李會品， 趙謀明， 俞志敏， 雷宏杰， 趙海鋒

（華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640）

RP－HPLC法同時(shí)測定釀酒酵母胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I

李會品， 趙謀明， 俞志敏， 雷宏杰， 趙海鋒＊

（華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640）

為準(zhǔn)確監(jiān)控釀酒酵母胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I的代謝情況，作者建立了釀酒酵母胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I的高效液相色譜分析方法。胞內(nèi)代謝物經(jīng)液氮研磨提取后，采用Agilent Zorbax SB－Aq色譜柱（5μm，4.6 mm×150 mm）分離，流動(dòng)相0.025 mmol／L三乙胺－磷酸緩沖液（p H 6.0）與乙腈梯度洗脫，流速1 m L／mim，檢測波長254 nm。在此條件下，3種磷酸腺苷和兩種輔酶I達(dá)到了較好的分離效果?；厥章试?8.30%～103.42%之間，RSD＜3.00%。結(jié)果表明，本法靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于釀酒酵母胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I摩爾質(zhì)量濃度的測定。

高效液相色譜；釀酒酵母；磷酸腺苷；輔酶I

啤酒作為世界性飲料，是世界上產(chǎn)量最大的飲 料酒［1］。啤酒釀造過程中，酵母將麥汁中的糖分發(fā)酵生成乙醇、二氧化碳和其他副產(chǎn)物。這一過程包括諸多代謝反應(yīng)，其反應(yīng)活性直接決定啤酒的品質(zhì)［2］。酵母代謝活性受胞內(nèi)磷酸腺苷（ATP、ADP和AMP）和輔酶I（NADH和NAD＋）含量和狀態(tài)的調(diào)控［3－4］。ATP是釀酒酵母細(xì)胞合成的含有高能磷酸鍵的化合物，參與機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪及糖類的代謝，是生物體重要的能量物質(zhì)，對生物體正常機(jī)能的維持有著無可替代的作用。ATP可水解生成ADP和AMP，三者之間的相互轉(zhuǎn)化使ATP在機(jī)體內(nèi)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，以維持機(jī)體代謝的需要［5］。NAD＋、NADH是輔酶I在細(xì)胞內(nèi)存在的兩種形式。細(xì)胞代謝過程中，氧化型和還原型輔酶I之間的相互轉(zhuǎn)換，起著調(diào)節(jié)能量代謝和物質(zhì)代謝的核心作用［6］。

目前，測定ATP、ADP和AMP的方法較多，主要有試劑盒法、電化學(xué)分析法、層析法、生物發(fā)光法、高效液相色譜（HPLC）法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法及熒光光譜法［7］。其中試劑盒法、電化學(xué)分析法、生物發(fā)光法及毛細(xì)管區(qū)帶電泳法存在操作繁瑣、精度低、雜質(zhì)干擾等缺點(diǎn)，HPLC法則具有操作簡便、靈敏度高、精確度高等特點(diǎn)［8－9］。但準(zhǔn)確分析檢測酵母胞內(nèi)的磷酸腺苷和輔酶I，并監(jiān)測其在發(fā)酵過程中的代謝情況，尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，作者在以前研究的基礎(chǔ)上，建立了利用RP－HPLC法測定釀酒酵母胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I的方法，該方法不僅操作簡便，而且穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度、靈敏度高，能為啤酒釀造者監(jiān)控釀酒酵母的代謝活性提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

下面釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）FBY0095，上面釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）FBY0099：由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 儀器與試劑

Waters 600高效液相色譜儀，Waters 2418紫外檢測器，Agilent Zorbax SB－Aq色譜柱（5μm，4.6 mm×150 mm）；p HS－2C型數(shù)字酸度計(jì)：上海精科儀器有限公司；3－18K高速冷凍離心機(jī)：Sigma儀器有限公司；XO－650D超聲細(xì)胞破碎儀：南京先歐生物科技有限公司；三乙胺、乙腈、磷酸：迪馬試劑有限公司，色譜純；ATP－Na2、ADP－Na2、AMPNa2、NAD＋、NADH：Sigma試劑有限公司，色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3 酵母細(xì)胞猝滅

取10 m L對數(shù)期發(fā)酵液，加入40 m L、－40℃、體積分?jǐn)?shù)72%甲醇溶液，在－20℃下保藏10 min，每兩分鐘劇烈振蕩一次，以猝滅酵母胞內(nèi)代謝。在4℃下以6 000 r／min離心10 min，收集菌體，再用冰甲醇溶液洗滌兩遍，離心后收集菌體［10］。

1.4 胞內(nèi)物提取

1.4.1 超聲提取向菌體中加入5 m L pH 6.0的磷酸鈉緩沖液，超聲處理10 min（功率300 W，工作1 s，間歇0.5 s），離心后收集上清液［11］。

1.4.2 熱乙醇提取向菌體中加入一定量熱乙醇，在沸水浴中將乙醇蒸干，然后加入5 m L pH 6.0的磷酸鈉緩沖液，煮沸10 min，離心后收集上清液［10］。

1.4.3 液氮提取向菌體中加入2 m L pH 6.0的磷酸鈉緩沖液，用石英砂研磨5 min，再加入3 m L磷酸鈉緩沖液洗滌，離心后收集上清液，并于－20℃下保藏。

1.5 色譜條件

流動(dòng)相：0.025 mmol／L三乙胺溶液（用磷酸調(diào)p H至6.0）和乙腈梯度洗脫，流速1 m L／min，洗脫時(shí)間40 min，在0～20 min，流動(dòng)相中三乙胺緩沖液與乙腈的比例由99∶1降低到95∶5，保持5 min，接下來15 min內(nèi)，流動(dòng)相比例再由95∶5變化為99∶1，紫外檢測波長254 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的選擇

釀酒酵母細(xì)胞經(jīng)甲醇猝滅處理后，用不同提取方法對胞內(nèi)代謝物進(jìn)行提取，然后進(jìn)行HPLC檢測。由表1可知，液氮研磨法對胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I的提取效果最好，該法提取的總磷酸腺苷和總輔酶I濃度均為最高。超聲提取法提取效果次之，熱乙醇提取法提取效果最差。這說明液氮研磨法對酵母細(xì)胞有較好的破碎作用，使胞內(nèi)代謝物完全釋放出來。超聲處理對酵母細(xì)胞產(chǎn)生空化作用，使細(xì)胞膜產(chǎn)生裂隙，胞內(nèi)物質(zhì)不完全釋放［12］。乙醇對細(xì)胞膜起溶解作用，但酵母細(xì)胞膜較堅(jiān)固，所以只有部分胞內(nèi)物被提取出來。超聲提取法對ATP和NADH的水解作用較明顯，使細(xì)胞能荷（EC）和還原度（NADH／NAD＋）最低，不能準(zhǔn)確反映酵母細(xì)胞的代謝狀況。液氮研磨提取后，酵母細(xì)胞的EC和還原度均為最高，可能是由于在低溫條件下能較好地防止ATP和NADH的水解。因此，液氮研磨法對酵母胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I的提取效果較好。

表1 不同提取方法對釀酒酵母胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I提取的影響Tab.1 Effects of different methods on extraction of intracellular adenosine phosphate and coenzyme I from Saccharomyces cerevisiae（μmol／g）

2.2 流動(dòng)相條件選擇

2.2.1 流動(dòng)相種類選擇磷酸鹽緩沖液－乙腈和三乙胺緩沖液－乙腈系統(tǒng)是分離磷酸腺苷和輔酶I時(shí)應(yīng)用較廣泛的流動(dòng)相［13－14］。作者選擇 Na2HPO4－Na H2PO4緩沖液－乙腈和三乙胺－磷酸緩沖液－乙腈作為流動(dòng)相，比較5種物質(zhì)的分離情況。結(jié)果表明，這兩種流動(dòng)相都能較好的分離磷酸腺苷和輔酶I，相同濃度條件下，當(dāng)三乙胺緩沖液作為流動(dòng)相時(shí)，磷酸腺苷和輔酶I的響應(yīng)值較大。此外，由于磷酸鹽緩沖液的本底吸收較高，故選擇三乙胺緩沖液作為流動(dòng)相。

緩沖液濃度直接影響緩沖能力大小，影響流動(dòng)相穩(wěn)定性，從而影響色譜柱分離效果。0.025、0.03、0.035、0.04 mmol／L 4種濃度的緩沖液對磷酸腺苷和輔酶I的分離效果都較好。而高濃度緩沖液會增加流動(dòng)相的本底吸收，降低靈敏度，影響分離效果，并縮短色譜柱壽命。因此，選擇0.025 mmol／L的三乙胺緩沖液［15］。

2.2.2 流動(dòng)相p H選擇由于流動(dòng)相p H值對磷酸腺苷的保留時(shí)間有較大影響，因此考察不同流動(dòng)相p H 值（p H 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）對磷酸腺苷和輔酶I分離的影響，結(jié)果見圖1。由圖1知，AMP、ADP、ATP和NADH的保留時(shí)間隨p H值的增加而減小，NADH的降低幅度較大，而NAD＋的保留時(shí)間隨p H的增加而增加。p H值為5.0時(shí)，5種物質(zhì)保留時(shí)間差異較大，較易分離，但NADH的保留時(shí)間過大對分離不利。p H 為5.5時(shí)，NAD＋與 AMP不能分離開來。p H 為6.5時(shí)，NAD＋與ADP的保留時(shí)間較接近，不易分離。p H為7時(shí)，5種胞內(nèi)物分離效果較好，但ATP和NADH在酸性條件下穩(wěn)定性較好，在堿性或中性條件下較易水解［16］。p H 為6.0時(shí)，5種物質(zhì)保留時(shí)間差異較大，較易分離。故流動(dòng)相p H選為6.0。

圖1 流動(dòng)相p H值對磷酸腺苷和輔酶I保留時(shí)間的影響Fig.1 Effects of pH value on the retention time of intracellular adenosine phosphate and coenzyme I

2.2.3 流動(dòng)相配比選擇考察等度洗脫條件（乙腈體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%和5%）對磷酸腺苷和輔酶I的分離效果，結(jié)果見圖2。磷酸腺苷和輔酶I的保留時(shí)間隨乙腈比例的增加而減小，乙腈比例較低（＜2%）時(shí)，NADH難以洗脫出來。當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，磷酸腺苷和輔酶I在15 min內(nèi)被全部洗脫出來，但AMP、NAD＋、ADP無法達(dá)到良好分離?？梢姷榷认疵摵茈y滿足分離要求。因此作者選擇梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)在0～20 min，流動(dòng)相中三乙胺緩沖液與乙腈的比例由99∶1降低到95∶5，保持5 min，接下來15 min內(nèi)，流動(dòng)相比例再由95∶5變化為99∶1時(shí)，5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品均有較好的分離效果，結(jié)果見圖3。

圖2 流動(dòng)相中乙腈體積分?jǐn)?shù)對磷酸腺苷和輔酶I保留時(shí)間的影響Fig.2 Effects of different acetonitrile proportion on the retention time of intracellular adenosine phosphate and coenzyme I

圖3 磷酸腺苷和輔酶I標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜（a）和樣品的HPLC圖譜（b）Fig.3 HPLC chromatograms of standards（a）and sample（b）

2.3 工作曲線

分別以各組分峰面積A對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度c（g／L）進(jìn)行線性回歸分析，磷酸腺苷和輔酶I的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。由表2知，在所測范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4 精密度和回收率

取一定量待測樣品3份，其中一份做本底，另外兩份分別添加一定量磷酸腺苷和輔酶I的標(biāo)準(zhǔn)混合液，然后按照優(yōu)化的方法進(jìn)行檢測。每份樣品進(jìn)行3次平行測定，計(jì)算回收率和精密度，結(jié)果表明該方法回收率高，重現(xiàn)性好，見表2。

表2 回歸分析、檢測限、精密度和回收率Tab.2 Regression analysis，detection limit，precision and recovery of the RP－HPLC method

2.5 發(fā)酵過程中釀酒酵母胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I含量的變化

在上述確定的色譜條件下，檢測發(fā)酵過程中下面釀酒酵母和上面釀酒酵母胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I的摩爾質(zhì)量濃度，結(jié)果見圖4、5。

ATP普遍存在于生物細(xì)胞內(nèi)，為細(xì)胞新陳代謝提供能量，是細(xì)胞生存的必要因素。Guimaraes P M R等人用生物發(fā)光法研究了厭氧發(fā)酵過程中釀酒酵母胞內(nèi)磷酸腺苷摩爾質(zhì)量濃度和EC的變化，測得ATP摩爾質(zhì)量濃度為1.7～4.2μmol／g，ADP摩爾質(zhì)量濃度為0.1～1.8μmol／g，AMP摩爾質(zhì)量濃度為0.1～1.8μmol／g，EC 為0.47～0.95［17］。由圖4（A）及圖5（A）可知，本法測定的下面釀酒酵母胞內(nèi)ATP摩爾質(zhì)量濃度為1.57～5.32μmol／g，ADP摩爾質(zhì)量濃度為0.75～1.32μmol／g，AMP摩爾質(zhì)量濃度為0.54～1.10μmol／g，EC為0.56～0.85。上面釀酒酵母胞內(nèi)ATP摩爾質(zhì)量濃度為1.36～5.10μmol／g，ADP摩爾質(zhì)量濃度為0.36～1.11μmol／g，AMP摩爾質(zhì)量濃度為0.24～0.88 μmol／g，EC為0.57～0.90，與 Guimaraes P M R測定的結(jié)果基本一致。發(fā)酵過程中下面釀酒酵母和上面釀酒酵母胞內(nèi)ATP摩爾質(zhì)量濃度都是先升高后降低，ADP和AMP摩爾質(zhì)量濃度都呈升高趨勢。下面釀酒酵母胞內(nèi)EC在發(fā)酵0～3 d內(nèi)基本不變，而后逐漸降低，而上面釀酒酵母胞內(nèi)EC在發(fā)酵過程中呈逐漸降低趨勢。發(fā)酵過程中下面釀酒酵母和上面釀酒酵母胞內(nèi)ATP、ADP、AMP摩爾質(zhì)量濃度和EC的變化趨勢都基本一致。由于在發(fā)酵開始時(shí)，酵母細(xì)胞利用麥汁中的營養(yǎng)物質(zhì)維持代謝，同時(shí)合成ATP貯存起來，此時(shí)細(xì)胞代謝活性較高，ATP摩爾質(zhì)量濃度較高，EC較高。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，溶氧量逐漸降低，酵母細(xì)胞分解胞內(nèi)ATP生成ADP、AMP，以供代謝需要，所以胞內(nèi)ATP摩爾質(zhì)量濃度逐漸降低，ADP和AMP摩爾質(zhì)量濃度逐漸升高。此時(shí)細(xì)胞代謝活性降低，使EC逐漸降低。

圖4 發(fā)酵過程中下面釀酒酵母胞內(nèi)磷酸腺苷（a）及輔酶I（b）摩爾質(zhì)量濃度的變化Fig.4 Time course of the intracellular adenosine phosphate（a）and coenzyme I（b）during larger Saccharomyces cerevisiae fermentation process

圖5 發(fā)酵過程中上面釀酒酵母胞內(nèi)磷酸腺苷（a）及輔酶I（b）摩爾質(zhì)量濃度的變化Fig.5 Time course of the the intracellular adenosine phosphate（a）and coenzyme I（b）during ale Saccharomyces cerevisiae fermentation process

NAD＋／NADH反映細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，其水平直接影響著細(xì)胞的節(jié)律、衰老、癌變和死亡等生命過程［18］。由圖4（b）及圖5（b）可知，發(fā)酵過程中下面釀酒酵母和上面釀酒酵母胞內(nèi)NAD＋、NADH摩爾質(zhì)量濃度和NADH／NAD＋都是先升高后降低，下面釀酒酵母和上面釀酒酵母胞內(nèi)NAD＋、NADH摩爾質(zhì)量濃度和NADH／NAD＋的變化趨勢都基本一致。在發(fā)酵初期，細(xì)胞代謝旺盛，合成較多的輔酶I，細(xì)胞還原度較高，但隨著發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，細(xì)胞代謝逐漸減弱，輔酶I摩爾質(zhì)量濃度逐漸下降，還原度逐漸降低。

3 結(jié)語

液氮研磨法能較好地提取胞內(nèi)代謝物，并能很好地防止ATP和NADH的水解。經(jīng)過優(yōu)化，確定0.025 mmol／L pH 6.0的三乙胺－磷酸緩沖液－乙腈作為流動(dòng)相，梯度洗脫程序?yàn)椋?～20 min，流動(dòng)相中三乙胺－磷酸緩沖液與乙腈的比例由99：1降低到95：5，保持5 min，接下來15 min，流動(dòng)相的比例再由95∶5變化為99∶1。此條件能對胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I進(jìn)行較好地分離，且該方法回收率高，重現(xiàn)性好，可以準(zhǔn)確監(jiān)控發(fā)酵過程中酵母胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I的代謝情況。結(jié)果表明，用液氮研磨法提取，高效液相色譜法測定酵母胞內(nèi)磷酸腺苷和輔酶I，準(zhǔn)確度和精密度均較高，是一種簡便、快速、準(zhǔn)確、易于推廣的檢測方法。

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Simultaneous Determination of Adenosine Phosphate and Coenzyme I in Cells ofSaccharomyces cerevisiaeby RP－HPLC

LI Hui－pin，ZH AO Mou－ming，YU Zhi－min，LEI Hong－jie，ZH AO Hai－feng＊

（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

In this manuscript，an RP－HPLC method was developed to determine simultaneously adenosine phosphate and coenzyme I in Saccharomyces cerevisiae，in order to monitor metabolic state.The intracellular metabolites extracted by the method of rubbing with liquid nitrogen were separated on an Agilent Zorbax SB－Aq column （5μm，4.6 mm×150 mm）.A 0.025 mmol／L triethylamine－phosphoric acid buffer solution（p H 6.0）and acetonitrile mixture was used as mobile phase，with a flow rate of 1 m L／min.Detection wavelength was set at 254 nm.Under these conditions，three kinds of adenosine phosphate and two kinds of coenzyme I could be well separated.The recoveries were between 98.30%and 103.42%，and the RSD of the method was less than 3%.The results showed that this method is sensitive，accurate，reproducible and can be applied to determinate the content of intracellular adenosine phosphate and coenzyme I ofS.cerevisiae.

HPLC，Saccharomyces cerevisiae，adenosine phosphate，coenzyme I

TS 201.2

A

1673－1689（2012）05－0492－07

2011－05－03

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2008BAI63B06）；廣東省科技計(jì)劃工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（2009A010700004，2010A010500002）。

＊

趙海鋒（1977－），男，河南焦作人，工學(xué)博士，講師，主要從事發(fā)酵工程與食品生物技術(shù)方面的研究。E－mail：hfzhao＠scut.edu.cn