余佳 向明亮 吳皓 沈晨凌

研究表明，鳥耳蝸毛細(xì)胞損傷后能夠完全再生、重獲神經(jīng)再支配并完成神經(jīng)再支配的重塑[1,2]，隨著雞耳蝸毛細(xì)胞及其神經(jīng)支配形態(tài)的恢復(fù)，其聽功能亦得以明顯恢復(fù)[3]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，ephrinA2在雞卡那霉素中毒后耳蝸毛細(xì)胞神經(jīng)連接的再生及重塑過程中可能起重要作用[4,5]。慢病毒載體是一種復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，與化學(xué)合成的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA) 以及基于瞬時表達(dá)載體構(gòu)建的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA) 相比，它可以轉(zhuǎn)染后兩者難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，提高siRNA的轉(zhuǎn)染效率；此外，病毒攜帶的基因片段尚能夠整合至靶細(xì)胞基因組，提供長期穩(wěn)定的siRNA表達(dá)，沉默靶基因[6]。為研究ephrinA2在雞卡那霉素中毒后耳蝸毛細(xì)胞神經(jīng)連接的再生及重塑過程中的作用及作用機(jī)制，本研究擬構(gòu)建編碼ephrinA2蛋白的EFNA2基因的RNA干擾(RNA interference，RNAi)慢病毒載體,并在離體培養(yǎng)的原代雞聽神經(jīng)細(xì)胞中驗(yàn)證其靶基因沉默效率，為后續(xù)在體實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 健康純種、出生10～16 d羅曼雞10只，雌雄不拘(由上海歸興種雞廠提供)。病毒載體系統(tǒng)pFU-GW-iRNA(上海吉凱基因有限公司)，293T細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞所)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invirtrogen)，限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶(NEB)，Taq酶(TaKaRa)，質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Qiagen)，SYBR Real-time PCR試劑盒(TaKaRa)。DMEM/F12、胎牛血清、胰酶、D-hanks液、B-27神經(jīng)生長因子(Gibco),多聚賴氨酸(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),鼠抗GFP抗體、鼠抗GAPDH抗體、羊抗鼠IgG抗體(Santa Cruz公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1EFNA2 RNAi慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 針對目的基因EFNA2(GeneBank：NM_204983 大小603 bp )的基因序列，按照RNA干擾序列的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)、合成4個siRNA的寡核苷酸序列(KD-1、2、3、4，表1),并進(jìn)行慢病毒載體的構(gòu)建(雙鏈DNA具體序列見表2)。然后運(yùn)用T4連接酶與經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Hpa I、Xho I雙酶切后的pFU-GW-iRNA載體連接。用氯化鈣法制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株,最后挑取陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定并進(jìn)行測序分析。PCR鑒定陽性克隆的引物信息如下：Up (+) 5′- GCC CCG GTT AAT TTG CAT AT -3′; Down (-) 5′- GAG GCC AGA TCT TGG GTG -3′。

表1 siRNA序列信息

表2 siRNA病毒載體構(gòu)建框架

1.2.2EFNA2過表達(dá)載體的構(gòu)建 為后續(xù)外源篩靶的需要，同時構(gòu)建EFNA2 過表達(dá)載體，具體方法如下：從含有目的基因EFNA2的質(zhì)粒克隆模板中，利用PCR方法擴(kuò)增目的基因，將PCR產(chǎn)物連接入Age I酶切后線性化pGC-FU 載體慢病毒載體中，純化酶切產(chǎn)物后進(jìn)行定向連接、轉(zhuǎn)化，挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定并提取重組質(zhì)粒及測序鑒定，將構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提。

1.2.3EFNA2-RNAi干擾有效靶點(diǎn)的篩選 轉(zhuǎn)染前一天將293T細(xì)胞按5×104個/ml 接種于24 孔板中，待其生長達(dá)80%～90%融合時，按照下述實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染：實(shí)驗(yàn)分成2大組，每孔分別使用0.25 μg和0.5 μg的干擾質(zhì)粒,每大組分為6小組：EFNA2的過表達(dá)質(zhì)粒(均為0.5 μg)與含有針對EFNA2的不同干擾靶點(diǎn)序列的RNAi病毒載體質(zhì)?；旌?，記為KD1～4組(干擾組1～4)；與RNAi空載質(zhì)粒混合記為MOCK組(轉(zhuǎn)染試劑對照組)；與RNAi陰性對照病毒載體質(zhì)粒混合記為NC組(陰性對照組)。同時設(shè)定不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的293T細(xì)胞組記為CON組(空白對照組)。把質(zhì)粒 DNA 與Lipofectamine 2000 (2 μl)的混合液加入293T 細(xì)胞中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h，換成新鮮的含10%血清的完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后24 h熒光顯微鏡下觀察預(yù)估轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染率高于70%時，轉(zhuǎn)染后 36～48 h收集細(xì)胞，抽提總蛋白進(jìn)行Western blot 檢測，進(jìn)而判斷不同靶點(diǎn)的干擾效果，否則重新轉(zhuǎn)染。

1.2.4慢病毒顆粒的包裝和滴度測定 對含有效干擾靶點(diǎn)的shRNA進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝，將重組慢病毒pFU-GW-GFP載體及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒pHelper1.0及pHelper2.0按Lipofectamine 2000 使用說明進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8 h 更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，將濃縮后得到的高滴度的慢病毒濃縮液，在293T 細(xì)胞中測定并標(biāo)定病毒滴度，分裝后保存在病毒管中，-80 ℃長期保存。病毒濃縮液采用10倍逐孔稀釋滴度(10～10-6μl，8個梯度)測定法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后通過慢病毒載體上的GFP熒光來測定和計(jì)算病毒滴度。

1.2.5原代雞聽神經(jīng)細(xì)胞的制備 將已麻醉的動物置于超凈臺上，解剖顯微鏡下解剖分離采取聽神經(jīng)組織，置入預(yù)冷的D-HANKS液中，將聽神經(jīng)組織置入0.25%胰酶和0.1%DNA酶中37 ℃下水浴消化30 min，酶解后加入含有血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化并離心(5 min，300 g)，棄上清并加入2 ml終溶液(無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液+2%B27神經(jīng)生長因子+雙抗)[7]，使用已消毒過火的玻璃滴管反復(fù)輕柔吹打組織進(jìn)一步游離細(xì)胞，置于冰上靜置數(shù)分鐘后吸取上清液即獲得聽神經(jīng)細(xì)胞懸液，反復(fù)上述操作，直至組織吹打成絮狀[8]。將收集的細(xì)胞懸液按1×106/孔細(xì)胞接種于已使用多聚賴氨酸包被的12孔板中，置于37 ℃ 5% CO2全自動恒溫孵箱中靜置培養(yǎng),根據(jù)pH值及細(xì)胞生長情況更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)到30%時轉(zhuǎn)染病毒。

1.2.6EFNA2 RNAi慢病毒感染原代雞聽神經(jīng)細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)分為5組：CON(空白對照組)為正常目的細(xì)胞且未感染任何病毒的細(xì)胞組，NC(陰性對照組)為正常目的細(xì)胞但加陰性對照病毒感染的細(xì)胞組，KD1～3(干擾組1～3)為正常目的細(xì)胞加有RNAi靶點(diǎn)病毒感染的細(xì)胞組，1～3表示待篩選靶點(diǎn)病毒的序號。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分組情況加入感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為1的RNAi慢病毒顆粒進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。感染72 h后采用熒光顯微鏡觀察慢病毒RNAi質(zhì)粒上報告基因GFP的表達(dá)(綠色熒光)，感染效率需達(dá)80%以上，否則重新感染。

1.2.7Quantative Real-time PCR法檢測EFNA2基因mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后5 d收集感染效率達(dá)80%以上的細(xì)胞，使用Trizol按說明抽提總RNA，然后根據(jù)TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取 2 μl作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，EFNA2上游引物：5'- CCC TGA ACG TGG TGG ACA GA- 3'；下游引物：5'- GCA CGA GTT GTT GCT GGT GAA- 3'。β-actin 作為內(nèi)參對目的基因EFNA2進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，β-actin 上游引物：5'- AAA TAA AGC CAT GCC AAT CTC GTC- 3'；下游引物：5'- ATT GTC CAC CGC AAA TGC TTC- 3'。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性950C、15 s之后每一步變性950C、5 s，退火延伸600C、34 s；共進(jìn)行40個循環(huán)，每次在延伸階段讀取吸光度值。Real-time PCR數(shù)值分析采用2-ΔΔCt分析法。

1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 9.13軟件統(tǒng)計(jì)包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具體方法為參數(shù)統(tǒng)計(jì)ANOVA檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1陽性克隆的PCR鑒定 含有正確插入RNA干擾慢病毒載體(virus-induced short-hairpin RNA，vshRNA)片段的重組克隆的PCR產(chǎn)物343 bp，未連接vshRNA片段的空載體PCR片段大小為299 bp，可見4種質(zhì)粒均有4個克隆含有正確插入的片段(圖1)，PCR鑒定為陽性的克隆，證明shRNA已經(jīng)定向連入pFU-GW-iRNA表達(dá)載體，選取連接成功的克隆測序，測序結(jié)果表明合成的EFNA2 shRNA寡核苷酸鏈序列插入正確，shRNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 siRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定

2.2EFNA2基因的過表達(dá)載體pGC-FU-EFNA2-GFP的鑒定 對長出的克隆先進(jìn)行PCR鑒定，菌落PCR顯示從重組質(zhì)粒中可擴(kuò)增出大小約807 bp的目的條帶(圖2)，可見8個克隆中有4個為陽性克隆(EFNA2-2,4,6,8),用啟動子引物進(jìn)行測序，測序結(jié)果證實(shí)已將EFNA2基因編碼框正確插入pGC-FU載體的多克隆位點(diǎn)(MCS),pGC-FU-EFNA2-GFP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 EFNA2基因過表達(dá)融合蛋白載體pGC-FU-ELF-1-GFP PCR陽性克隆鑒定

2.3Western blot外源篩選靶點(diǎn) 使用凝膠圖像處理系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行灰度分析(圖3)，可以看出KD1、KD2、KD4靶點(diǎn)對目的基因的表達(dá)有敲減作用，因而是有效靶點(diǎn)。

圖3 Western blot檢測293T細(xì)胞中ephrinA2蛋白的表達(dá)

2.4慢病毒載體的包裝及滴度測定 篩選出的3個有效重組載體(KD1、KD2、KD4)與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集病毒粗提液進(jìn)行濃縮，分別命名為LV-GFP-EFNA2-shRNA-l、LV-GFP-EFNA2-shRNA-2、LV-GFP=EFNA2-shRNA-3，利用孔稀釋法分別測定3個靶點(diǎn)的病毒滴度，結(jié)果均為2E+9 TU/ml，病毒成功包裝,可用于后續(xù)研究。

2.5目的細(xì)胞EFNA2 RNAi 效果檢測 3個不同干擾靶點(diǎn)的病毒分別感染正常目的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72小時后，在熒光顯微鏡下可觀察到慢病毒RNAi質(zhì)粒上GFP(綠色熒光)的表達(dá)(表3，圖4)。轉(zhuǎn)染5 d后收集目的細(xì)胞提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR檢測目的細(xì)胞中EFNA2 mRNA水平表達(dá)的變化情況，結(jié)果顯示三個干擾靶點(diǎn)均有干擾效果，其干擾效率分別為：LV-GFP-EFNA2-shRNA-1：76.11%, LV-GFP-EFNA2-shRNA-2：61.87%, LV-GFP-EFNA2-shRNA-3：68.44%。

表3 目的細(xì)胞轉(zhuǎn)染5 d后EFNA2 mRNA表達(dá)水平( (2-ΔΔCt)

注：*與CON組和NC組比較，P< 0.05；CON：未感染慢病毒細(xì)胞組；NC：感染陰性對照病毒細(xì)胞組；shRNA1：感染LV-GFP-EFNA2-shRNA-1細(xì)胞組；shRNA2：感染LV-GFP-EFNA2-shRNA-2細(xì)胞組；shRNA3：感染LV-GFP-EFNA2-shRNA-3細(xì)胞組

圖4 目的細(xì)胞EFNA2沉默效果檢測

3 討論

Ephrin作為已知的軸突導(dǎo)向分子之一，與其受體Eph相互作用可影響鳥類耳蝸以及聽覺神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，在神經(jīng)末梢準(zhǔn)確地投射、定位、支配新生毛細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用[9～11]。文獻(xiàn)報道，ephrinA2 及其受體EphA3等在胚胎雞的耳蝸神經(jīng)節(jié)、位聽神經(jīng)末梢組織中均有表達(dá),并且其蛋白表達(dá)部位及量的差異，影響胚胎雞位聽神經(jīng)靶標(biāo)的選擇及其神經(jīng)末梢的投射[11]。此前的研究[5]進(jìn)一步顯示， ephrinA2在雞耳蝸毛細(xì)胞及其神經(jīng)支配的損傷修復(fù)中可能有著重要作用， Lee亦有相似報道[4]。因此深入研究ephrinA2在鳥類耳蝸毛細(xì)胞及其神經(jīng)支配的再生及重塑中的作用及作用機(jī)制將有助于闡明相關(guān)形態(tài)現(xiàn)象發(fā)生的分子基礎(chǔ)。

為進(jìn)一步滿足在體動物實(shí)驗(yàn)研究的需要，本研究的主要目的為構(gòu)建包裝針對雞EFNA2基因的RNAi慢病毒載體，并在體外驗(yàn)證其沉默靶基因的效率。根據(jù)GeneBank中編碼雞ephrinA2蛋白的EFNA2基因信息，本研究設(shè)計(jì)合成了4對干擾靶序列，分別與pFU-GW-iRNA載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到能容許多外源DNA的載體分子通過的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR篩選陽性克隆、測序鑒定，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的序列一致，成功構(gòu)建4對siRNA-EFNA2慢病毒載體。因?qū)嶒?yàn)外源篩靶需要，同時構(gòu)建目的基因過表達(dá)載體pGC-FU-EFNA2-GFP，陽性克隆測序序列與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致，說明目的基因已插入到真核表達(dá)載體中。siRNA-EFNA2病毒載體與目的基因的表達(dá)克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，從Western Blot結(jié)果可以看出，在55 KD附近有陽性條帶，4個靶點(diǎn)中，KD1、KD2、KD4對目的基因的表達(dá)有較為顯著的敲減作用。將含有有效干擾靶點(diǎn)的重組載體經(jīng)包裝后病毒滴度達(dá)到2.0×109TU/ml，分別命名為LV-GFP-EFNA2-shRNA-l、LV-GFP-EFNA2-shRNA-2、LV-GFP=EFNA2-shRNA-3。3個慢病毒載體分別感染原代雞聽神經(jīng)細(xì)胞后，EFNA2基因表達(dá)均顯著降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的雞EFNA2基因的RNAi慢病毒載體在離體培養(yǎng)的原代雞聽神經(jīng)細(xì)胞中能持續(xù)、高效、特異地抑制靶基因EFNA2的表達(dá)。本研究為下一步在體研究ephrinA2在雞卡那霉素中毒后耳蝸毛細(xì)胞神經(jīng)連接的再生及重塑過程中的作用及作用機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。

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