吳晨光,李兆豐,2,3,4,顧正彪,2,3,班宵逢,2,3,洪雁,2,3,程力,2,3,4,李才明,2,3*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

2(江南大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122)

3(江南大學(xué),江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 無錫,214122)

4(江南大學(xué),白馬未來食品研究院,江蘇 無錫,214122)

植物精油是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物,主要來自于植物的花、根、葉、樹皮、果實(shí)、種子等,揮發(fā)性高,具有強(qiáng)烈的芳香氣味[1]。植物精油中的化學(xué)成分比較復(fù)雜,主要包括酚類、烯類、脂類、萜類、醛酮類等化合物及其衍生物。其中,酚類、萜類和醛酮類物質(zhì)是主要的抑菌成分,正是由于這些生物活性物質(zhì)的存在,使其具有良好的抑菌效果,并且,植物精油從天然產(chǎn)物中提取,與化學(xué)合成抑菌劑相比,具有廣泛的抑菌特性以及對人體較小的危害,是合成抑菌劑的優(yōu)良替代品[2]。

但是植物精油對高溫、紫外等環(huán)境敏感,生物活性物質(zhì)容易揮發(fā),并且植物精油親水性較差,在水溶液中的溶解度較低,導(dǎo)致其在實(shí)際應(yīng)用中受限[3]。

乳液遞送體系可將精油包埋,使精油分子得到有效的保護(hù)、提高植物精油的水溶解性和生物利用度[4]。SYED等[5]利用吐溫80和阿拉伯膠制備了香葉醇和香芹酚精油乳液,表明其對蠟狀芽胞桿菌和大腸桿菌均有良好的抑菌活性。MAURIELLO等[6]利用乳清分離蛋白和吐溫80分別作為乳化劑制備了香芹酚乳液,發(fā)現(xiàn)乳液中香芹酚含量越高,其最小抑菌濃度越低,抑菌活性越強(qiáng)。目前研究中,需在乳液體系中添加較多的乳化劑來穩(wěn)定乳液,而乳化劑的增加會影響乳液的抑菌性,同時(shí)精油的負(fù)載量也受到限制[7]。因此,如果能夠以較少的乳化劑制備出精油負(fù)載量較高的乳液,將節(jié)省乳液的制備成本,精油的利用率也將大大提升。

在本研究中,使用吐溫80、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)作為乳化劑,使用無水乙醇作為助乳化劑,制備不同的香芹酚乳液,探究乳化劑的添加量對乳液粒徑、多分散指數(shù)(polydispersity index,PDI)以及Zeta電位的影響,同時(shí),探究不同精油含量下香芹酚乳液的穩(wěn)定性和抑菌性差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

香芹酚(carvacrol,CA,>99%),廣州日化化工有限公司;大腸桿菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、沙門氏菌(ATCC 14028)、枯草芽孢桿菌(CMCC 63501),上海魯微科技有限公司;無水乙醇、吐溫80、SDS、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉以及其他常用分析純化學(xué)試劑,國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

C-MAG HS 10型加熱磁力攪拌器、T18型高速剪切機(jī),德國IKA有限公司;SCIENTZ 150型高壓均質(zhì)機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;SK-O180-E型圓周(線性)搖床,大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;GI54T型高壓滅菌器,美國致微公司;BPH-9042型精密恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;ZetaSizer nano ZS型納米粒度及Zeta電位儀,英國馬爾文公司;SW-CJ-2FD型潔凈工作臺,蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;UV-3600 plus型紫外可見近紅外分光光度計(jì),日本島津公司;DHR-3型流變儀,美國沃特世公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香芹酚精油乳液的制備

使用吐溫80和SDS作為乳化劑,并將CA和無水乙醇混合成香芹酚乙醇混合液(carvacrol ethanol solution,CES),其中CES中CA的含量分別為100%、75%、50%、25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。分別將CES和乳化劑添加到一定量去離子水中,在室溫下以300 r/min的轉(zhuǎn)速磁力攪拌20 min,然后使用高速剪切機(jī)在1.0×104r/min下高速剪切2 min,得到粗乳液,在300 Bar壓力下,使用高壓均質(zhì)機(jī)循環(huán)均質(zhì)3次,得到香芹酚精油納米乳液。其中吐溫80的添加量為10、30、50、70、90 g/L,SDS的添加量分別為1、3、5、7、9 g/L,CES的添加量分別為100、150、200、300、400 g/L。

1.3.2 乳液的平均粒徑、PDI、Zeta電位測定

使用納米粒度及Zeta電位儀測定香芹酚精油乳液的粒徑、PDI及Zeta電位。儀器參數(shù)設(shè)置為固定角度90°、散射角為173°、相對折射率為1.590、吸收率為0.001、平衡時(shí)間120 s、測量溫度為25 ℃,測量前用去離子水將樣品稀釋100倍[8]。

1.3.3 乳液流變行為測定

使用流變儀對香芹酚精油乳液的流變特性進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)使用4 cm平板,間距為0.5 mm,在25 ℃下,測定不同剪切速率(0.01～100 s-1)下乳液的表觀黏度變化[9]。

1.3.4 貯藏穩(wěn)定性測定

將乳液分別在4 ℃和25 ℃下貯藏,在0、15、30、45 d測定乳液的平均粒徑。

1.3.5 抑菌性測定

1.3.5.1 細(xì)菌菌懸液的制備

取100 μL細(xì)菌菌種接種于50 mL TSB培養(yǎng)基中,于37 ℃搖床中培養(yǎng)12 h,并使用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5.2 抑菌圈大小的測定

參考黃旭華等[10]的方法并作出修改進(jìn)行抑菌圈大小的測定,操作均在無菌條件下進(jìn)行。取直徑為35 mm的一次性塑料培養(yǎng)皿,傾注加入加熱融化的TSA培養(yǎng)基2 mL,均勻攤布,使其凝固,作為底層。將加熱融化的TSA培養(yǎng)基放冷至45～50 ℃,加入供試菌菌懸液,使菌濃度在105～106CFU/mL,并將牛津杯置于凝固的TSA培養(yǎng)基上方中心位置,在每個(gè)平板中分別加入3 mL含菌懸液的TSA培養(yǎng)基,使其環(huán)繞在牛津杯外側(cè),均勻攤布,作為菌層。待菌層凝固后,取出牛津杯,在孔中加入100 μL相同精油濃度的抑菌溶液,將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24 h后,采用十字交叉法測量抑菌圈大小,重復(fù)3次,以無菌水作為空白對照。

1.3.5.3 最小抑菌濃度的測定

按照瓊脂稀釋法測定香芹酚精油和香芹酚乳液的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。分別將香芹酚和乳液稀釋到一定濃度,然后與等量的雙倍瓊脂培養(yǎng)基混合,制備香芹酚質(zhì)量濃度為5～0.009 8 mg/mL的梯度平板,取菌濃度約為107CFU/mL的菌懸液2 μL接種于平板表面,最后將平板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察有無菌體生長[11]。

1.3.6 抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除能力測定參考梁尚云[12]的方法并稍作修改。配制200 μmol/L DPPH-乙醇溶液,取2 mL稀釋后的樣品,加入2 mL DPPH-乙醇溶液并混合均勻,避光反應(yīng)30 min,在517 nm下測定吸光度值。DPPH自由基清除率的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0,無水乙醇與DPPH-乙醇溶液混合后的吸光度值;A1,樣品與無水乙醇混合后的吸光度值;A2,樣品與DPPH-乙醇溶液混合后的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差;采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析,其中P<0.05視為顯著,程序選擇:Duncan;采用Origin Pro 2017進(jìn)行圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 香芹酚乳液的粒徑、PDI和Zeta電位

2.1.1 吐溫80添加量對香芹酚乳液粒徑、PDI、Zeta電位的影響

當(dāng)CES的添加量為100 g/L時(shí),不同吐溫80含量下制備的香芹酚乳液的粒徑、PDI及Zeta電位如表1所示。香芹酚乳液的粒徑隨著吐溫80含量的增加,香芹酚乳液的粒徑和PDI變化均是先減小后增大,當(dāng)吐溫80含量為50 g/L時(shí),粒徑最小。其原因可能是當(dāng)吐溫80含量較低時(shí),精油未被完全包埋,無法形成小液滴,增加吐溫80的含量,使得乳液粒徑減小,而繼續(xù)增加吐溫80的含量,乳液中過多的乳化劑會形成膠束,從而導(dǎo)致粒徑和PDI的增大[13]。Zeta電位一般用來表示乳液分散體系的穩(wěn)定性,由于乳液液滴間存在靜電斥力,Zeta電位絕對值越高表示乳液體系越穩(wěn)定[14]。當(dāng)吐溫80含量為10～50 g/L時(shí),香芹酚乳液的Zeta電位絕對值會隨著吐溫80含量的增加增大,而吐溫80含量為50～90 g/L時(shí),Zeta電位變化不明顯。因此,選擇50 g/L的吐溫80含量進(jìn)行后續(xù)的研究。

表1 吐溫80添加量對香芹酚乳液的平均粒徑、PDI和Zeta電位的影響

2.1.2 CES中CA含量對香芹酚乳液粒徑、PDI、Zeta電位的影響

當(dāng)吐溫80的含量為50 g/L、CES的添加量為100 g/L時(shí),CES中不同CA含量下制備的香芹酚乳液的粒徑、PDI及Zeta電位如表2所示。無水乙醇常作為助溶劑進(jìn)行精油乳液的制備,不添加無水乙醇的香芹酚乳液粒徑和PDI較大,隨著CES中CA含量的降低,乳液的粒徑和PDI變化均為先減小后增大,而Zeta電位絕對值卻逐漸降低。其原因可能是適量無水乙醇的加入降低了乳液體系的界面張力,增強(qiáng)了香芹酚的水溶解性,使得乳液的粒徑和PDI降低,但當(dāng)CES中無水乙醇含量較高時(shí),阻礙了乳液界面膜的形成,使得乳液的粒徑增大、Zeta電位絕對值降低[15]。因此,選擇75%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CA含量的CES[即m(香芹酚)∶m(無水乙醇)=3∶1)]進(jìn)行后續(xù)研究。

表2 CES中CA的含量對香芹酚乳液的平均粒徑、PDI和Zeta電位的影響

2.1.3 SDS添加量對香芹酚乳液粒徑、PDI、Zeta電位的影響

當(dāng)吐溫80的含量為50 g/L、CES的添加量為100 g/L時(shí),不同SDS含量下制備的香芹酚乳液的粒徑、PDI及Zeta電位如表3所示。從測定結(jié)果可以看出,SDS的加入使得香芹酚乳液的粒徑和PDI降低,Zeta電位絕對值增加。并且香芹酚乳液的平均粒徑和PDI會隨著SDS含量的增加而降低,而Zeta電位絕對值則隨著SDS含量的增加先增大后減小,當(dāng)SDS含量為5 g/L時(shí),Zeta電位絕對值最高。其原因可能是SDS的加入降低了界面張力,并能夠在液滴上形成保護(hù)層,增強(qiáng)液滴間的靜電斥力,使得乳液粒徑和PDI降低、Zeta電位絕對值增加,但過多的SDS會和吐溫80形成膠束,減弱了液滴間的靜電斥力,使得降乳液的Zeta電位絕對值降低[16]。因此,選擇5 g/L的SDS含量進(jìn)行后續(xù)的研究。

表3 SDS添加量對香芹酚乳液的平均粒徑、PDI和Zeta電位的影響

2.1.4 CES添加量對香芹酚乳液粒徑、PDI、Zeta電位的影響

以吐溫80作為乳化劑或以吐溫80和SDS作為復(fù)合乳化劑制備不同CES含量的香芹酚乳液,其平均粒徑、PDI和Zeta電位測量結(jié)果見表4。只使用50 g/L的吐溫80作為乳化劑,可以穩(wěn)定香芹酚乳液,但當(dāng)CES含量達(dá)到250 g/L時(shí),會迅速出現(xiàn)破乳現(xiàn)象,乳液極不穩(wěn)定。吐溫80體系中,香芹酚乳液粒徑會隨著CES含量的增加而不斷增大,PDI值為0.39～0.41,均在0.3以上,說明體系分散不均勻,乳液粒徑大小不均一[17]。其原因可能是在50 g/L的吐溫80含量下,隨著CES含量的增加,吐溫80不足以完全覆蓋乳液液滴,乳液由于聚結(jié)而不穩(wěn)定,導(dǎo)致其粒徑增大[18]。而SDS的添加可顯著降低香芹酚乳液的平均粒徑和PDI,并且將CES含量提高到了400 g/L,而當(dāng)CES含量提高到500 g/L時(shí),乳液過于黏稠,無法進(jìn)行均質(zhì)過程。使用50 g/L的吐溫80和5 g/L的SDS共同穩(wěn)定香芹酚乳液,平均粒徑和PDI都會隨著CES含量的增加而減小,當(dāng)CES含量為400 g/L時(shí),平均粒徑和PDI最小。其原因可能是SDS和吐溫80疏水鏈之間存在相互作用,形成了更加剛性的膠束,使得疏水性的香芹酚分子更穩(wěn)定地包裹在膠束中,從而增加了香芹酚的溶解度,提高了香芹酚乳液的穩(wěn)定性[19]。

表4 CES添加量對香芹酚乳液的平均粒徑、PDI和Zeta電位的影響

在吐溫80體系中,Zeta電位絕對值會隨著CES含量的增加而增大。其原因可能是香芹酚所含有的一些陰離子基團(tuán)以及非離子表面活性劑吐溫80會在油水界面上產(chǎn)生負(fù)電荷,當(dāng)香芹酚含量增加時(shí),過多的陰離子基團(tuán)暴露在油水界面導(dǎo)致電位絕對值的增加[20]。而吐溫80/SDS(T/S)穩(wěn)定的香芹酚乳液,Zeta電位絕對值均處于較高的值,其原因可能是SDS為陰離子表面活性劑,帶負(fù)電荷,SDS的加入增強(qiáng)了乳液液滴之間產(chǎn)生的靜電斥力,使得吐溫80/SDS體系的乳液更加穩(wěn)定[21]。但是,Zeta電位只能表示香芹酚乳液測試時(shí)的穩(wěn)定性,并不能說明乳液的長期穩(wěn)定性[22]。因此,有必要探究其貯藏穩(wěn)定性。

2.2 貯藏穩(wěn)定性

吐溫80體系和吐溫80/SDS體系的香芹酚乳液在4 ℃和25 ℃下的貯藏45 d的粒徑變化如圖2所示。通過測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),吐溫80體系的香芹酚乳液貯藏在4 ℃下時(shí),貯藏30 d后粒徑會有明顯的增加,而在25 ℃下貯藏15 d后粒徑迅速增加,由此可見,吐溫80體系的香芹酚乳液更適合在低溫下貯藏。粒徑增加的原因可能是乳液在高壓均質(zhì)過程中吸收了過多的能量,形成了小液滴,維持了乳液的穩(wěn)定性,但在貯藏過程中受到奧斯特瓦爾德熟化的作用,小液滴聚集成大液滴,導(dǎo)致粒徑的增大[23-24]。而吐溫80/SDS體系的香芹酚乳液在4 ℃、25 ℃下貯藏45 d,其粒徑無明顯變化,表明吐溫80/SDS體系的香芹酚乳液貯藏穩(wěn)定性良好,可見SDS的加入增強(qiáng)了香芹酚乳液的貯藏穩(wěn)定性。

a-4 ℃;b-25 ℃

2.3 乳液的流變特性

乳液的流變行為不僅影響乳液的適用性,還關(guān)系到乳液的穩(wěn)定性[25]。因此,研究不同香芹酚乳液的流變性質(zhì)至關(guān)重要。

以50 g/L吐溫80和5 g/L SDS穩(wěn)定的香芹酚乳液的流變行為如圖3所示。通過測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),隨著剪切速率的增加,所有乳液的表觀黏度逐漸降低,表明所有體系的香芹酚乳液存在剪切變稀行為,在較高的剪切速率下,乳液內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞,乳液的表觀黏度變化逐漸平穩(wěn)。在吐溫80/SDS體系中,香芹酚乳液的表觀黏度也會隨著CES含量的增加而增大。尤其是當(dāng)CES含量由300 g/L提高到400 g/L時(shí),乳液表觀黏度急劇增加,其原因可能是香芹酚的含量較高時(shí),發(fā)生了連續(xù)相的轉(zhuǎn)變,界面面積增加,界面之間的相互作用增強(qiáng),從而導(dǎo)致乳液表觀黏度的增加[26]。因此,后續(xù)選擇表觀黏度適中、CES含量較高的香芹酚乳液T/S-300進(jìn)行研究。

圖3 香芹酚乳液的流變行為

2.4 抑菌圈大小

吐溫80體系和吐溫80/SDS體系的香芹酚乳液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈大小如表5所示。通過測量結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),所有的香芹酚乳液對4種供試菌均有良好的抑菌活性,并且香芹酚乳液的抑菌性都會隨著CES含量的增加而增強(qiáng),其原因可能是在較低的精油含量下,精油被大量的乳化劑包裹,使得香芹酚的釋放受到了限制,導(dǎo)致香芹酚乳液抑菌性的減弱[27]。

表5 香芹酚乳液對供試菌的抑菌圈大小 單位:mm

雖然2種體系的抑菌性都會隨著精油含量的增加而增強(qiáng),但是2種體系之間的抑菌性也存在一定的差異。通過比較相同CES含量下不同香芹酚乳液的抑菌圈大小,可以發(fā)現(xiàn),SDS的加入使得乳液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑菌性得以增強(qiáng)。其原因可能是SDS能夠滲透到微生物的細(xì)胞膜中,干擾與細(xì)胞膜相關(guān)的功能蛋白,導(dǎo)致微生物的細(xì)胞膜破裂和部分生物功能喪失[28]。

2.5 MIC

MIC是指抑菌劑能抑制微生物生長的最低濃度,可用來評價(jià)抑菌劑抑菌的強(qiáng)弱,數(shù)值越小,表示其抑菌性越強(qiáng)[29]。為了比較純精油和乳液的抑菌性差異,測定了香芹酚純精油和香芹酚乳液T/S-300對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的MIC,如表6所示。結(jié)果顯示,香芹酚純精油和香芹酚乳液對金黃色葡萄球菌的MIC相同,而香芹酚純精油對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的MIC分別是乳液的2、4、2倍,表明香芹酚制備成乳液后抑菌活性有了明顯的增強(qiáng)?？赡苁窍闱鄯又苽涑扇橐汉蟾纳屏司偷乃芙庑?使得乳液中的活性物質(zhì)能夠更快地與微生物細(xì)胞膜結(jié)合,從而破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞死亡[30]。PILONG等[31]也得出了相同結(jié)論,與丁香油相比,丁香油納米乳液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抗菌活性更強(qiáng)。

表6 香芹酚和香芹酚乳液對供試菌的MIC 單位:mg/mL

2.6 抗氧化活性

DPPH自由基清除能力可作為評價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的重要指標(biāo)[32]。香芹酚純精油和香芹酚乳液的DPPH自由基清除率如圖4所示。通過測定結(jié)果可以看出,香芹酚乳液的DPPH自由基清除能力明顯強(qiáng)于香芹酚純精油,在1、2、3、4、5 mg/mL的香芹酚含量下,香芹酚乳液的DPPH自由基清除率分別增強(qiáng)了12.88%、12.18%、7.13%、6.56%、7.90%,香芹酚含量較低時(shí),抗氧化活性提升更為明顯。這是由于香芹酚制備成乳液后克服了香芹酚水溶性差的缺點(diǎn),有助于充分發(fā)揮其活性作用,從而提升了香芹酚清除自由基的能力[33]。

圖4 香芹酚和香芹酚乳液的DPPH自由基清除能力

3 結(jié)論

本文使用吐溫80和SDS作為復(fù)合乳化劑進(jìn)行香芹酚乳液的制備,與單一乳化劑制備的香芹酚乳液相比,既增大了精油負(fù)載量,又減小了乳液的平均粒徑,貯藏穩(wěn)定性更好。通過流變行為的測定,發(fā)現(xiàn)吐溫80/SDS體系的香芹酚乳液當(dāng)CES含量達(dá)到400 g/L時(shí),會發(fā)生連續(xù)相的轉(zhuǎn)變,表觀黏度急劇增加。通過抑菌圈直徑測定了不同乳液的抑菌性,結(jié)果顯示,乳液的抑菌性會隨著CES含量的增大而增強(qiáng),而吐溫80/SDS體系的香芹酚乳液抑菌性更強(qiáng)。通過比較香芹酚乳液和純精油的最小抑菌濃度和抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)香芹酚乳液的抑菌性和抗氧化活性明顯強(qiáng)于香芹酚。本研究使用吐溫80和SDS復(fù)合乳化劑增大了精油負(fù)載量,并提高了香芹酚精油乳液的穩(wěn)定性和抑菌性,但目前尚未進(jìn)行抑菌機(jī)理的探究和食品保鮮的應(yīng)用,下一步將進(jìn)行抑菌機(jī)理的探究,并將乳液應(yīng)用到果蔬、谷物類、肉類等食品保鮮中。