聶忠莉，王曉玲，歐世榮，張 勇

(1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都 610106;2.成都欣捷高新技術(shù)開發(fā)有限公司，四川成都 610041)

0 引言

羅庫溴銨(Rocuronium Bromide，Roc)是一種新型非去極化甾醇類肌松藥物，能對神經(jīng)—肌肉接點產(chǎn)生阻滯作用，可暫時性干擾神經(jīng)—肌肉間興奮的傳遞而使骨骼肌松弛［1］.臨床上用于全神麻醉輔助，維持術(shù)中肌松［2，3］.由于羅庫溴銨生產(chǎn)工藝中使用了較大量的溴丙烯，其可能產(chǎn)生殘留而對人體造成傷害，且目前歐洲藥典［4］和USP［5］公示標準均未收載溴丙烯的檢測方法.故本實驗對溴丙烯含量的測定進行了研究，建立了一種基于HPLC法的檢測方法，并對其進行了方法學(xué)驗證.實驗表明，本檢測方法操作簡單，專屬性強，精密度好，結(jié)果準確可靠，將其收載到羅庫溴銨質(zhì)量標準中，可確保該產(chǎn)品的質(zhì)量可靠及用藥的安全性.

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

實驗所用儀器包括:LC-10ATvp/SPD-10Avp高效液相色譜儀(日本島津公司)，TU-1800SPC紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，pHS-3C酸度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠).

1.2 試 藥

實驗所用藥品包括:羅庫溴銨(批號，081201、081202、090101)由成都新恒創(chuàng)藥業(yè)有限公司提供，溴丙烯對照品來源于SIGMA-ALDRICH，四甲基氫氧化銨、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水.

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測波長確定

2.2 色譜條件

通過實驗分析確定，本實驗的色譜條件為:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以四甲基氫氧化銨溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.0)—乙腈(4∶6)為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm.

2.3 溶液配制

(1)溴丙烯對照溶液的制備.精密稱取溴丙烯對照品25.12 mg置25 mL量瓶中，用乙腈—水(9∶1)溶解并稀釋至刻度，搖勻.再精密量取1 mL置100 mL量瓶中，用乙腈—水(9∶1)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液.

(2)供試品溶液的制備.精密稱取羅庫溴銨(081201)104.01 mg置10 mL量瓶中，用乙腈∶水(9∶1)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液.

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

取上述溴丙烯對照溶液和供試品溶液，按“2.2”項下條件進樣，記錄色譜圖，結(jié)果如圖1所示.

圖1 溴丙烯HPLC圖譜

從圖1可知，溴丙烯在7.075 min出峰，而羅庫溴銨樣品中溴丙烯與前后雜質(zhì)峰的分離度為4.25/ 3.98，分離度好，理論塔板數(shù)13 460(大于10 000).

2.5 專屬性試驗

精密稱取羅庫溴銨樣品適量分別進行強酸、強堿、氧化、高溫和光照破壞性試驗.并取上述專屬性試驗樣品溶液，分別進樣.實驗發(fā)現(xiàn)，樣品中溴丙烯主峰與各雜質(zhì)峰能夠得到很好分離，證明實驗色譜條件專屬性良好.同時，從各破壞試驗的圖譜顯示，在各實驗條件下，溴丙烯的峰高都有所增加，氧化破壞增加最大，堿破壞最小.此也說明羅庫溴銨在生產(chǎn)和貯藏過程中應(yīng)檢測和控制溴丙烯的含量.

2.6 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗

精密稱取溴丙烯對照品適量，用乙腈—水(6∶4)配制成0.01 mg/mL的溶液，作為供試品溶液.精密量取該溶液5 μL進樣，記錄色譜圖，并重復(fù)操作6次，其峰面積的RSD計算值為0.9%.精密稱取羅庫溴銨(081201)適量，用乙腈—水(6∶4)配制成10.0 mg/mL的溶液，作為供試品溶液，分別于，0 h、1 h、2 h、4 h、6 h，各精密量取該溶液5 μL進樣測定，記錄色譜圖，其峰面積的RSD計算值為1.5%.實驗結(jié)果表明，供試品溶液重復(fù)性良好，且在6 h內(nèi)相對穩(wěn)定.

2.7 檢測限和定量限

精密稱取溴丙烯對照品適量，分別加乙腈—水(6∶4)逐級稀釋成101.28 ng/mL、40.512 ng/mL、20.256 ng/mL、10.128 ng/mL的溶液，作為供試品溶液.按實驗色譜條件，分別取上述溶液各5 μL注入液相色譜儀.實驗結(jié)果表明:濃度為10.128 ng/ mL的溶液的峰高為噪音峰高的3.4倍，以S/N=3時計算，檢測限為0.044 ng;濃度為40.512 ng/mL的溶液的峰高為噪音峰高的10.0倍，以S/N=10時計算，定量限為0.203 ng.

隧道管片的受力比較接近于單向受力狀態(tài)，管片的疲勞壽命是由其拉、壓狀態(tài)共同決定的。因此，采用單軸受拉疲勞經(jīng)驗公式(7)[29]來對管片進行受力計算，采用單軸受壓疲勞經(jīng)驗公式(8)[30]對管片的疲勞壽命進行驗算，其計算公式如下：

2.8 線性實驗

精密稱取溴丙烯對照品適量，用乙腈∶水(6∶4)制成不同濃度的溶液，按實驗色譜條件，分別進樣5 μL，并記錄主峰面積，結(jié)果如表1所示.

表1 溴丙烯線性實驗

以峰面積(A)為縱坐標，供試品濃度(C)為橫坐建立線性方程，并進行回歸處理，其結(jié)果如圖2所示.

圖2 溴丙烯含量測定線性關(guān)系圖

當(dāng)溴丙烯濃度在0.528 μg/mL～105.6 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，峰面積和濃度呈線性關(guān)系，其線性方程為，

此表明，溴丙烯在此濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.9 加樣回收率試驗

(1)對照品溶液.精密稱取溴丙烯對照品適量，加乙腈—水(6∶4)配制成10 μg/mL的溶液，搖勻即得.

(2)供試品溶液.精密稱取溴丙烯對照品適量，分別用乙腈∶水(6∶4)配制成76.12 μg/mL、106.24 μg/mL、128.72 μg/mL的溶液，搖勻，作為儲備液;再精密稱取羅庫溴銨(081201)樣品11份，每份約100 mg，分別置10 mL量瓶中，其中9份分別用加入3種濃度的儲備液各1.0 mL，每個濃度各取3份并用乙腈—水(6∶4)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，其余2份分別用乙腈—水(6∶4)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為樣品溶液.

(3)測定法.分別精密量取上述各溶液5 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算.

溴丙烯回收率實驗結(jié)果如表2所示.

表2 溴丙烯回收率實驗結(jié)果

表2數(shù)據(jù)表明，在本實驗色譜條件下，樣品回收率較好，能準確地測定出羅庫溴銨樣品中溴丙烯的含量.

2.10 測定方法

(1)采用高效液相色譜法測定，并嚴格按照2010年版《藥典》(二部)相關(guān)要求進行.

(2)色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗.以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以四甲基氫氧化銨溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸調(diào)節(jié)pH至5.0)—乙腈(4∶6)為流動相;流速:1.0 mL/min;檢測波長為210 nm;理論塔板數(shù)按溴丙烯峰計算應(yīng)不低于10 000.

(3)測定法.取溴丙烯對照品適量精密稱定，加乙腈—水(6∶4)溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含10 μg的溶液，作為對照品溶液;另取羅庫溴銨樣品適量，加乙腈—水(6∶4)溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含10.0 mg的溶液，作為供試品溶液.分別精密量取對照品溶液和供試品溶液各5 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖.如供試品圖譜中與溴丙烯對照品主峰相同保留時間處出現(xiàn)雜質(zhì)峰，按外標法以峰面積計算，不得過0.1%.

2.11 樣品測定

取3批羅庫溴銨樣品，按“2.9”項下方法制備供試品溶液進樣測定，按外標法以峰面積計算羅庫溴銨中溴丙烯的含量，測量結(jié)果如表3所示.

表3 羅庫溴銨樣品中溴丙烯含量的測定結(jié)果

表3數(shù)據(jù)表明，3批羅庫溴銨中溴丙烯的含量分別為0.0009%、0.0021%、0.0014%，均未超過0.1%.

3 討論

溴丙烯在C18和硅膠柱峰均可與羅庫溴銨及有關(guān)物質(zhì)峰相分離，但溴丙烯硅膠柱峰的峰形較差，其保留時間與羅庫溴銨的保留時間較近，且與前后峰之間的分離度較差，故本研究在實驗時選用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，其峰形好，保留時間恰當(dāng)，與前后峰之間的分離度符合要求.

在實驗中，參考《歐洲藥典》中羅庫溴銨的質(zhì)量標準，對溴丙烯檢測中的流動相、流速等條件進行了篩選，分別比較了流動相為四甲基氫氧化銨溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.4)—乙腈(1∶9)(2∶8)(3∶7)(4∶6)、四甲基氫氧化銨溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.0)—乙腈(4∶6)、四甲基氫氧化銨溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0)—乙腈(4∶6)、四甲基氫氧化銨溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.0)—乙腈(4∶6).結(jié)果顯示，流動相為四甲基氫氧化銨溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.0)—乙腈(4∶6)，流速為1.0 mL·min－1時，溴丙烯與前后峰之間的分離度最佳，故選之.

溴丙烯、羅庫溴銨及有關(guān)物質(zhì)在水和乙腈中均易溶解.本研究分別比較了用水、乙腈、水—乙腈(1∶9)、水—乙腈(4∶6)及流動相作為溶劑.結(jié)果顯示，用水—乙腈(4∶6)作為溶劑時，其峰形好，基線穩(wěn)定.

在3批羅庫溴銨樣品中，均定量檢出溴丙烯，表明羅庫溴銨質(zhì)量標準中收載溴丙烯的檢查項有其科學(xué)性和必要性.

綜上所述，本研究建立的利用HPLC法測定羅庫溴銨中溴丙烯的含量的方法靈敏度高、專屬性強、結(jié)果準確可靠，故建議將本測定方法收載到羅庫溴銨質(zhì)量標準中，以確保羅庫溴銨質(zhì)量的可靠與用藥的安全.

［1］裴凌，盛卓人.羅庫溴銨歐洲研討會綜述［J］.國外醫(yī)學(xué)—麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊，1995，16(4):219－221.

［2］孔穎.羅庫溴銨用于麻醉誘導(dǎo)的臨床觀察［J］.海峽藥學(xué)，2004，16(2):96－97.

［3］查顯忠，夏曉瓊.羅庫溴銨用于全麻誘導(dǎo)氣管插管的臨床觀察［J］.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，27(3):231－234.

［4］歐盟藥典委員會.歐洲藥典6.0［S］.斯特拉斯堡:歐洲藥品質(zhì)量管理局，2008:2835－2837.

［5］美國藥典委員會.美國藥典(USP)［EB/OL］.http:// www.usp.org/USPNF.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.