唐柏蛟,楊賢慶,潘創(chuàng)*,魏涯,楊少玲,趙永強(qiáng),陳勝軍,許加超

1(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266003)

2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州,510300)

南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)殼薄體肥、營(yíng)養(yǎng)豐富、易消化,深受消費(fèi)者喜愛(ài)。然而對(duì)蝦的高水分、高蛋白使得蝦肉在貯藏過(guò)程中極易發(fā)生品質(zhì)劣變。肌原纖維蛋白(myofibrillar protein,MP) 是構(gòu)成蝦肌肉中最主要的蛋白質(zhì),MP是肌肉組織的主要結(jié)構(gòu)蛋白,約占蛋白質(zhì)總量的40%～60%[1]。蝦類變質(zhì)主要是由結(jié)構(gòu)蛋白的解構(gòu)引起的,蛋白質(zhì)的氧化是蝦品質(zhì)惡化的主要原因[2]。水產(chǎn)品保鮮一直是行業(yè)內(nèi)的研究熱點(diǎn),保鮮方法大體可分為化學(xué)法、物理法和生物保鮮法。但這些方法都存在一定局限性,故多種保鮮方式結(jié)合,利用多個(gè)柵欄因子間的相互作用來(lái)提高水產(chǎn)品質(zhì)量和保鮮技術(shù)水平是未來(lái)研究的發(fā)展趨勢(shì)[3]。微凍是使水產(chǎn)品處于部分凍結(jié)狀態(tài)的一種保藏方法,比冷藏大大延長(zhǎng)了水產(chǎn)品的貨架期,同時(shí)蛋白冷凍變性現(xiàn)象也沒(méi)凍藏嚴(yán)重,因此微凍是一種短期內(nèi)保持捕撈后水產(chǎn)品品質(zhì)較好的保鮮方法[4]。抗凍保鮮劑是冷凍水產(chǎn)品保持品質(zhì)的一種重要手段,磷酸鹽類作為一種傳統(tǒng)抗凍劑,過(guò)量攝入會(huì)對(duì)人體健康造成諸多不利影響[5]。因此,尋找天然、健康、高效的新型抗凍保鮮劑成了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

壇紫菜多糖(polysaccharides derived fromPorphyrahaitanensis,PHP),國(guó)內(nèi)外研究集中于抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和降血糖血脂等生物活性方面,而將其應(yīng)用于水產(chǎn)品抗凍保鮮的研究鮮有報(bào)導(dǎo)。基于本團(tuán)隊(duì)前期研究,發(fā)現(xiàn)5 mg/mL PHP浸泡處理可很好地維持微凍南美白對(duì)蝦仁的品質(zhì),而蛋白質(zhì)氧化與蝦品質(zhì)惡化有著密切聯(lián)系。因此,本研究以微凍南美白對(duì)蝦MP為研究對(duì)象,探究蝦仁經(jīng)PHP浸泡后在微凍過(guò)程中MP氧化特性和結(jié)構(gòu)特性的變化規(guī)律,從蛋白質(zhì)角度揭示PHP抗凍保鮮的潛在機(jī)制,以期為壇紫菜多糖在水產(chǎn)品保鮮應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活南美白對(duì)蝦,廣州市華潤(rùn)萬(wàn)家超市;壇紫菜,潮州市饒平縣;DEAE-52、Sephadex G-100,北京索萊寶科技有限公司;微量總巰基測(cè)試盒、蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)試盒,南京建成生物工程研究所;Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司;焦磷酸鈉(食品級(jí)),青島博智匯力生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H-1850R高速離心機(jī),長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器公司;T25組織勻漿機(jī),德國(guó)IKA公司;Sunrise-basic吸光度酶標(biāo)儀,德國(guó)TECAN公司;Nano-ZS90納米粒度分析儀,英國(guó)Malvern公司;Chirascan圓二色光譜儀,英國(guó)應(yīng)用光學(xué)物理公司;Cary Eclipse熒光分光光度計(jì),美國(guó)VARIAN公司;Pro高分辨率掃描電鏡,荷蘭Phenom公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理

原料處理工藝流程:

壇紫菜洗凈烘干、粉碎過(guò)篩→95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇脫脂和脂溶性色素、烘干→16 g壇紫菜干粉加1 L蒸餾水超聲40 min→90 ℃振蕩水浴浸提4 h、離心→上清液旋蒸濃縮、醇沉、離心→沉淀復(fù)溶、木瓜蛋白酶50 ℃酶解2.5 h、離心→Sevage法脫蛋白→透析、旋蒸、凍干→DEAE-52純化→Sephadex G-100純化→PHP。

鮮活南美白對(duì)蝦,在冰溫條件下清洗、去頭去尾去殼。選取個(gè)體大小一致的完整蝦仁(7～8 g),瀝干后用濾紙輕擦去表面水分。然后將蝦仁隨機(jī)分成3組,分別與蒸餾水(空白對(duì)照),5 mg/mL PHP以及5 mg/mL焦磷酸鈉(陽(yáng)性對(duì)照)以料液比1∶2(g∶mL)混合,置于4 ℃冰箱中浸泡2 h,每隔20 min攪拌1次[6]。取出蝦仁后,用濾紙拭去表面水分,裝入封口袋中,置于-3 ℃微凍冰箱貯存,每隔5 d隨機(jī)取樣測(cè)定指標(biāo),每個(gè)指標(biāo)做3個(gè)平行取平均值。值得一提的是,在各種磷酸鹽中,焦磷酸鈉對(duì)冷凍蝦仁的抗凍和保水效果均較佳,為了減少多因素對(duì)冷凍蝦仁抗凍保鮮特性的影響,本文選擇單一的焦磷酸鈉處理作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2 MP提取

參考楊肖杰等[1]的方法并稍作修改,采用Bradford試劑盒檢測(cè)提取的MP溶液質(zhì)量濃度。整個(gè)提取過(guò)程蛋白溶液注意保持冰溫。

1.3.3 總巰基含量的測(cè)定

采用微量總巰基測(cè)試盒,按照其說(shuō)明書(shū)取MP原液對(duì)總巰基含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 羰基含量的測(cè)定

采用蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)試盒,按照其說(shuō)明書(shū)取MP原液對(duì)羰基含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 表面疏水性的測(cè)定

參考CHIN等[7]的方法并稍作修改。將MP用0.02 mol/L的PBS緩沖液調(diào)整濃度到1 mg/mL,取1 mL與200 mL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液室溫漩渦15 min后于5 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min,上清液稀釋10倍后于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。以PBS為對(duì)照,溴酚藍(lán)結(jié)合量表示表面疏水性,計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0為空白對(duì)照吸光度;A1為樣品吸光度。

1.3.6 粒徑的測(cè)定

參考BELICIU等[8]的方法并稍作修改。粒徑使用納米粒度儀進(jìn)行測(cè)定,用蒸餾水將MP溶液稀釋到1 mg/mL,取適量于比色皿中,再放入測(cè)量池內(nèi),參數(shù)設(shè)定為平衡時(shí)間60 s,溫度25 ℃,散射角90°。

1.3.7 Zeta電位的測(cè)定

參考BELICIU等[8]的方法并稍作修改。方法與粒徑測(cè)定相同,MP溶液質(zhì)量濃度同樣是1 mg/mL,取適量于比色皿中并放入樣品池,室溫下使用納米粒度儀測(cè)定Zeta電位。

1.3.8 圓二色光譜的測(cè)定

參考李可等[9]的方法并稍作修改,室溫下使用圓二色光譜儀對(duì)MP二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。調(diào)節(jié)MP濃度到0.5 mg/mL,取適量置于1 mm比色皿中并放入樣品池內(nèi)。儀器參數(shù):響應(yīng)0.5 s、掃描范圍190～260 nm、掃描步階1 nm、縫寬1 nm,摩爾橢圓率表示圓二色性,CDNN軟件計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.9 內(nèi)源熒光光譜的測(cè)定

參考SHI等[10]的方法并稍作修改,室溫下使用熒光分光光度計(jì)對(duì)MP三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。用0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來(lái)酸(pH 7.0) 調(diào)節(jié)MP質(zhì)量濃度為1 mg/mL,取適量置于比色皿中并放入樣品池內(nèi)。儀器參數(shù):激發(fā)波長(zhǎng)295 nm,發(fā)射波長(zhǎng)范圍300～400 nm,速率1 200 nm/min,狹縫寬5 nm。用Tris-馬來(lái)酸溶液調(diào)零。

1.3.10 肌肉組織掃描電鏡分析

參考顏龍杰等[11]的方法并稍作修改,用刀片平行于蝦肌肉紋理切成米粒大小的組織樣本,立即投入10倍以上體積的電鏡固定液中,室溫固定2 h,再轉(zhuǎn)移至4 ℃固定24 h,0.2 mol/L PBS緩沖液(pH 7.2)漂洗2次,然后1% OsO4溶液室溫浸泡1 h,使用不同梯度體積分?jǐn)?shù)的乙醇脫水若干次后再用乙酸異戊酯置換乙醇,在樣品表面濺射鍍金后用掃描電鏡拍攝。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,單因素方差分析中的鄧肯模型,P<0.05表示數(shù)據(jù)間有顯著性差異。使用Origin 2021以及GraphPad Prism 8.0進(jìn)行圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 總巰基含量

總巰基含量是反映蛋白質(zhì)氧化程度的指標(biāo)之一,蛋白質(zhì)氧化是蛋白質(zhì)共價(jià)修飾的一種模式,在貯藏過(guò)程中巰基容易被氧化為二硫鍵,導(dǎo)致總巰基含量下降[12]。不同浸泡處理后的南美白對(duì)蝦仁在微凍過(guò)程中的總巰基變化如圖1所示,所有處理組的總巰基含量都隨貯藏時(shí)間的推移呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)。到貯藏末期,蒸餾水、PHP和焦磷酸鈉處理組的總巰基含量相比初始值分別下降了61.51%、43.90%和55.75%。PHP處理組的總巰基含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),結(jié)果表明PHP可以抑制MP中總巰基含量下降,這與袁悅[13]的研究結(jié)果一致。在微凍儲(chǔ)存過(guò)程中,對(duì)照樣品和PHP處理樣品的巰基含量的顯著性差異可能是由于MP的巰基對(duì)氧化敏感性的差異,掩蔽了肌動(dòng)球蛋白分子的活性巰基[12]。另外,蛋白質(zhì)聚集引起的SH基團(tuán)的掩蔽也會(huì)導(dǎo)致SH含量的下降[14]。

圖1 PHP對(duì)微凍南美白對(duì)蝦仁MP總巰基含量的影響

2.2 羰基含量

羰基是測(cè)定蛋白質(zhì)氧化程度最常用的指標(biāo),主要由賴氨酸、脯氨酸、精氨酸等直接氧化生成,其含量變高表明蛋白質(zhì)氧化程度增大。蛋白質(zhì)羰基化是蝦肌肉蛋白氧化最重要的變化之一,不同浸泡處理后的南美白對(duì)蝦仁在微凍過(guò)程中的羰基含量變化如圖2所示,各處理組的羰基含量在貯藏期內(nèi)呈顯著上升趨勢(shì)(P<0.05)。肌原纖維的氧化導(dǎo)致大范圍的氨基酸側(cè)鏈修飾,形成了羰基化合物[12]。另外在長(zhǎng)期微凍貯存過(guò)程中,冰晶的形成對(duì)肌肉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)造成損傷并釋放自由基[15],同時(shí)脂肪氧化降解也會(huì)產(chǎn)生自由基,自由基攻擊蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈、肽鏈骨架,導(dǎo)致氨基酸側(cè)鏈暴露,發(fā)生蛋白質(zhì)聚合、交聯(lián)等反應(yīng),可能使蛋白質(zhì)氧化程度增加,羰基含量增加[16]。PHP處理組的羰基含量在各貯藏時(shí)期都顯著低于其他處理組(P<0.05),這表明PHP浸泡處理蝦仁能有效抑制羰基的生成和MP的氧化,與相悅等[17]瓊膠寡糖可延緩羰基含量上升的結(jié)果一致,這可能與PHP具有較強(qiáng)的清除自由基和金屬離子螯合能力有關(guān),另外PHP還可能與冰晶結(jié)合,通過(guò)抑制冰晶的生長(zhǎng)來(lái)控制肌肉的機(jī)械損傷,和抑制脂肪氧化從而使蛋白質(zhì)氧化變性的程度降低。蛋白質(zhì)變性是指蛋白質(zhì)在某些物理和化學(xué)因素作用下,次級(jí)鍵受到破壞其特定的空間構(gòu)象發(fā)生改變,蛋白質(zhì)氧化和變性都可導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的改變,蛋白質(zhì)氧化和脂肪氧化都會(huì)在一定程度上誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生變性[18]。

圖2 PHP對(duì)微凍南美白對(duì)蝦仁MP羰基含量的影響

2.3 表面疏水性

表面疏水性與蛋白質(zhì)分子氧化引起的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[19],是判斷蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)變化的主要指標(biāo)。它反映的是蛋白表面的疏水性氨基酸殘基數(shù)目,根據(jù)氨基酸殘基跟溴酚藍(lán)結(jié)合量來(lái)表征蛋白質(zhì)氧化變性程度[20]。不同浸泡處理后的南美白對(duì)蝦仁在微凍過(guò)程中的表面疏水性變化如圖3所示。各組樣品的溴酚藍(lán)結(jié)合量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而呈整體上升趨勢(shì),相比鮮蝦有顯著的增加(P<0.05)。蛋白質(zhì)去折疊暴露在其表面的疏水性氨基酸殘基增加,導(dǎo)致表面疏水性上升[20]。另外芳香族氨基酸的展開(kāi)和暴露也可能是增加表面疏水性的主要因素[21]。蝦仁貯存第15天后,PHP組的溴酚藍(lán)結(jié)合量顯著低于蒸餾水組和焦磷酸鈉組(P<0.05),這說(shuō)明PHP在一定程度上可以抑制MP表面疏水性的增加。ZHANG等[12]也發(fā)現(xiàn)卡拉膠可降低冷凍貯藏期間凡納濱對(duì)蝦MP的表面疏水性,與本研究結(jié)果類似。PHP分子含有羥基、氨基等親水性基團(tuán),也包含大量氫鍵,可降低蛋白表面疏水性可能是由于蛋白質(zhì)分子與PHP之間的親水性相互作用。還可能通過(guò)抑制蛋白質(zhì)的氧化和變性,限制了蝦蛋白表面疏水性的增加。此外,PHP浸泡蝦仁后在其表面形成的糖膜是一種防止氧化變化的保護(hù)屏障,延緩了表面疏水性的增加[19]。

圖3 PHP對(duì)微凍南美白對(duì)蝦仁MP表面疏水性的影響

2.4 粒徑

粒徑可表征MP的聚集程度和聚集體的大小,反映蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化[22]。用動(dòng)態(tài)光散射法評(píng)估了各組浸泡處理和微凍貯存對(duì)南美白對(duì)蝦仁MP聚集的影響,肌原纖維蛋白溶液的平均粒徑(Z-Average值)越大,說(shuō)明MP聚集越嚴(yán)重。粒徑分布如圖4所示,MP聚集體在測(cè)試范圍內(nèi)呈現(xiàn)單一粒徑分布峰,說(shuō)明各實(shí)驗(yàn)組的蛋白粒徑分布是均勻和穩(wěn)定的。隨著貯藏時(shí)間的推移,各組粒徑分布主峰位置逐漸向大粒徑方向偏移,PHP組和焦磷酸鈉組的粒徑始終分布在100～1 000 nm內(nèi),而蒸餾水組粒徑則在貯藏末期超出了2 000 nm。平均粒徑變化如圖5所示,所有樣品的平均粒徑在貯存過(guò)程中均顯著增加(P<0.05)。平均粒徑的變化主要是由于微凍過(guò)程中MP的展開(kāi)和蛋白表面積的增加所致。此外,蛋白質(zhì)間的二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用也增強(qiáng)了,促進(jìn)了MP的聚集[15];蛋白質(zhì)氧化變性造成蛋白質(zhì)骨架裂解、交聯(lián)聚集絮凝,同時(shí)冰晶的生長(zhǎng)促使肌原纖維蛋白分子之間形成非共價(jià)鍵,導(dǎo)致蛋白質(zhì)鏈大量聚集,形成不溶性大分子凝集體使MP粒徑增加[23]。結(jié)果還表明,與對(duì)照組相比,PHP和焦磷酸鈉浸泡處理蝦仁都可顯著延緩微凍蝦仁MP平均粒徑的增加(P<0.05),即可有效抑制MP聚集。糖類含有大量游離羥基,可結(jié)合水分子,阻止冰晶的形成與生長(zhǎng),延緩了蛋白質(zhì)聚集和變性,從而抑制了蛋白質(zhì)聚集體的形成和粒徑的增加[18]。而磷酸鹽可以破壞MP大分子,阻礙其在低溫下的聚集從而抑制MP粒徑增加[24]。

圖4 PHP對(duì)微凍南美白對(duì)蝦仁MP粒徑分布的影響

圖5 PHP對(duì)微凍南美白對(duì)蝦仁MP平均粒徑的影響

2.5 Zeta電位

Zeta電位表示蛋白表面的有效電荷,是MP穩(wěn)定性的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo),可用于評(píng)估帶電生物聚合物之間靜電相互作用力的大小,反映蛋白質(zhì)的分散和聚集[15]。Zeta電位絕對(duì)值變小,說(shuō)明生物聚合物之間靜電相互作用力變小、聚集程度增加。如圖6所示,在貯藏初期,各組MP都具有相對(duì)較大的Zeta電位絕對(duì)值,隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),各組Zeta電位絕對(duì)值顯著降低(P<0.05),這可能與部分蛋白變性和聚集體形成有關(guān)[25]。與對(duì)照組相比,PHP和焦磷酸鈉浸泡處理均可顯著延緩MP的Zeta電位絕對(duì)值的降低(P<0.05),意味著同性電荷的靜電排斥更強(qiáng),使蛋白質(zhì)溶液更穩(wěn)定,形成的分子或分散的顆粒更小[22]。結(jié)果說(shuō)明PHP組和焦磷酸鈉組的MP聚集和氧化變性程度較空白組低,從側(cè)面說(shuō)明它們的MP結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定受破壞程度更低,這與后文的圓二色譜和熒光光譜結(jié)果前后保持一致。這可能是因?yàn)镻HP抑制了冰晶的形成以及蛋白和脂肪氧化,從而降低了蛋白變性和聚集,有利于MP結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。GAO等[25]發(fā)現(xiàn)添加1%多糖(瓜爾膠和殼聚糖)結(jié)合高強(qiáng)度超聲處理可減小粒徑、影響Zeta電位,防止蛋白質(zhì)聚集,協(xié)同提高了低鹽MP乳液的穩(wěn)定性。

圖6 PHP對(duì)微凍南美白對(duì)蝦仁MP Zeta電位的影響

2.6 圓二色光譜分析

α-螺旋結(jié)構(gòu)的圓二色譜通常在192 nm處有1正峰,在208 nm和222 nm處有2個(gè)負(fù)峰[26]。圖7所示表明南美白對(duì)蝦仁肌原纖維蛋白是典型的以α-螺旋為主的二級(jí)結(jié)構(gòu)。與鮮蝦相比,各組貯藏末期的肌原纖維蛋白的圓二色光譜特征峰強(qiáng)度明顯減小,尤其是蒸餾水組的α-螺旋特征負(fù)峰幾乎趨平,而PHP組則能很好維持α-螺旋結(jié)構(gòu)。圖8所示是各組貯藏期內(nèi)的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化,所有MP樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)性能均有所下降,α-螺旋大幅下降,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角略有增加,無(wú)規(guī)卷曲增加明顯。與初始值相比,蒸餾水、PHP和焦磷酸鈉處理組貯藏末期的α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量比初始值分別下降了50.81%、15.96%和22.99%,說(shuō)明PHP浸泡處理有利于維持微凍南美白對(duì)蝦仁肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。α-螺旋結(jié)構(gòu)的下降說(shuō)明疏水殘基的暴露導(dǎo)致了肌球蛋白桿部的變化。此外,二硫鍵的形成也可能是肌球蛋白桿部氧化的關(guān)鍵原因,從而導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。PHP可能通過(guò)與α-螺旋形成復(fù)合物來(lái)防止肌球蛋白損傷,或者在蛋白質(zhì)分子的功能位點(diǎn)上相互作用,阻礙了蛋白質(zhì)與自由水分子的相互作用,因此對(duì)冰晶誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性有抑制作用,從而增加MP的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。這與WALAYAT等[27]報(bào)道的低聚葡甘聚糖可提高鰱魚(yú)魚(yú)糜在波動(dòng)冷凍期間α-螺旋含量穩(wěn)定性的結(jié)果類似。

圖7 PHP對(duì)微凍南美白對(duì)蝦仁MP 圓二色光譜的影響

圖8 PHP對(duì)微凍南美白對(duì)蝦仁MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.7 內(nèi)源熒光光譜分析

蛋白質(zhì)中的色氨酸殘基能發(fā)射熒光,主要位于折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水環(huán)境中,因此熒光光譜可以監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)中氨基酸殘基及其微環(huán)境的變化[28]。各處理組MP內(nèi)源熒光強(qiáng)度的變化如圖9所示,蝦仁經(jīng)不同浸泡處理微凍貯藏后各組MP內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨時(shí)間推移有不同程度的降低趨勢(shì)。這可能是由于蝦在微凍貯藏過(guò)程中水的結(jié)晶和再結(jié)晶所致的機(jī)械損傷以及蛋白氧化變性使MP結(jié)構(gòu)逐漸展開(kāi),色氨酸殘基暴露引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低。相比鮮蝦,各處理組最大熒光峰位置出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象,說(shuō)明MP分子內(nèi)部極性變高,埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水氨基酸逐漸暴露在分子表面使MP的表面疏水性增加[1]。PHP處理組的內(nèi)源熒光強(qiáng)度變化最小,說(shuō)明PHP浸泡處理有利于維持微凍南美白對(duì)蝦仁MP三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,與前文圓二色光譜分析得出的PHP能維持MP結(jié)構(gòu)穩(wěn)定結(jié)論保持一致。與ZHENG等[29]發(fā)現(xiàn)金針菇多糖處理凍融大黃魚(yú)背肌可抑制其MP熒光強(qiáng)度降低的結(jié)果一致。

圖9 PHP對(duì)微凍南美白對(duì)蝦仁MP熒光光譜的影響

2.8 掃描電鏡分析

掃描電鏡可用于觀察蝦肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)的變化,蝦仁微凍貯藏期間微觀結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖10。由圖10可知,新鮮樣品肌肉纖維結(jié)構(gòu)彼此緊密相連,結(jié)構(gòu)完整,成規(guī)則平行排列的束狀。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),肌肉結(jié)構(gòu)由致密逐漸散開(kāi),肌纖維因受冰晶擠壓斷裂,空隙增加,持水性下降。各處理組的樣品組織微觀結(jié)構(gòu)外觀有顯著差異。蒸餾水處理的樣品在微凍貯藏期間肌肉纖維逐漸收縮,水分流失,纖維斷裂逐漸嚴(yán)重,且有片狀化現(xiàn)象,結(jié)構(gòu)被氧化破壞,肌肉失去了保水能力。另外,纖維結(jié)構(gòu)有較多空隙,可能是由于冰晶形成的空隙。而PHP浸泡處理的樣品,盡管其結(jié)構(gòu)組織不如新鮮樣品好,但纖維組織僅有較小的變化,肌肉纖維明顯比其他兩組結(jié)構(gòu)更緊密完整,成束狀平行排列更規(guī)則,無(wú)明顯空隙,PHP組肌肉纖維斷裂扭曲和片狀化現(xiàn)象要明顯少于蒸餾水組和焦磷酸鈉組。結(jié)果表明,PHP組的肌肉結(jié)構(gòu)受氧化的影響不大,說(shuō)明PHP浸泡有利于維持微凍蝦仁的肌肉結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和完整性。這可能是由于PHP可在蝦仁表面形成糖膜而對(duì)肌肉組織具有保護(hù)和保水作用,此外PHP還可能通過(guò)抑制冰晶的形成而減小肌肉組織的機(jī)械損傷,從而維持蝦肉組織的微觀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。這與武天昕[5]發(fā)現(xiàn)瓊膠寡糖能有效地抑制冰晶的生長(zhǎng),維持凍藏南美白對(duì)蝦仁微觀結(jié)構(gòu)的完整性結(jié)果一致。

X-新鮮蝦仁;S-蒸餾水組;P-PHP組;J-焦磷酸鈉組

3 結(jié)論

通過(guò)研究PHP浸泡的南美白對(duì)蝦仁在微凍過(guò)程中MP氧化和結(jié)構(gòu)特性的變化,從蛋白質(zhì)維度揭示了PHP抗凍保鮮機(jī)制。PHP浸泡處理蝦仁能顯著延緩MP總巰基含量的下降,有效抑制羰基含量生成和表面疏水性的增加。另外,PHP可能通過(guò)抑制冰晶的形成和抗氧化等作用,降低了MP的冷凍變性和聚集。由MP在貯藏期間的粒徑分布、平均粒徑和Zeta電位結(jié)果分析得出PHP處理后蝦肉蛋白穩(wěn)定性較空白組強(qiáng),有效防止蛋白質(zhì)聚集。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明,PHP有利于維持MP的α-螺旋結(jié)構(gòu),阻礙色氨酸熒光猝滅和MP空間結(jié)構(gòu)展開(kāi),從而保持MP結(jié)構(gòu)特性的穩(wěn)定。掃描電鏡結(jié)果證實(shí)PHP可抑制冰晶形成,防止肌原纖維扭曲斷裂,維持肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)完整性。綜上,PHP可有效控制MP氧化和聚集并有利于蛋白空間結(jié)構(gòu)和肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,且效果優(yōu)于焦磷酸鈉。