任全路

(乳業(yè)生物技術國家重點實驗室,上海乳業(yè)生物工程技術研究中心,光明乳業(yè)股份有限公司,上海,200436)

改革開放以來,中國人民的生活水平快速提高,其體現(xiàn)在飲食上也變得豐富多彩,選擇多樣[1]。但是隨之而來的還有肥胖癥的高發(fā),也會誘導其他相關疾病發(fā)生,如:高血壓,高血脂等肥胖類疾病[2]。肥胖癥不只在國內,在全世界都是一個嚴峻的問題,威脅著大眾的身心健康[3-4]。相應的藥物治療可能帶來代謝紊亂等不可控因素,而隨著食療的發(fā)展,研究者發(fā)現(xiàn)乳酸菌對肥胖具有很好的預防和治療效果[5-7]。

近年的研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌對肥胖的治療效果可能歸因于膽鹽水解酶的活性,膽鹽水解酶可以水解膽鹽,釋放氨基酸和游離膽鹽,存在于人體內的腸道微生物中,可以調節(jié)人體的膽汁酸代謝[8-10]。ZHU等[11]將威爾遜乳桿菌的膽鹽水解酶基因(bsh)在敲除bsh基因的植物乳桿菌WCFS1中異源表達后,通過調節(jié)膽汁酸池,改善了小鼠的高膽固醇血癥,LIANG等[12]篩選高膽鹽水解酶活性的植物乳桿菌H-87通過調節(jié)膽汁酸代謝,抑制脂肪的積累,對小鼠高脂飲食誘導的肥胖具有良好的預防效果。

目前已知膽鹽水解酶存在于多個種屬中,包括乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌等,不同來源的膽鹽水解酶的酶活性和底物選擇性都是顯著不同的,不同的菌株在膽鹽水解酶在種類和數(shù)量上也是不同的[13-14]。同樣來自于唾液乳桿菌的BSH1和BSH2就具有不同的酶活性和底物特異性[15],WANG等[16]的研究發(fā)現(xiàn)在植物乳桿菌的四個膽鹽水解酶基因中BSH1對菌株的膽鹽水解酶活性起關鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)實驗室保藏的Ligilactobacillussp.BD7642具有很強的膽鹽水解酶活性,尚不明晰該菌株的膽鹽水解酶的酶活性特癥。本研究的目的是對Ligilactobacillussp.BD7642膽鹽水解酶活性進行特異性分析,研究其對6種膽鹽的特異性降解的情況,并對參與其中的膽鹽水解酶蛋白進行分析,最終獲得高膽鹽水解酶蛋白的信息,為Ligilactobacillussp.BD7642菌株開發(fā)提供借鑒,也為未來益生菌的改造提供新的思路和素材。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗使用的菌株和質粒見表1。PrimeSTAR?HS DNA高保真聚合酶、限制性核酸內切酸(BamH I、EcoR I)、In-Fusion Snap Assembly Master Mix試劑盒、細菌基因組提取試劑盒,大連寶生物有限公司;氨芐青霉素(ampicillin,Amp)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)、質粒提取試劑盒、DNA片段回收和膠回收試劑盒,上海生工生物工程股份有限公司;SurePAGETM、Bis-Tris,8%、12 wells蛋白預制膠,金斯瑞生物科技有限公司,6種膽鹽?；悄懰徕c鹽(taurocholic acid sodium salt,TAC)、甘氨膽酸鈉鹽(glycocholate sodium salt,GC)、牛磺脫氧膽酸鈉鹽(sodium taurodeoxycholate,TDC)、甘氨脫氧膽酸鈉鹽(sodium glycodeoxycholate,GDC)、甘氨鵝脫氧膽酸鈉鹽(glycochenodeoxycholic acid sodium salt,GCDC)、牛磺鵝脫氧膽酸鈉鹽(taurochenodeoxycholic acid sodium salt,TCDC),均為色譜純,美國sigma公司;乙腈、三氟乙酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。BUGBOX厭氧培養(yǎng)箱,BAKER RUSKINN;HZQ-X500C恒溫搖床,上海一恒科學儀器有限公司;超聲波細胞粉碎機,寧波新芝生物科技股份有限公司;電泳儀,Bio-Rid;DS-11超微量分光光度計,美國DeNovix;安捷倫1260高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;T3色譜柱(2.5 μm,2.1 mm×150 mm),沃特世科技(上海)有限公司。

表1 本研究使用的菌株和質粒

1.2 引物

本研究使用的引物見表2。

表2 本研究使用的引物

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

MRS培養(yǎng)基:德國默克公司;TPY(trypticase phytone yeast)培養(yǎng)基:青島海博生物公司;膽鹽水解酶活篩選平板:TPY+0.3%(質量分數(shù))牛磺脫氧膽酸鈉;LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5,蛋白胨10,氯化鈉10;發(fā)酵培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基+Amp (100 μg/mL)。

培養(yǎng)方法:挑取單菌落,接種于10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基37 ℃,180 r/min培養(yǎng)24 h進行活化;以2%的接種量再轉接到10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h作為種子液;將得到的種子液轉接到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,控制起始生物量OD600值為0.1。待菌株生長OD600值到0.8～1.0時,添加終濃度的500 μmol/L的IPTG在20 ℃誘導,12～16 h后結束誘導收集菌體。菌體置于冰水上經超聲波破碎儀處理(功率200 W,工作3 s,間隔2 s,共超聲15 min),12 000 r/min離心10 min收集上清液為菌體內容物。

1.4 表達質粒的構建

按照細菌基因組提取試劑盒說明書說明,提取Ligilactobacillussp.BD7642基因組,基因g1210、g1294、g1443通過Ligilactobacillussp.BD7642基因組PCR獲得,引物見表2。以pET302/NT-His為載體,經BamH I單酶切后,利用同源重組酶進行連接,構建成pET302-g1210、pET302-g1294、pET302-g1443。提取轉化子質粒并測序驗證。

1.5 蛋白電泳

按照SurePAGETM,Bis-Tris,8%、12 wells蛋白預制膠使用說明書說明將菌體內容物進行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.6 測定方法

膽鹽的測定通過高效液相色譜測定:6種膽鹽標準品混配100 mmol/L混樣,跑液相繪制標準曲線,將混配膽鹽標準品與菌體內容物1∶1混合,恒溫37 ℃反應3 h,對最終的剩余膽鹽進行定量;液相色譜程序如下:流動相為A:乙腈+0.09%三氟乙酸與B:水+0.1%三氟乙酸,梯度洗脫,0～2 min:V(A)∶V(B)=25∶75,2～10 min:V(A)∶V(B)=55∶45,10～15 min:V(A)∶V(B)=25∶75。流動相的流速為0.6 mL/min,檢測溫度為40 ℃,檢測波長為205 nm。

2 結果與分析

2.1 Ligilactobacillus sp.BD7642高膽鹽水解酶活性的發(fā)現(xiàn)

Ligilactobacillussp.BD7642菌株是光明乳業(yè)研究院菌種庫實驗室保藏菌株,為了獲得高膽鹽水解酶活性的菌株,對菌種庫中的菌株進行篩選。含有牛磺酸脫氧膽酸鈉的平板通常作為一個高效篩選膽鹽水解酶活性的手段[17],本研究發(fā)現(xiàn)該菌株在膽鹽水解酶活篩選平板上可以看到非常明顯的水解圈,見圖1,以該菌株作為研究對象,對其膽鹽水解酶的特異性進行分析。

a-膽鹽水解酶活篩選平板;b-復篩驗證平板

2.2 高效液相色譜分析膽鹽水解酶活性特異性

HPLC已經廣泛應用于化合物的分離鑒定中,具有高效、特異性好等的優(yōu)點,CORZO等[18]成功利用高效液相色譜法測定了嗜酸乳桿菌的膽鹽水解酶活性,夏永軍等[14]使用HPLC方法對植物乳桿菌的膽鹽水解酶的酶活性特性進行分析,HPLC可以同時檢測6種膽鹽的降解情況,本研究利用收集到的Ligilactobacillussp.BD7642菌體以及Ligilactobacillussp.BD7642的胞內酶與6種膽鹽的混合樣品進行反應,并利用HPLC檢測反應結果,獲得的峰圖信息見圖2。該菌株的膽鹽水解酶對牛磺酸膽鹽具有極強的降解能力,對3種?；撬崮扄}的降解率見表3,該菌株幾乎可以將牛磺酸膽鹽完全降解,具有極強的偏好性。已知膽鹽水解酶對甘氨酸膽鹽或牛磺酸膽鹽的偏好性是普遍存在的[19],來自于植物乳桿菌的膽鹽水解酶對甘氨酸膽鹽具有偏好性;在ZHU等[11]的研究中也揭示了膽鹽水解酶特異性的在膽汁酸調節(jié)中重要性,FOLEY等[20]解釋膽鹽水解酶的特異性對菌株的適應性和定殖具有重要的影響,并且會改變宿主的菌群結構,未來在膽鹽水解酶特異性的逐步認知中,其對干預肥胖的影響也將會進一步明晰,對工程設計相關膽鹽水解酶特異性來改善人類健康方面具有重要意義。

圖2 HPLC峰圖數(shù)據

表3 Ligilactobacillus sp.BD7642對牛磺酸3種膽鹽的降解率

2.3 膽鹽水解酶蛋白的異源表達

基于以上對該菌株膽鹽水解酶活性的分析,接下來對該菌株高膽鹽水解酶活性的蛋白進行研究。已知為了適應環(huán)境不同菌株的膽鹽水解酶基因通常會含有多個,如嗜酸乳桿菌NCFM具有2個不同膽鹽降解偏好性的膽鹽水解酶基因(bshA,bshB)[21],而植物乳桿菌含有4個膽鹽水解酶基因(bsh1-4)[22],對Ligilactobacillussp.BD7642基因組信息進行分析,確定3個疑似膽鹽水解酶基因分別為g1210、g1294、g1443,將這3個基因分別構建表達質粒,并轉化進E.coliBL21(DE3)中進行異源表達,將異源表達的結果進行SDS-PAGE電泳,結果見圖3-a,驗證蛋白表達成功,蛋白大小在35 kDa左右,將收獲的菌體在膽鹽水解酶活篩選平板上進行點板,生長48 h后,結果見圖3-b,g1210、g1294蛋白在菌體下方可以看到明顯的水解圈,但是g1443蛋白沒有觀察到。將包括這3個蛋白的的氨基酸序列進行比較,見圖4-a,發(fā)現(xiàn)g1210、g1294序列相似度更高,均具有更強的?；敲撗跄懰徕c的水解能力,將不同來源的膽鹽水解酶構建進化樹分析發(fā)現(xiàn),g1210、g1294、g1443分在了不同的分支上,g1294與鳥乳桿菌(Ligilactobacillusaviarius)來源的膽鹽水解酶關系更近,見圖4-b。接著利用HPLC的方法對這3個異源表達的蛋白同樣進行6種膽鹽的特異性降解分析,結果見圖5,發(fā)現(xiàn)g1294蛋白對3種?；撬崮扄}的降解能力都很強,g1210對牛磺脫氧膽酸降解能力較弱,對另外2個?；撬崮扄}降解能力較強,而g1443對?；蛆Z脫氧膽酸的降解能力強,但是對另外2個?；撬岬慕到饽芰^弱。在植物乳桿菌中發(fā)揮主要膽鹽水解酶活性的酶為BSH1[22],因此推測在Ligilactobacillussp.BD7642中g1294蛋白是膽鹽水解酶活性的關鍵蛋白。我們進一步將這3個蛋白與?；撬徇M行分子對接[23-24],結果見圖6,預測g1294與牛磺酸的結合更加緊密,可能造成?；撬崮扄}的水解位點更加暴露,有利于其進行水解反應,我們還將這個酶的活性位點在氨基酸序列上進行標注,見圖4-a,這3個酶的活性位點是相似的,未來研究將對這個酶的活性位點進行突變,找到關鍵位點,并通過定點突變的方法理性改變膽鹽水解酶的酶活性與特異性。

a-SDS-PAGE凝膠電泳圖;b-在篩選平板上的點板圖

a-g1210、g1294和g1443膽鹽水解酶氨基酸序列對比圖;b-g1210、g1294和g1443系統(tǒng)發(fā)育分析

圖5 g1210、g1294、g1443對膽鹽降解對比圖

圖6 分子對接模型與活性位點預測結果

3 結論

膽鹽水解酶可能是一個潛力巨大的針對肥胖癥、高膽固醇血癥等疾病的治療方案,本研究從Ligilactobacillussp.BD7642中發(fā)現(xiàn)的高膽鹽水解酶活性的蛋白g1294,在該菌的膽鹽水解酶活性中發(fā)揮著至關重要的作用。該酶對牛磺酸膽鹽具有明顯的偏好性,且通過分子對接的手段發(fā)現(xiàn)其與?；撬岬倪B接緊密,這對其偏好性做出了一定的解釋,本研究確定g1294蛋白在Ligilactobacillussp.BD7642菌中膽鹽水解酶的作用,并分析這個酶的活性中心位點,未來將對這個酶的活性位點進行研究,確定關鍵位點,也可以為合成生物學理性改變膽鹽水解酶活性提供參考和優(yōu)秀的供體。