陳忍忍， 袁久剛， 余圓圓， 范雪榮， 王 強(qiáng)， 朱怡然

（江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

殼聚糖修飾羊毛防氈縮用蛋白酶的制備及其酶學(xué)性質(zhì)

陳忍忍， 袁久剛， 余圓圓， 范雪榮， 王 強(qiáng)＊， 朱怡然

（江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

為了減少防氈縮整理中蛋白酶對(duì)羊毛纖維主體結(jié)構(gòu)的破壞作用，利用水溶性碳二亞胺將殼聚糖大分子偶聯(lián)到蛋白酶（Savinase 16L）分子上，增大蛋白酶分子量，從而將水解作用限制在纖維表面。研究結(jié)果表明，殼聚糖修飾后蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)更加規(guī)整，整體結(jié)構(gòu)更加緊湊；Km從20.62 g／L提高到35.21 g／L，表明其對(duì)底物的親和力變?。恍揎椕傅淖钸m溫度為55℃，在該溫度下的熱穩(wěn)定性較好，且在70℃以上的高溫下，修飾酶顯示出優(yōu)于未修飾酶的穩(wěn)定性。

殼聚糖；蛋白酶；碳二亞胺；化學(xué)修飾；酶學(xué)性質(zhì)

羊毛纖維表面覆蓋著致密的鱗片層，由于纖維間的定向摩擦效應(yīng)，使得毛織物在洗滌過(guò)程中，發(fā)生嚴(yán)重的氈縮現(xiàn)象，導(dǎo)致織物尺寸縮小。傳統(tǒng)的氯化防氈縮整理雖然可以達(dá)到較好的防氈縮效果，但是會(huì)產(chǎn)生有機(jī)氯化物等對(duì)環(huán)境有害的物質(zhì)。因此，環(huán)境友好的生物酶防氈縮整理方法越來(lái)越受到重視［1－3］。

生物酶防氈縮整理主要是利用酶分子對(duì)羊毛纖維表面鱗片的水解作用，破壞鱗片層，達(dá)到防氈縮目的。羊毛防氈縮用蛋白酶Savinase 16L分子量相對(duì)較小，只有26－29 k Da，很容易通過(guò)鱗片間隙的細(xì)胞膜復(fù)合物層擴(kuò)散進(jìn)入纖維主體，水解細(xì)胞間質(zhì)，對(duì)纖維強(qiáng)力造成嚴(yán)重?fù)p傷［1，4－5］。相關(guān)研究表明，通過(guò)化學(xué)修飾使蛋白酶分子量增大到一定程度，則可將酶的作用范圍限制在纖維表面，降低對(duì)纖維主體的損傷［1］。

已報(bào)道的可用于酶修飾的大分子有聚乙二醇（PEG）及其衍生物、環(huán)糊精（Cyclo－ dextrin）、葡聚糖（Dextran）、殼聚糖（Chitosan）等［6－7］。其中，殼聚糖是甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，基本單元是帶有氨基的葡萄糖，分子鏈上分布著大量羥基和氨基，性質(zhì)活潑，是比較合適的大分子修飾劑。目前，以殼聚糖為固定化載體，戊二醛為交聯(lián)劑，將酶固定化的研究較多［8－9］。但在均相體系中，將殼聚糖大分子與蛋白酶偶聯(lián)以改變蛋白酶性能的研究還未見報(bào)道。由于大分子的規(guī)整性和氫鍵作用，殼聚糖只能溶于稀酸中，不溶于水和絕大多數(shù)有機(jī)溶劑，因此，殼聚糖改性的物質(zhì)可以隨著環(huán)境p H值的變化而改變其溶解性［10］。本文正是利用該性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)殼聚糖修飾酶與未修飾酶的分離純化。

EDC（1－ethy－3－（3－dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride）是可溶于水的碳二亞胺，具有活化羧基的作用，可以引發(fā)羧基和伯胺的縮合反應(yīng)［4］。本文利用EDC活化蛋白酶分子的羧基，使之與殼聚糖分子中的伯氨基之間發(fā)生縮合反應(yīng)，形成殼聚糖－蛋白酶偶聯(lián)物，從而達(dá)到增大蛋白酶分子量的目的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑Sephacryl S－200凝膠填料：北京拜爾迪公司提供；蛋白酶（Savinase 16L，16 000 U／g）：Novozymes公司提供；殼聚糖（脫乙酰度≥90%，粘均分子量約40萬(wàn)）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；碳二亞胺（EDC，純度≥98.5%）：上海晶純實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備MF99－3自動(dòng)液相色譜分離層析儀，層析柱（內(nèi)徑1.6 cm，長(zhǎng)50 cm）：上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；F－4600熒光分光光度計(jì)：日本Hitachi公司產(chǎn)品；MOS 450圓二色譜儀：法國(guó)Biologic制造。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白酶的化學(xué)修飾殼聚糖對(duì)蛋白酶的化學(xué)修飾過(guò)程如圖1所示。

圖1 EDC將殼聚糖偶聯(lián)到酶分子上的反應(yīng)歷程Fig.1 Modification of protease with chitosan

參照文獻(xiàn)［10－13］的方法對(duì)蛋白酶進(jìn)行修飾和分離純化。先將殼聚糖溶解在1%（W／V）醋酸溶液中，配制成20 g／L溶液，備用。配制反應(yīng)液，調(diào)節(jié)p H至4，最終體系中含有5%（V／V）蛋白酶、8 g／L殼聚糖。先在室溫下震搖30 min，充分混勻后，加入40 mmol／L EDC，繼續(xù)于室溫反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，用50 mmol／L Tris－HCl（p H 8.5）緩沖液調(diào)節(jié)溶液p H至弱堿性，使產(chǎn)物沉淀。再將其以4 000 r／min的速度離心10 min，棄去上清液，將殼聚糖－蛋白酶偶聯(lián)物分離出來(lái)。

1.2.2 酶活和蛋白質(zhì)濃度測(cè)試采用酪蛋白為底物，測(cè)試蛋白酶在37℃的活力。酶活測(cè)定采用紫外分光光度法［14］，將每分鐘催化酪蛋白水解生成1 μg酪氨酸的酶量定義為一個(gè)活力單位。

蛋白質(zhì)濃度測(cè)試采用考馬斯亮藍(lán)法［15］。

1.2.3 體積排阻色譜檢測(cè)利用紫外檢測(cè)儀在280 nm檢測(cè)蛋白酶的出峰時(shí)間。洗脫液為20 mmol／L醋酸－醋酸鈉緩沖液（p H 4.5），其中含有150 mmol／L氯化鈉。

1.2.4 熒光光譜分析激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，狹縫寬度均為5 nm，測(cè)定蛋白酶在250～500 nm內(nèi)的發(fā)射光譜。

1.2.5 圓二色性譜圖（Circular dichroism measurements，CD）分析掃描波長(zhǎng)范圍190～250 nm，響應(yīng)時(shí)間為1 s，比色皿光程為1 mm。

1.2.6 米氏常數(shù)（K m）的測(cè)定采用 Lineweaver－Burk雙倒數(shù)法，固定蛋白酶濃度，測(cè)試在不同底物濃度下的初速度，以1／［V］為縱坐標(biāo)，1／［S］為橫坐標(biāo)作圖，求出Km。

2 結(jié)果與分析

2.1 洗脫譜圖分析

由于蛋白酶自身既含有羧基又含有伯胺基，在EDC的作用下，很可能發(fā)生自身交聯(lián)。為了驗(yàn)證該交聯(lián)反應(yīng)是否會(huì)發(fā)生，按照相同的修飾配方和反應(yīng)條件，在不加殼聚糖的情況下，將EDC加入蛋白酶溶液中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取EDC修飾和殼聚糖修飾反應(yīng)液進(jìn)行凝膠層析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 修飾酶和未修飾酶的體積排阻色譜洗脫曲線Fig.2 Size exclusion chromatograms of modified and native Savinase

比較洗脫曲線1和2可以發(fā)現(xiàn)，未修飾酶（SAV）只有一個(gè)峰，而 EDC修飾酶（EDC－SAV）反應(yīng)液有兩個(gè)洗脫峰。經(jīng)檢測(cè)，EDC－SAV反應(yīng)液的兩個(gè)峰都有酶活，且第一個(gè)峰的出峰時(shí)間比SAV提前約20 min，第二個(gè)峰應(yīng)該是在交聯(lián)反應(yīng)中沒有被修飾的酶，其峰值比反應(yīng)前小。這說(shuō)明在EDC的作用下，反應(yīng)液中出現(xiàn)了新的大分子量物質(zhì)，很有可能蛋白酶分子自身發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，EDC－SAV反應(yīng)液洗脫曲線中，第一個(gè)洗脫峰的峰值逐漸變大，而第二個(gè)峰值不斷減小。

在單獨(dú)EDC修飾反應(yīng)中，進(jìn)行蛋白酶活力測(cè)試，發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活并沒有發(fā)生明顯變化。這表明，分子間交聯(lián)反應(yīng)沒有對(duì)酶的活性中心造成影響。

殼聚糖分子中含有大量伯胺基，當(dāng)酶分子被大量殼聚糖分子包圍時(shí)，在EDC的作用下，理論上可以形成以酰胺鍵連接的殼聚糖－蛋白酶偶聯(lián)物。比較殼聚糖修飾酶（CS－SAV）反應(yīng)液和殼聚糖（CS）溶液的洗脫曲線可知，前者也有兩個(gè)洗脫峰。第一個(gè)峰的出峰時(shí)間雖然沒有比單獨(dú)殼聚糖溶液明顯提前，但在280 nm的吸收增大，這表明部分蛋白酶被偶聯(lián)后分子量變大，提前被洗脫出來(lái)。同時(shí)由于殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量（40萬(wàn)）比較大，且分布比較寬，與小分子量的蛋白酶偶聯(lián)后，分子量分布并沒有發(fā)生顯著變化，造成出峰時(shí)間與殼聚糖相比沒有太大區(qū)別。第二個(gè)峰是反應(yīng)中未被修飾的蛋白酶，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，峰值逐漸變小。

2.2 圓二色性光譜（CD）分析

在遠(yuǎn)紫外區(qū)進(jìn)行CD測(cè)試，觀察蛋白酶被修飾后的構(gòu)象變化。CD譜的變化直接反應(yīng)了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。圖3為修飾前后蛋白酶的CD譜圖，表1為根據(jù)圖3計(jì)算得到的各結(jié)構(gòu)單元的百分含量。

圖3 修飾酶和未修飾酶的圓二色性譜圖Fig.3 Circular dichroism spectra of modified and native Savinase

表1 修飾后蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Tab.1 The secondary structure of modified Savinase

從圖3可以看出，SAV的橢圓度［θ］在220 nm處達(dá)到最低值，EDC－SAV的最低值也在220 nm，而CS－SAV在217 nm處值最小，峰位發(fā)生藍(lán)移。結(jié)合表1可以發(fā)現(xiàn)，未修飾酶分子以α－螺旋構(gòu)象和無(wú)規(guī)卷曲為主；單獨(dú)EDC修飾后，酶分子的各結(jié)構(gòu)單元含量均未發(fā)生變化。為了更好地說(shuō)明殼聚糖修飾后蛋白酶分子的結(jié)構(gòu)變化，直接將蛋白酶與殼聚糖按照修飾配方物理混合（CS＋SAV）后進(jìn)行CD測(cè)試，發(fā)現(xiàn)α－螺旋和β－折疊等各結(jié)構(gòu)單元含量基本不變；加入EDC使殼聚糖與蛋白酶偶聯(lián)后，α－螺旋的含量從34.8%提高到80.6%，而無(wú)規(guī)卷曲的含量下降到15.3%，β－折疊和轉(zhuǎn)角的含量也相應(yīng)減少，說(shuō)明CS－SAV的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化。

2.3 熒光光譜分析

在天然蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中，酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe）這3種氨基酸會(huì)發(fā)射熒光。由于Tyr、Trp和Phe側(cè)鏈的疏水性，一般情況下，這些基團(tuán)分布在蛋白質(zhì)內(nèi)核的疏水區(qū)［16－17］。修飾和未修飾酶的熒光發(fā)射光譜如圖4所示。

在280 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，未修飾酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)為340.4 nm；EDC修飾后，最大發(fā)射波長(zhǎng)未發(fā)生變化；殼聚糖與蛋白酶物理混合后最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移到346.4 nm，熒光強(qiáng)度下降了70.9%；殼聚糖修飾酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)為345.4 nm，熒光強(qiáng)度比未修飾酶弱，稍強(qiáng)于兩者直接物理混合的熒光強(qiáng)度。在280 nm處激發(fā)產(chǎn)生的熒光，主要是色氨酸殘基的熒光發(fā)射［16－17］。上述現(xiàn)象，可能是由于殼聚糖修飾后，蛋白酶的結(jié)構(gòu)更加緊湊，色氨酸被包埋的更深所致。此外，單獨(dú)EDC修飾蛋白酶后，熒光強(qiáng)度也有所降低。殷海波在半乳糖修飾葡萄糖氧化酶的研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，即修飾酶的發(fā)射峰位紅移，熒光強(qiáng)度明顯降低［18］。

圖4 修飾酶和未修飾酶的熒光發(fā)射光譜Fig.4 Fluorescence emission spectra of modified and native Savinase

綜上可知，單獨(dú)EDC修飾后，蛋白酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)變化都不大。因此，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中均只研究殼聚糖修飾后蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)變化。

2.4 殼聚糖修飾酶的表觀米氏常數(shù)變化

Km是酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的重要常數(shù)，反映酶與底物親和力的大小。根據(jù)Lineweaver－Burk方程，可計(jì)算Km。圖5為殼聚糖修飾前后蛋白酶的Lineweaver－Burk雙倒數(shù)圖。

殼聚糖修飾后，蛋白酶的Km從20.62 g／L提高到35.21 g／L，說(shuō)明CS－SAV與底物酪蛋白之間的親和力變小。這可能是由于CS－SAV的結(jié)構(gòu)更加規(guī)整、緊湊，造成酶分子的活性中心與底物結(jié)合時(shí)，缺乏與底物結(jié)合所必要的分子鏈柔韌性，構(gòu)象變化受到限制，從而導(dǎo)致其與底物之間的親和力減??；也可能是由于蛋白酶被修飾后，酶分子量和體積均增大，底物酪蛋白的分子量也比較大，在空間位阻的作用下，難以與酶的活性中心接近，故表觀米氏常數(shù)增大［4，19］。

圖5 修飾酶和未修飾酶的Lineweaver－Burk圖Fig.5 Lineweaver－Burk plot of modified and native Savinase

2.5 溫度對(duì)殼聚糖修飾酶活力的影響

修飾和未修飾酶在不同溫度下的活力如圖6所示。

圖6 修飾酶和未修飾酶在不同溫度下的酶活曲線Fig.6 Temperature－activity profile of modified and native Savinase

從圖6可以看出，在p H 6的磷酸鹽緩沖溶液（20 mmol／L）中，SAV在55℃時(shí)活力最高，并且在70℃以下溫度范圍內(nèi)都具有很高活力。蛋白酶與殼聚糖物理混合后，蛋白酶的溫度－酶活曲線幾乎沒有發(fā)生變化。殼聚糖修飾后，蛋白酶的最適溫度仍保持在55℃；此外，CS－SAV在80℃還能保持最適溫度時(shí)60%以上的酶活，而SAV在80℃只殘留30%左右的酶活，表明CS－SAV的適用溫度范圍更寬。

2.6 殼聚糖修飾酶的熱穩(wěn)定性變化

蛋白酶的使用溫度一般都在其最適溫度，故考察在最適溫度55℃保溫不同時(shí)間后，修飾和未修飾酶的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7所示。

圖7 修飾酶和未修飾酶在55℃的熱穩(wěn)定性曲線Fig.7 Thermal stability profile of modified and native Savinase

由圖7可知，SAV在55℃、p H 5的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液（20 mmol／L）中的熱穩(wěn)定性較好，處理180 min后，仍能保留90%以上的活力；蛋白酶與殼聚糖物理混合后，蛋白酶的熱穩(wěn)定性沒有受到顯著影響，僅在前90 min內(nèi)酶活穩(wěn)定性稍有提高；CSSAV的穩(wěn)定性也很好，稍高于SAV。這可能是由于殼聚糖共價(jià)偶聯(lián)到酶分子上后，在較高溫度下酶分子的構(gòu)象變化受到限制，減少了分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動(dòng)，使其不易失活［16］；也可能是由于殼聚糖的大分子長(zhǎng)鏈包圍在酶分子周圍，對(duì)蛋白酶起到了一定保護(hù)作用，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性提高［20］，這應(yīng)該也是造成物理混合后蛋白酶熱穩(wěn)定性稍有提高的原因之一。但是，由于SAV在55℃的熱穩(wěn)定性已經(jīng)很好，故CS－SAV熱穩(wěn)定性提升的空間并不大。

3 結(jié)語(yǔ)

1）在EDC的活化作用下，蛋白酶分子自身發(fā)生交聯(lián)，但是該反應(yīng)并不影響蛋白酶的活力，修飾后蛋白酶的結(jié)構(gòu)也未發(fā)生明顯變化。

2）從圓二色譜計(jì)算結(jié)果可知，殼聚糖修飾后，蛋白酶分子中無(wú)規(guī)卷曲的含量從32.1%下降到15.3%，無(wú)規(guī)卷曲減少，表明蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)更加規(guī)整。

3）熒光發(fā)射光譜分析表明，殼聚糖修飾后，蛋白酶的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)從340.4 nm紅移到345.4 nm，且熒光強(qiáng)度顯著降低，揭示了修飾酶的結(jié)構(gòu)更加緊湊。

4）根據(jù)Lineweaver－Burk方程計(jì)算可知，殼聚糖修飾后，蛋白酶的Km從20.62 g／L提高到35.21 g／L，說(shuō)明修飾酶與底物之間的親和力變小。

5）殼聚糖修飾酶的最適溫度沒有發(fā)生變化，仍為55℃，而在70℃以上高溫下的穩(wěn)定性得到提高，適用范圍變寬。

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Preparation of Chitosan Conjugated Protease Used for Shrink Resistance of Wool and Its Properties

CHEN Ren－ren，YUAN Jiu－gang，YU Yuan－yuan，F(xiàn)AN Xue－rong，WANG Qiang＊，ZHU Yi－ran

（Key Laboratory of Science and Technology of Eco－Textile，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Chitosan was covalently coupled to protease（Savinase 16L）with water－soluble carbodiimide to enlarge its molecular weight，with the purpose of reducing enzymatic damage to wool fibres in anti－felting finishing.It was found that the secondary and the whole structures of the modified protease were much more regular and compact than the native one.The conjugated protease presented a lower affinity towards casein with an increase in Km from 20.62 g／L to 35.21 g／L.There was no change in optimum temperature（55℃）for the modified protease while its thermal stability at 55℃ was improved.Compared to the native enzyme，the modified protease displayed higher stability above 70℃.

chitosan，savinase 16L，EDC，chemical modification，enzymatic properties

TS 201

A

1673－1689（2012）05－0505－06

2011－05－09

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2008AA02Z203）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51073073）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2009073）；江蘇省高等學(xué)校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（蘇教科2009－10號(hào)）。

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王強(qiáng)（1973－），男，黑龍江佳木斯人，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事紡織生物技術(shù)研究。E－mail：qiang＿wang＠163.com