徐凡，張臣臣，潘麗娜，康文麗，汪家琦，李威，黃玉軍＊

（1.揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室，江蘇揚州 225127）（2.澳優(yōu)乳業(yè)(中國)有限公司，人體微生態(tài)制品湖南省工程研究中心，湖南長沙 410017）

乳酸菌是利用糖類發(fā)酵且主要產(chǎn)物為乳酸的一類革蘭氏陽性、無芽孢、厭氧生長的細菌總稱，人類一直食用利用乳酸菌發(fā)酵的食品，而關(guān)于乳酸菌的研究大大促進了發(fā)酵乳制品行業(yè)的發(fā)展。乳酸菌是人體常駐菌種，能夠調(diào)整腸道菌群、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防和治療胃腸道疾病和呼吸道疾病[1-3]。Li 等[4]發(fā)現(xiàn)一株分離自人乳的鼠李糖乳桿菌SHA113 具有治療多耐藥大腸桿菌感染和調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的潛力。Shin 等[5]從嬰兒糞便中分離出一株干酪乳桿菌IDCC 3451，并對其基因組特性和安全性進行相關(guān)表征，發(fā)現(xiàn)其作為一種安全的益生菌菌株可用于食品。

微生物在經(jīng)過連續(xù)傳代后容易發(fā)生退化，遺傳穩(wěn)定性也會發(fā)生改變，引起生理生化方面的改變，從而使菌株的質(zhì)量發(fā)生變化，不能保證。乳桿菌作為連續(xù)使用的產(chǎn)業(yè)化菌種應(yīng)該具有優(yōu)秀的益生功能同時具有良好的遺傳穩(wěn)定性，保證菌株在連續(xù)生產(chǎn)過程中保持初始的優(yōu)良品質(zhì)，所以對乳桿菌的穩(wěn)定性研究是有必要[6]。乳酸菌要發(fā)揮益生作用，必須能夠在人體胃腸道中胃酸和膽汁等不良環(huán)境中保證存活[7-10]，正常人體的小腸膽鹽含量在0.03%～0.3%之間[11]，菌株進入小腸后能夠耐受一定的膽鹽濃度是能否成功定植和代謝活動的前提[12]。

植物乳桿菌屬于乳桿菌屬，厭氧或兼性厭氧，該菌與其他乳酸菌的不同之處在于植物乳桿菌的活菌數(shù)比較高，能大量產(chǎn)酸，而且產(chǎn)出的酸性物質(zhì)能夠降解重金屬[13]。研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ATCC202195 聯(lián)合低聚果糖可預(yù)防嬰兒敗血癥[14]。戊型乳桿菌素多具耐熱性高、分子質(zhì)量小、在酸性或弱堿性條件下穩(wěn)定的特點[15]，具有廣泛的抑菌譜并且對一些食品致病菌具有較強的抑制作用[16]，對于食品和制藥工業(yè)都具有重要意義。

植物乳桿菌M547、M621、M748、戊型乳桿菌M750 是揚州大學(xué)品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室篩選來自于母乳和嬰兒糞便的4 株乳桿菌。嬰兒腸道內(nèi)的菌群與母體的菌群具有垂直聯(lián)系，相比其他來源的益生菌，母嬰來源的益生菌更加安全，且具有更好的益生功能[17,18]。目前市面上常見的低溫乳制品的保質(zhì)期通常在15～30 d 左右。本文以膽鹽耐受能力為核心，研究膽鹽添加對其30 代遺傳穩(wěn)定性的影響，為新型菌株的開發(fā)提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌M547（Lactiplantibacillus plantarunM547）、植物乳桿菌M621（Lactiplantibacillus plantarunM621）、植物乳桿菌M748（Lactiplantibacillus plantarunM748）、戊型乳桿菌M750（Lactiplantibacillus pentosus M750），由江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室分離自湖南地區(qū)健康女性的母乳。

胃蛋白酶（1:10 000），生工生物工程（上海）股份有限公司；牛膽鹽，北京索萊寶科技有限公司；MRS 肉湯，海博生物技術(shù)有限公司。

人工胃液：0.5%（質(zhì)量分數(shù)）NaCl，0.3%（質(zhì)量分數(shù)）胃蛋白酶（1:10 000），用1 mol/L 的HCl溶液調(diào)節(jié)pH 值至2.5。

MRS 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，牛肉浸粉8，酵母浸粉4，葡萄糖20，磷酸氫二甲2，檸檬酸氫二銨2，乙酸鈉5，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.01，吐溫-80。

0.02%膽鹽MRS：MRS 培養(yǎng)基添加0.02%（質(zhì)量分數(shù)）膽鹽；0.04%膽鹽MRS：MRS 培養(yǎng)基添加0.04%（質(zhì)量分數(shù)）膽鹽；0.06%膽鹽MRS：MRS培養(yǎng)基添加0.06%（質(zhì)量分數(shù)）膽鹽。

1.2 儀器設(shè)備

BXP-16 恒溫培養(yǎng)箱，上海力辰邦儀器科技有限該公司；SW-CJ-1FD 型超凈臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；FP-110-C 型全自動生長曲線分析儀，芬蘭Bioscreen 公司；JF-SX-500 全自動滅菌鍋，日本TOMY 公司；FE20 pH 計，梅特勒-托利多儀器有限公司；SPX-150BSH 型生化箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的活化、純化和培養(yǎng)

將M547、M621、M748、M750 的第一代菌株活化后在MRS 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)48 h 后挑取單菌落，并接種于MRS 液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2 菌株的傳代

將0 代菌株按體積分數(shù)為3%接種量進行長期連續(xù)傳代培養(yǎng)至30 代，每代的傳代周期為24 h。

1.3.3 耐膽鹽能力傳代穩(wěn)定性的測定

離心收集菌體，用滅菌的PBS 緩沖液將菌體洗滌2 次后懸浮，取1.0 mL 的菌懸液接種至9.0 mL的0.1%膽鹽的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別在0 h 和3 h 用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，存活率公式如公式（1）所示。每組重復(fù)3 次。每5 代進行一次測定。

式中：

α——耐膽鹽能力（存活率），%；

N0——0 h 時的活菌數(shù)，CFU；

N1——膽鹽中培養(yǎng)3 h 后的活菌數(shù)，CFU。

1.3.4 生長曲線繪制

將菌株按3%的接種量分別接種到MRS 培養(yǎng)基、0.02%膽鹽培養(yǎng)基、0.04%膽鹽培養(yǎng)基、0.06%膽鹽培養(yǎng)基中，并采用微生物自動生長曲線分析儀測定24 h 生長情況。

1.3.5 菌株膽鹽培養(yǎng)的耐膽鹽能力測定

離心收集菌體，用滅菌的PBS 緩沖液將菌體洗滌2 次后懸浮，取1.0 mL 的菌懸液接種至9.0 mL接種至0.1%膽鹽的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別在0 h 和3 h 用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，存活率公式如公式（1）所示。每組重復(fù)3 次。每5 代進行一次測定。

1.3.6 培養(yǎng)液pH 值傳代穩(wěn)定性的測定

在菌株培養(yǎng)到5、10、15、20、25、30 代時，使用pH 計測定24 h 培養(yǎng)液的pH 值。

1.3.7 耐酸能力傳代穩(wěn)定性的測定

離心收集菌體，用滅菌的PBS 緩沖液將菌體洗滌2 次后懸浮，取1.0 mL 的菌懸液接種至9.0 mL的pH 值2.5 人工胃液中，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別在0 和3 h 利用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，存活率計算公式如公式所示。每組重復(fù)3 次。每5 代進行一次測定。

式中：

β——耐酸能力（存活率），%；

N0——0 時的活菌數(shù)，CFU；

N2——人工胃液中培養(yǎng)3 h 后的活菌數(shù)。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

試驗所得數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)試驗結(jié)果的平均值并利用SPSS 進行顯著性分析，利用Origin 進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的耐膽鹽傳代穩(wěn)定性

由圖1 可知，菌株M547、M621、M748、M750在0.1 wt.%膽鹽下的耐膽鹽穩(wěn)定性存在差異，總體呈下降趨勢。其中M748 和M750 的下降更為明顯。膽鹽對菌株的細胞具有毒害作用，作用于細胞膜和DNA，影響細胞的正常代謝和遺傳。菌株的耐膽鹽機制主要分為膽鹽水解酶的作用、應(yīng)激蛋白作用和細胞膜的作用[19]。母嬰源乳酸菌具有對高濃度膽鹽耐受能力差的特點，高濃度的膽鹽改變了細胞膜的通透性，分解膜蛋白，導(dǎo)致細胞破裂和死亡，抑制菌株的正常生長[20]。在膽鹽中時，菌株產(chǎn)生的膽鹽水解酶不能夠完全消除膽鹽的毒性，而膽鹽水解酶在pH 值6.0 時的解毒能力最強，菌株本身產(chǎn)酸也會降低膽鹽水解酶的效率，菌株的耐酸和耐膽鹽能力時一種交叉的作用機制。畢潔[21]研究膽鹽水解酶提高乳酸菌膽鹽耐受能力的生理機制發(fā)現(xiàn)菌株在受到膽鹽脅迫，菌株細胞的胞質(zhì)變得的稀疏，而添加膽鹽水解酶的菌株細胞質(zhì)不會下降，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)類似囊泡的微粒組分附著在細胞膜上，形成一層不規(guī)則的生物膜，提高了菌株的耐膽鹽能力。4 株菌株的膽鹽耐受穩(wěn)定性差可能由菌株的轉(zhuǎn)錄變化差異引起。烏日娜[22]利用膽鹽脅迫培養(yǎng)L.caseiZhang，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)組的發(fā)生變化，最終導(dǎo)致菌株功能的變化。由此推斷在傳代過程中維持膽鹽刺激，是提高其膽鹽耐受傳代穩(wěn)定性的一種可行方案。

圖1 M547、M621、M748、M750在0.1%膽鹽中存活率的變化Fig.1 Change in survival rate of M547,M621,M748,M750 in 0.1% bile salt

2.2 膽鹽濃度對菌株生長能力的影響

。

由圖2 可知，添加0.02%膽鹽培養(yǎng)對菌株的生長影響不明顯，添加0.04%膽鹽培養(yǎng)對菌株生長產(chǎn)生了一定的抑制作用，菌株生長緩慢但能接近正常水平，0.06%膽鹽濃度培養(yǎng)的菌株幾乎停止生長。菌株進入胃腸道后，定植發(fā)揮益生功能必須保證到達腸道時活菌數(shù)達到106CFU/g 以上，要保證菌株的正常生長，同時過低的濃度無法體現(xiàn)膽鹽培養(yǎng)的作用，所以選擇0.04%膽鹽濃度作為最終的培養(yǎng)濃度。

圖2 菌株M547、M621、M748、M750在不同膽鹽濃度下的生長能力Fig.2 Growth capacity of strains M547,M621,M748 and M750 at different bile salt concentrations

2.3 傳代過程中菌株耐膽鹽能力的穩(wěn)定性

由表1 和表2 可知，經(jīng)過獨立樣本t檢驗，膽鹽培養(yǎng)的菌株的在0.075%和0.1%膽鹽的耐受能力的影響上存在顯著性差異。由圖3 和表3 可知，植物乳桿菌M547、植物乳桿菌M621、植物乳桿菌M748、戊糖乳桿菌M750 在0.075 %膽鹽的耐受能力隨著傳代過程變化較小。由圖4 和表4 可知，4 株菌株對0.075%膽鹽耐受能力較強，菌株對于0.1%膽鹽耐受能力本身較差，但在添加0.04%膽鹽的MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株耐膽鹽能力有明顯提高，M547 的0.1%膽鹽耐受能力為50.99%～75.52%變?yōu)?3.42%～88.55%，M621 的0.1%膽鹽耐受能力為49.67%～66.34% 變?yōu)?0.94%～83.36%，M748 的0.1% 膽鹽耐受能力為28.73%～67.69%變?yōu)?3.29%～86.31%，M750 的0.1%膽鹽耐受能力為21.36%～55.34%變?yōu)?9.50%～67.05%。菌株對0.1%膽鹽的耐受能力隨著傳代過程變化，整體呈現(xiàn)下降趨勢。盧曉[23]通過添加乳化劑的方法提高KPGG 菌粉的耐膽鹽能力，可以提高4 h 后1.98個活菌數(shù)對數(shù)值。植物乳桿菌M547、植物乳桿菌M621、植物乳桿菌M748、戊糖乳桿菌M750 對0.1%膽鹽濃度的耐受能力穩(wěn)定性差，在添加0.04%膽鹽的MRS 液體培養(yǎng)基中的菌株耐膽鹽能力有明顯提高，菌株傳代過程中的耐膽鹽能力隨著傳代過程變化，整體呈下降趨勢，但下降幅度明顯減小，菌株的耐膽鹽能力更穩(wěn)定。一方面在添加膽鹽的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液的pH 相應(yīng)的提高，有利于膽鹽水解酶發(fā)揮更強的解毒作用，另一方面長期在0.04%膽鹽培養(yǎng)基中生長，刺激了細胞分泌更多的膽鹽水解酶，保證菌株正常的生長代謝，也有可能刺激了應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生，原本沒有表達的蛋白質(zhì)得到了表達，而0.04%膽鹽培養(yǎng)的菌株的生長曲線最終接近正常MRS 可間接的證明這一點。

表1 膽鹽培養(yǎng)后的0.075%膽鹽耐受能力的獨立樣本t檢驗Table 1 Independent sample t-test for 0.075% bile salt tolerance after bile salt culture

表2 膽鹽培養(yǎng)后的0.1%膽鹽耐受能力的獨立樣本t檢驗Table 2 Independent sample t-test for 0.1% bile salt tolerance after bile salt culture

表3 菌株在膽鹽培養(yǎng)后0.075%膽鹽耐受存活提高率Table 3 The survival rate of strains tolerated by 0.075% bile salt after bile salt culture increased

表4 菌株在膽鹽培養(yǎng)后0.1%膽鹽耐受存活提高率Table 4 The survival rate of strains tolerated by 0.1% bile salt after bile salt culture increased

圖3 菌株在MRS與0.04%膽鹽培養(yǎng)基中傳代后在0.075%膽鹽存活率變化Fig.3 Variation of 0.075% bile salt survival rate after passage of strain in MRS and 0.04% bile salt medium

圖4 菌株在MRS培養(yǎng)基中與0.04%膽鹽培養(yǎng)基中傳代后在0.1%膽鹽存活率變化Fig.4 Variation in survival rate of 0.1% bile salt after passage between MRS medium and 0.04% bile salt medium

2.4 傳代過程中菌株產(chǎn)酸能力的穩(wěn)定性

由表5 可知，經(jīng)過獨立樣本t檢驗，膽鹽培養(yǎng)對菌株的產(chǎn)酸能力的影響不存在顯著性差異。由圖5可知，菌株M547、M621、M748、M750 培養(yǎng)液的pH 值在傳代過程中的沒有明顯變化趨勢，穩(wěn)定性好，說明M547、M621、M748、M750 經(jīng)過多次傳代后仍可以保持篩選之初的產(chǎn)酸能力。添加膽鹽刺激培養(yǎng)對M547、M621、M748、M750 的pH 值沒有明顯的影響，產(chǎn)酸能力穩(wěn)定性幾乎沒有變化，菌株培養(yǎng)液的pH 值仍在3.60～4.0 之間。菌株的產(chǎn)酸能力是菌株的活力的重要指標(biāo)，結(jié)果表明膽鹽培養(yǎng)的菌株的活性沒有明顯變化。產(chǎn)酸能力是反應(yīng)菌群整體活力的一個重要指標(biāo)，同時也是乳酸菌發(fā)酵能力的表現(xiàn)，兩種培養(yǎng)方法培養(yǎng)的菌株的產(chǎn)酸能力變化曲線類似，說明添加膽鹽培養(yǎng)后菌株的發(fā)酵正常使用不產(chǎn)生影響。楊行等[24]在研究新疆酸奶中的乳酸菌發(fā)現(xiàn)乳桿菌的產(chǎn)酸能力較強，pH 值一般在4.00 以下。

表5 膽鹽培養(yǎng)后產(chǎn)酸能力的獨立樣本t檢驗Table 5 Independent sample t-test for acid production capacity after bile salt culture

圖5 菌株在MRS培養(yǎng)基中與0.04%膽鹽培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液的pH值Fig.5 pH value of culture medium in MRS medium versus 0.04% bile salt medium

2.5 傳代過程中菌株耐酸能力的穩(wěn)定性

由表6 可知，經(jīng)過獨立樣本t檢驗，膽鹽培養(yǎng)對菌株的耐酸能力的影響不存在顯著性差異。由圖6 可知，耐酸能力同樣是菌株耐受人體環(huán)境的重要指標(biāo)。由圖6 可以看出，M547、M621、M748、M750 在傳代過程中的耐酸能力無明顯變化，沒有明顯的簡單遞增或簡單遞減趨勢，呈波動趨勢，波動幅度較小。植物乳桿菌M547、植物乳桿菌M621、植物乳桿菌M748、戊糖乳桿菌M750 的耐酸能力具有一定的穩(wěn)定性，植物乳桿菌的耐酸能力普遍較強。添加0.04%膽鹽培養(yǎng)的菌株的在傳代過程中的耐酸能力沒有明顯規(guī)律，但膽鹽刺激培養(yǎng)后的菌株耐酸能力變化范圍減小，M547 的最大值和最小值差距從21%變?yōu)?0%左右，M621 的最大值和最小值差距從15%變?yōu)?2%左右，M748 的最大值和最小值差距從22%變化11%左右。乳桿菌的耐酸機制與內(nèi)外pH 穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)修復(fù)、細胞膜的改變等有關(guān)[25]。由于膽鹽的添加的導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境的pH 改變，而質(zhì)子動力酶、產(chǎn)堿酶的活力隨著pH 的改變而改變，促進在最終的傳代中，菌株對環(huán)境的突然的改變表現(xiàn)不適應(yīng)性，但隨著長期的傳代過程逐漸適應(yīng)，且菌株產(chǎn)酸的影響下，最終達到菌株細胞內(nèi)外pH 的動態(tài)平衡，表現(xiàn)為最終0.04%膽鹽培養(yǎng)和MRS 培養(yǎng)的菌株有相似的耐酸能力。由圖4 和圖6，耐酸能力和耐膽鹽能力變化的曲線可以在一定程度上猜測，菌株受影響的代謝途徑對于耐酸和耐膽鹽存在交互的可能性很小。

表6 膽鹽培養(yǎng)后耐酸能力的獨立樣本t檢驗Table 6 Independent sample t-test for acid tolerance after bile salt culture

圖6 菌株在MRS與0.04%膽鹽培養(yǎng)基中傳代后pH值2.5的存活率Fig.6 Survival rate of pH value 2.5 after passage of MRS and 0.04% bile salt medium

3 結(jié)論

本研究通過對不同膽鹽質(zhì)量分數(shù)對菌株M547、M621、M748 和M750 生長規(guī)律的影響確定了選用0.04%膽鹽作為培養(yǎng)濃度，改變菌株的培養(yǎng)環(huán)境。0.04%膽鹽培養(yǎng)對菌株的產(chǎn)酸能力和耐酸能力有一定的影響，但作用效果不明顯，而對菌株膽鹽的耐受能力有明顯的提高作用，在傳代過程中，菌株對0.075%膽鹽的耐受能力提高了11%～18%左右，對0.1%膽鹽的耐受能力提高了20%～34%左右。菌株在傳代過程中，對0.1%膽鹽的耐受能力逐漸降低，而膽鹽培養(yǎng)可以改變這種現(xiàn)象，說明在連續(xù)傳代過程中菌株的轉(zhuǎn)錄情況發(fā)生了變化，而膽鹽培養(yǎng)可以作為回調(diào)部分轉(zhuǎn)錄組的一種方法，部分耐膽鹽相關(guān)的表達發(fā)生改變，膽鹽培養(yǎng)可以作為菌株膽鹽耐受能力提高的手段。本研究為乳桿菌耐受能力機理的研究提供了新方向，也探討了一種提高菌株遺傳穩(wěn)定性的方法，通過改善外部環(huán)境改變菌株的生長情況，這種方法相對操作簡單，但膽鹽培養(yǎng)對菌株的影響轉(zhuǎn)錄機制需要進一步的研究。