魏華，劉敏，鮑時翔，朱軍，黃惠琴*

(1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南海口570228;2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71101)

根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)是一類分布廣、危害大、難以防治的植物寄生線蟲，嚴(yán)重危害農(nóng)作物生產(chǎn)。在我國熱帶、亞熱帶地區(qū)及寒帶溫室內(nèi)作物、蔬菜中都有根結(jié)線蟲發(fā)生，一般農(nóng)作物會減產(chǎn)10%左右，嚴(yán)重的高達(dá)75%以上［1］。此外，根結(jié)線蟲能使真菌和細(xì)菌更易于侵染植物，是誘發(fā)植物病害的重要原因之一［2］。防治根結(jié)線蟲病害主要采用化學(xué)農(nóng)藥，毒性高，且污染環(huán)境。近年來，從微生物代謝產(chǎn)物中尋找具有抗根結(jié)線蟲活性的物質(zhì)，受到國內(nèi)外的高度重視。紅樹林生長于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶，受周期性潮水浸淹，是以紅樹植物為主體的木本植物群落，主要分布在南北緯30度之間［3］，是熱帶、亞熱帶海岸地帶重要的濕地類型，同時也是陸地向海洋過渡的特殊生態(tài)系統(tǒng)。該生境具有強(qiáng)還原性、強(qiáng)酸性、高含鹽量、營養(yǎng)豐富等特征，蘊(yùn)藏著豐富且獨(dú)特的微生物資源。從紅樹林底泥中分離的放線菌，可產(chǎn)生許多重要的次生代謝產(chǎn)物，目前研究主要集中于抗菌、抗腫瘤活性，在抗根結(jié)線蟲方面，國內(nèi)外研究不多。本研究從紅樹林這一特殊的生態(tài)系統(tǒng)中采集樣品，分離篩選具有殺線蟲活性的放線菌資源，并對活性菌株進(jìn)行分類鑒定，為開發(fā)新型殺蟲藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集于2010年4月從海南省東寨港紅樹林采集土壤樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干，備用。

1.1.2 培養(yǎng)基［4］放線菌分離培養(yǎng)基:高氏一號合成培養(yǎng)基、腐植酸-維生素培養(yǎng)基、1/10 ATCC培養(yǎng)基、酵母粉-淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基;形態(tài)特征鑒定培養(yǎng)基:高氏一號合成培養(yǎng)基、酵母粉-淀粉培養(yǎng)基、無機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基、甘油天門冬素培養(yǎng)基、燕麥汁培養(yǎng)基和土豆汁培養(yǎng)基;液體發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉1.0%、酵母粉0.1%、黃豆粉1.0%、淀粉0.5%、KH2PO40.05%(黃豆粉和玉米粉煮沸過濾，取汁)，pH 7.2。以上培養(yǎng)基均用陳海水配制。

1.2 方法

1.2.1 放線菌的分離取5 g樣品溶于45 mL無菌陳海水，28℃，180 r/min振蕩30 min制成土壤懸液。用無菌陳海水分別稀釋至10－2、10－3倍，涂布到放線菌分離培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，待長出菌落后，挑取培養(yǎng)基上的放線菌于高氏一號培養(yǎng)基上劃線分離，得到純培養(yǎng)。

1.2.2 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)挑取純化后的放線菌單菌落，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)7 d，10 000 r/min離心10 min，備用。

1.2.3 抗根結(jié)線蟲放線菌的篩選①供試線蟲:供試線蟲的培養(yǎng)參照雷敬超［5］的方法進(jìn)行。初篩時使用松材線蟲，采用鐮刀菌培養(yǎng);復(fù)篩時使用根結(jié)線蟲，是將含有大量卵塊的胡椒根沖洗干凈，挑取卵塊，28℃孵化所得;②初篩:采用24孔板液體篩選模型［6］。在24孔板中分別加入50 μL發(fā)酵液，550 μL無菌蒸餾水，約400 μL(約200條)松材線蟲混懸液，混合均勻，28℃放置24 h后用倒置顯微鏡觀察，僵直或卷曲不動的蟲體視為被擊倒，以發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，每處理重復(fù)3次，計(jì)算線蟲校正擊倒率。向24孔板中加入清水，觀察恢復(fù)情況，不能恢復(fù)活性的記為死亡，計(jì)算校正死亡率。校正擊倒率(%)=100×(處理擊倒率－對照擊倒率)/(1－對照擊倒率)，校正死亡率(%)=校正擊倒率×(1－恢復(fù)率);③復(fù)篩:采用根結(jié)線蟲，對初篩中校正死亡率50%以上的菌株按照②方法進(jìn)行復(fù)篩，同時對活性菌株發(fā)酵液進(jìn)行不同作用時間的抗線蟲活性測試;④菌株HA11090遺傳穩(wěn)定性測定:高效穩(wěn)定的殺蟲微生物是進(jìn)一步研究開發(fā)利用的前提和基礎(chǔ)［7］，本研究將菌株HA11090連續(xù)繼代培養(yǎng)5代，再按照②的方法測定每代菌株發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的校正死亡率。

1.2.4 活性菌株的分類鑒定①形態(tài)特征:采用平皿插片法［8］培養(yǎng)放線菌，顯微鏡下觀察活性菌株的菌絲及孢子特征;②培養(yǎng)特征:將菌株接種于放線菌形態(tài)特征鑒定培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1～2周，觀察菌株基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的形態(tài)特征，有無色素產(chǎn)生等;③生理生化特征:生理生化特征鑒定參照Lechevalier等［9］的方法進(jìn)行;④16S rDNA序列測定:采用苯酚氯仿法［10］提取放線菌的基因組DNA。以提取的放線菌DNA作為模板，用放線菌通用引物27f(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492r(GGTTACCTTGTTACGACTT)對菌株的16S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:94℃5 min;94℃1 min，55℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán)，72℃10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后送生工生物工程(上海)有限公司測序;⑤16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建［11］:將菌株的核苷酸序列提交至EzTaxon核苷酸序列庫進(jìn)行比對。利用ClustalX(Version1.8)和MEGA4.0軟件進(jìn)行多序列比對，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹林放線菌的分離與篩選結(jié)果

本研究從紅樹林土壤樣品中共分離206株形態(tài)特征各不相同的放線菌。初篩獲得28株線蟲校正死亡率在50%以上的菌株，占供試菌株的13.6%;復(fù)篩獲得3株線蟲校正死亡率在65.0%以上的菌株，其中菌株HA11090線蟲校正死亡率為70.5%。菌株HA11090發(fā)酵液處理不同時間的抗線蟲活性結(jié)果見圖1，可以看出，線蟲的校正擊倒率和校正死亡率隨著時間的延長而逐漸增大。對菌株HA11090連續(xù)進(jìn)行5次繼代培養(yǎng)，結(jié)果表明，其產(chǎn)生抗線蟲活性物質(zhì)的遺傳性保持穩(wěn)定。因此，將菌株HA11090作為進(jìn)一步研究的對象。

圖1 菌株HA11090發(fā)酵液對線蟲校正擊倒率及校正死亡率的時間變化曲線Fig.1 Time curve of revised knockdown rate and revised mortality of strain HA11090 fermentation broth

2.2 活性菌株HA11090的鑒定

圖2 菌株HA11090的孢子形態(tài)Fig.2 Scanning electron micrograph of strain HA11090 grown on Gauze’s No.1 agar

2.2.1 形態(tài)特征菌株HA11090在燕麥汁、酵母粉-淀粉、土豆汁、甘油天門冬素、高氏一號、無機(jī)鹽-淀粉等6種固體培養(yǎng)基上均生長良好，能形成豐富的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣絲白色，基絲白色至粉紅色，在6種培養(yǎng)基上均發(fā)現(xiàn)有黃色至棕褐色的可溶性色素產(chǎn)生。掃描電鏡下可看出菌株HA11090孢子絲直或彎曲，孢子卵圓形、表面光滑、有毛發(fā)(圖2)。

2.2.2 生理生化鑒定菌株HA11090能利用果糖、葡萄糖、甘露醇、棉子糖、蔗糖，產(chǎn)生H2S，淀粉水解，硝酸鹽還原，明膠不液化，牛奶既能凝固也能胨化，不產(chǎn)生黑色素，生長溫度范圍為15～45℃，具體情況參見表1。

表1 菌株HA11090的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain HA11090

2.2.3 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析經(jīng)測序獲得菌株HA11090的16S rDNA近全序列1 393 bp。經(jīng)過相似性比對分析，可發(fā)現(xiàn)與菌株HA11090同源性高的菌株都為糖多孢菌屬。同源性最高的為Saccharopolyspora hirsuta subsp.kobensis JCM 9109T(99.35%)，其次為Saccharopolyspora jiangxiensis W12T(99.27%)，根據(jù)序列同源性從高到低的順序選取7株模式菌株，利用ClustalX(Version1.8)和Mega4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖3可知，菌株HA11090與S.hirsuta subsp.kobensis和S.Jiangxiensisza在發(fā)育樹上處于同一個大的分支，親緣關(guān)系最近。

2.2.4 菌株HA11090的鑒定結(jié)果菌株HA11090與S.hirsuta subsp.kobensis［12］和S.jiangxiensis［13］的相似性最高，且發(fā)育樹上處于同一個分支。在形態(tài)和生理生化特征方面，菌株HA11090與S.jiangxiensis基本一致，差別僅在于:菌株HA11090不能利用D-木糖、L-肌醇、L-阿拉伯糖;S.hirsuta subsp.kobensis孢子表面粗糙，形成長的孢子鏈，不產(chǎn)生H2S，而菌株HA11090孢子卵圓形、表面光滑、有毛發(fā)，二者差異顯著。綜合分析，將菌株HA11090鑒定為S.jiangxiensis。

圖3 基于16S rDNA的菌株HA11090與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HA11090 and related strains based on 16S rDNA

3 討論

在篩選中，采用松材線蟲作為初篩線蟲，主要是考慮到松材線蟲的培養(yǎng)技術(shù)較為成熟，以鐮刀菌培養(yǎng)線蟲，線蟲4～5 d就可以繁殖一代，而且雌蟲可以連續(xù)29次產(chǎn)卵［14］，可以在較短時間內(nèi)獲得大量供試線蟲，滿足篩選工作對線蟲的大量需求。活性檢測時，將菌株發(fā)酵液稀釋20倍，是因?yàn)榫闔A11090分離自紅樹林區(qū)域，發(fā)酵時培養(yǎng)基用海水配制。為避免高濃度無機(jī)鹽對線蟲的傷害，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基在稀釋20倍后可消除對線蟲的影響。

16S rDNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和表型特征存在較好的相關(guān)性［15］，通過16S rDNA序列同源性分析與生理生化試驗(yàn)相結(jié)合是一種比較快速準(zhǔn)確的方法［16］，越來越廣泛地應(yīng)用于細(xì)菌分類。本研究結(jié)合該方法，將菌株HA11090鑒定為S.jiangxiensis。菌株HA11090發(fā)酵液稀釋20倍和40倍后，線蟲校正死亡率分別為70.5%和65.0%，線蟲的校正擊倒率和校正死亡率隨著時間的延長而逐漸增大，且菌株HA11090抗根結(jié)線蟲活性穩(wěn)定。目前對于該菌株，文獻(xiàn)上只有一些分類鑒定上的報(bào)道，而具有抗根結(jié)線蟲活性，本文尚屬首次報(bào)道。

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