沈雁飛，單穎，柳明杰

(遼寧醫(yī)學(xué)院免疫病原生物學(xué)教研室，遼寧錦州121001)

膽固醇在體內(nèi)有著重要的生理作用，但當其過量時會導(dǎo)致高膽固醇血癥，并誘發(fā)動脈粥樣硬化、冠心病、腦中風等心腦血管疾病［1］。隨著國人生活水平的提高、肉類飲食的增加，現(xiàn)代城市人群膽固醇的攝入量普遍超標［2］。在不改變飲食習慣的情況下，降低人體內(nèi)膽固醇含量已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界和食品界關(guān)注的重要課題。臨床實驗證明多種乳酸菌制品具有降低血清膽固醇含量的功效，從而降低心腦血管發(fā)病率［3-6］。利用乳酸菌及其發(fā)酵食品清除體內(nèi)多余的膽固醇，具有安全、價廉、多重保健等優(yōu)勢。利用誘變育種技術(shù)可以獲得更加高效、特效乳酸菌［2，5］。本研究利用亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)誘變嗜酸乳桿菌，而后篩選出膽固醇清除性能良好的菌株，并利用大白鼠進行試驗，為今后生產(chǎn)高效安全的降血清膽固醇乳酸制劑提供優(yōu)良的候選菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、試劑及實驗動物嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，遼寧醫(yī)學(xué)院微生物實驗室保藏;亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)、膽固醇和牛膽汁酸鹽，美國Sigma公司;總膽固醇(TC)及高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)測定試劑盒，上海榮盛公司;甘油三酯(TG)測定試劑盒，浙江東頤公司;分光光度計，上海第三儀器廠;SD大鼠購自于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(SCXK(遼)2003-0009)。

1.1.2 主要培養(yǎng)基①MRS瓊脂培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基添加1%(質(zhì)量體積比)瓊脂，121℃滅菌20 min后，冷卻制成MRS瓊脂培養(yǎng)基;②膽固醇MRS培養(yǎng)基:MRS液體培養(yǎng)基中添加膽固醇至0.3 g/L，121℃滅菌20 min后，添加等體積無菌血清制成含膽固醇培養(yǎng)基;③脫脂乳培養(yǎng)基(質(zhì)量體積分數(shù)，%):脫脂奶粉10，綿白糖5，混勻后95℃保溫殺菌20 min，待冷卻至40℃左右待用;④高脂飼料配方(質(zhì)量分數(shù)，%):豬油10，膽固醇0.3，基礎(chǔ)飼料89.7。

1.2 方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌生長曲線測定嗜酸乳桿菌接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接3次充分活化。將活化嗜酸乳桿菌按3%(體積比)接種量接種到裝有0.2 L MRS培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃靜置培養(yǎng)，每隔2 h取均勻懸浮液20 mL，測定OD600值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.2 嗜酸乳桿菌的誘變方法按嗜酸乳桿菌生長曲線，取對數(shù)期嗜酸乳桿菌，充分懸浮后轉(zhuǎn)移到50 mL試管中，加入誘變劑NTG，使其作用濃度為1 g/L，將試管在25℃放置10、20、30、40、50、60 min，離心后利用MRS沖洗3次，逐級稀釋，取50 μL均勻地鋪到MRS瓊脂培養(yǎng)基上，放置到密閉無氧箱中，培養(yǎng)24～48 h。根據(jù)對照，菌落計數(shù)，確定誘變后10%存活率的條件。以確定的條件進行大量突變實驗，挑選在瓊脂培養(yǎng)基上生長較快，個體較大的黃色誘變菌落，分別進行接種傳代，挑選60個穩(wěn)定的菌株，以Y1～Y60進行命名。

1.2.3 耐滲透壓能力的測定在MRS固體培養(yǎng)基中加人NaCl，使其濃度分別為2%、4%、6%、8%(質(zhì)量體積比)。將誘變菌種劃線接種于含不同濃度NaCl的MRS固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，觀察嗜酸乳桿菌的生長狀況。

1.2.4 耐膽酸鹽能力的測定在MRS培養(yǎng)基內(nèi)加入牛膽酸鹽，使其濃度分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%(質(zhì)量體積比)，菌種按10%(體積比)量接種于0.1 L含牛膽汁酸鹽的MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，定時取樣，以0 h活菌數(shù)量為對照，記錄嗜酸乳桿菌存活率。

1.2.5 降膽固醇嗜酸乳桿菌的體外篩選按5%(體積比)接種量接種嗜酸乳桿菌于液體MRS膽固醇培養(yǎng)基中，搖勻后立即取2 mL樣品，12 000 r/min離心5 min，取上清測定膽固醇含量做對照。剩余接種樣品繼續(xù)在37℃靜止培養(yǎng)48 h后同樣測定上清膽固醇含量。膽固醇含量測定方法如下:液體培養(yǎng)基精確稱取膽固醇溶于無水乙醇中做成1 g/L的標準液，并進一步利用無水乙醇配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L的梯度溶液用于繪制膽固醇標準曲線。待測樣品0.5 mL與3 mL無水乙醇和2 mL 50%KOH(質(zhì)量體積比)震蕩混合，在60℃水域加熱10 min，待冷卻后加入0.005 L正己烷并混合均勻。此后加入3 mL蒸餾水，靜置20 min分層，抽取正己烷層2 mL，加入2 mL鄰苯二甲醛，25℃放置10 min后再加入1 mL濃硫酸并混合均勻。最后抽取2 mL測定OD550值計算樣品膽固醇質(zhì)量濃度。

1.2.6 實驗動物分組并構(gòu)建高脂模型雄性SD大鼠60只，體重180～220 g之間，普通飼料正常飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組，每組12只:A對照組，飼喂普通飼料;B高脂組，飼喂高脂飼料;C脂奶組，高脂飼料中添加與D組等量的脫脂奶粉及白糖;D酸奶組，在高脂飼料中按1 L/kg飼料添加酸奶。以上飼料均制成顆粒。大鼠自由飲水進食，每隔2 d換新鮮飼料。酸奶是利用接種5%(體積比)的嗜酸乳桿菌到脫脂乳培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24～48 h至形成凝乳。

1.2.7 實驗大鼠血脂測定按1.2.6飼料要求喂養(yǎng)大鼠。在0 d和27 d收集糞便。于0 d和28 d的采血前12 h禁食，稱重。血脂測量采用尾靜脈取血0.001 L，4℃放置過夜，12 000 r/min低溫離心10 min，分離血清測定血脂。收集的糞便冷凍干燥后于研缽中磨細混勻，干燥器中保存待測。

1.2.8 TC、TG、HDL-C的檢測方法取實驗動物血清適量，分別依試劑盒的操作要求采用比色法測定TC、TG和HDL-C。用分光光度計測定TC、TG、HDL-C最終含量。大鼠糞便中的TC:取大鼠糞便粉末0.19 g，用甲醇氯仿混合液45℃水浴提取1 h，鄰苯二甲醛比色法測定糞便中TC含量。

1.2.9 統(tǒng)計分析采用SPSS11.5進行數(shù)據(jù)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳誘變時間測定

研究表明致死率在80%～90%時導(dǎo)致的突變?yōu)檎蛲蛔儯?，5］。本研究中嗜酸乳桿菌的誘變最佳條件為NTG 1 g/L、30 min，達到90.31%的致死率。

2.2 耐滲透壓能力的測定

滲透壓對嗜酸乳桿菌的生長具有一定的影響，嗜酸乳桿菌耐滲透壓能力是鑒別菌種優(yōu)劣的標準之一［7］。本研究通過耐滲透壓能力的測定顯示，絕大部分突變菌株保留了原菌株較好的耐滲透壓特性。除Y11、Y23、Y25、Y37、Y38、Y44、Y56耐滲透力較差，在NaCl為6%的濃度下就抑制生長外，其余突變菌株均可拮抗6%濃度NaCl生長。具有良好的耐滲透壓特性提示突變菌株具有良好的適應(yīng)性，在發(fā)酵成乳酸制品、混合飼料及食用乳酸制品過程中可保持理想的生物學(xué)活性。

2.3 耐膽酸鹽能力的測定

膽鹽是膽汁的重要成分，在人體中以膽酸鈉鹽為主要存在方式。膽鹽對嗜酸乳桿菌生長具有一定的抑制作用。嗜酸乳桿菌在進入十二指腸后暴露在膽鹽中，如果不具備抗膽鹽能力，就會喪失其生物學(xué)活力，從而降低其降膽固醇的功能，所以優(yōu)良的嗜酸乳桿菌需要具備良好的抗膽鹽能力［7］。本研究中耐膽酸鹽能力的測定表明，在挑選的60株突變菌株中，除去耐滲透壓能力較差的以上7株嗜酸乳桿菌株外的53株突變株中，有8株嗜酸乳桿菌突變株，包括Y13、Y17、Y26、Y27、Y33、Y39、Y48、Y50，具有較好的耐膽鹽能力。由圖1可知，突變菌株Y27和Y48嗜酸乳桿菌在膽鹽0.5%濃度條件下1 h存活率均超過50%，Y48在0.5%濃度條件下1 h存活率達到64.87%，2 h存活率達到33.17%。Y27和Y48在1%濃度2 h存活率均分別達到15.86%和21.24%。從圖示可以了解Y27和Y48突變菌株與原菌株的耐膽鹽能力相似，具有良好的抗膽鹽能力，為在高膽鹽的消化道環(huán)境中發(fā)揮正常生理功能奠定基礎(chǔ)。

圖1 乳酸桿菌在膽鹽中的存活率分析Fig.1 Survival rate of Lactobacillus acidophilus in MRS contained bile salts

2.4 誘變嗜酸乳桿菌清除膽固醇能力測定

在進行耐滲透壓、抗膽鹽實驗以后，利用獲得的8株突變菌進行體外降膽固醇實驗。嗜酸乳桿菌對降膽固醇篩選培養(yǎng)基中膽固醇的脫除率見圖2。在含有膽固醇的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，Y27和Y48體現(xiàn)出良好的清除膽固醇能力，膽固醇清除率分別達到了(53.43±2.3)%和(61.44±1.8)%。比較原嗜酸乳桿菌，Y27和Y48膽固醇清除率分別提高了61.32%和85.51%。

圖2 乳酸桿菌膽固醇清除率分析Fig.2 Clearance rate of cholesterol by Lactobacillus acidophilus

2.5 生長曲線的測定

對原嗜酸乳桿菌的生長曲線測定可以用于確定良好的突變時機，對于已經(jīng)完成突變的嗜酸乳桿菌進行生長曲線的測定可以更好地了解突變菌的生長特征。如圖3所示，原嗜酸乳桿菌和Y27及Y48的生長曲線相似，突變的嗜酸乳桿菌Y27和Y48與原嗜酸乳桿菌均在培養(yǎng)16～18 h進入平臺期。經(jīng)過18 h培養(yǎng)，原菌株、Y27和Y48的細菌計數(shù)分別為1.79×1012、1.81×1012和1.92×1012cfu/L。以上結(jié)果均提示突變的菌株Y27和Y48除具有良好的耐滲透壓、抗膽鹽能力外，并沒有喪失良好的生長能力。

2.6 發(fā)酵乳對大鼠TC、TG、HDL-C的影響

為進一步驗證突變嗜酸乳桿菌的降膽固醇能力，本研究選取體外篩選得到的體外降膽固醇能力最高的乳酸突變菌Y48發(fā)酵酸奶，并按照1.2.6分組進行動物實驗。28 d后，各實驗組大鼠血脂水平見表1。高脂組血清TC含量顯著高于對照組(P＜0.05)，說明高脂模型已成功建立。酸奶組的血清TC和TG含量比高脂組顯著降低(P＜0.05)。而奶脂組與高脂組相比有所升高但差異不大，說明未發(fā)酵奶本身并沒有降膽固醇作用。與高脂組相比，酸奶組大鼠的HDL-C并沒有顯著的差異(P＞0.05)，間接說明酸奶組的低密度膽固醇要低于高脂組。實驗大鼠的體重變化觀察表明，酸奶組的體重明顯低于高脂組和奶脂組(P＜0.05)。

圖3 各乳酸桿菌的生長曲線分析Fig.3 Growth curve of Lactobacillus acidophilus

如圖4所示，實驗大鼠奶脂組、高脂組和酸奶組糞便內(nèi)膽固醇含量均高于對照組。其中酸奶組大鼠糞便中的膽固醇含量最高，比對照組高350.31%，比高脂組高116.67%，比奶脂組高110.42%，說明突變菌株Y48的發(fā)酵乳可以清除更多的腸道中的TC，從而減少TC在腸道中的吸收。

圖4 乳酸桿菌發(fā)酵奶對大鼠糞便中TC含量影響的分析Fig.4 Concentration of TC in feces after feeding with yogurt

3 討論

本研究旨在利用NTG誘變嗜酸乳桿菌獲得降膽固醇的優(yōu)良菌株。利用NTG作用濃度為1 g/L，作用時間為30 min的條件進行誘變后，從挑選的生長良好的60個突變菌株中篩選出Y48突變菌株。Y48突變菌株與原菌株保持相似的生長速度，在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后菌濃度達到了1.92×1012cfu/L。Y48菌株具有良好的耐滲透壓能力，在6%的NaCl瓊脂MRS培養(yǎng)基上生長良好。此菌株也具有良好的抗膽鹽能力，在0.5%膽酸MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h的存活率可達到64.87%。Y48菌株在含膽固醇MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，降膽固醇(61.44±1.8)%。利用高脂肪飼料喂養(yǎng)SD大鼠，并在飼料中添加Y48發(fā)酵乳，28 d后Y48發(fā)酵乳組血清TG、TC比高脂肪模型組明顯降低(P＜0.05)。糞便中的TC明顯升高。以上實驗成功獲得了優(yōu)質(zhì)的降膽固醇乳酸桿菌Y48，為生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)降膽固醇發(fā)酵乳制品提供了優(yōu)良的候選菌種。

表1 乳酸桿菌對大鼠血清中膽固醇影響分析Table 1 Influence of yogurt on serum lipids and body weigh of SD rats

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