化人，食品生物技術博士研究生。E－mail：shenxiquan＠nbu.edu.cn