馮志遠(yuǎn),張卓然,任杰,吳晗碩,秦慧民,劉文穎*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)

2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京,100015)

胃潰瘍消化性潰瘍是最普遍的胃腸道疾病之一,影響著社會(huì)上4%～5%的人[1]。消化道潰瘍會(huì)導(dǎo)致包括腹痛、腹脹、食欲不振、惡心嘔吐等多種癥狀產(chǎn)生。幽門螺桿菌感染、飲酒、吸煙、過度使用非甾體抗炎藥、心理和生理壓力等多種因素都會(huì)導(dǎo)致胃潰瘍[2]。急性和慢性過量飲酒均會(huì)增加消化道出血和胃潰瘍發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[3]。乙醇誘導(dǎo)胃損傷機(jī)制涉及胃氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡[4]。據(jù)報(bào)道,乙醇代謝產(chǎn)生過量活性氧引起氧化應(yīng)激,促進(jìn)胃酸與胃蛋白酶分泌,損害黏液屏障,擾亂黏膜微循環(huán)導(dǎo)致胃黏膜中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[5-6]。

自噬是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下利用溶酶體降解自身不必要或受損細(xì)胞成分的過程,對(duì)于控制細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和提供能量具有重要意義。CHANG等[7]研究發(fā)現(xiàn)乙醇可以通過下調(diào)mTOR信號(hào)通路激活自噬,并適應(yīng)性地改善乙醇誘導(dǎo)的人胃黏膜上皮細(xì)胞 (human gastric mucosal epithelial cell,GES-1)的凋亡和氧化損傷[7]。因此,細(xì)胞自噬與凋亡在改善胃黏膜損傷中起重要作用。

小麥肽是小麥蛋白的酶解產(chǎn)物,比小麥蛋白具有更高的工業(yè)應(yīng)用性和生物活性。研究表明,服用小麥肽可以通過抗氧化、抗炎和促進(jìn)GES-1的存活等機(jī)制抑制乙醇引起的胃黏膜損傷[8]。但是在乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃黏膜損傷的模型中,小麥肽對(duì)胃黏膜細(xì)胞自噬相關(guān)的機(jī)制還沒有詳細(xì)研究。因此本研究的目的是評(píng)估小麥肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)胃部病變的潛在作用,此外,研究了小麥肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃黏膜細(xì)胞自噬相關(guān)通路PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥肽,中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院;還原型谷胱甘肽(glutathione,reduced,GSH)測(cè)定試劑盒,南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、青霉素-鏈霉素溶液(100×)、CCK-8試劑盒、一氧化氮檢測(cè)試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)定試劑盒,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;4%多聚甲醛組織固定液,武漢塞維爾科技;Dulbecco′s modified eagle medium (DMEM)高糖培養(yǎng)基,Hyclone;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),GIBCO;PVDF膜,默克公司;細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔板、6孔板,康寧公司;蛋白抗體PI3K、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、IL-1β、髓過氧化物酶 (myeloperoxidase,MPO)、LC3、β-actin,Proteintech 中國(guó)公司;蛋白抗體p-PI3K,Cell Signaling Technology;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

選取60只6周齡雄性KM小鼠,體重(28±1) g,北京斯貝福生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0010]。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d,飼養(yǎng)條件:動(dòng)物房溫度(20±2) ℃,濕度(45±5)%,12 h日光燈明暗交替循環(huán),自由進(jìn)食和飲水。正式實(shí)驗(yàn)開始前將小鼠隨機(jī)分配為5組,空白組(Control),乙醇模型組(Ethanol),小麥肽低劑量組(L-WP),小麥肽中劑量組(M-WP),小麥肽高劑量組(H-WP),每組12只。根據(jù)人體動(dòng)物劑量換算公式換算,低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組每天分別灌喂小麥肽(0.3、0.6、0.9 g/kg體重),空白組和模型組每天灌喂等量去離子水。在小麥肽干預(yù)3 d后,在每天小麥肽灌胃后1 h開始慢性乙醇(40%)的攝入(7 mL/kg體重),共18 d,空白組除外,空白組給予等劑量的生理鹽水。試驗(yàn)方法根據(jù)之前的文獻(xiàn)確定,并做出了部分調(diào)整[9-10]。實(shí)驗(yàn)第21天灌喂結(jié)束后將小鼠禁食過夜,第22天使用異氟烷麻醉劑麻醉小鼠,眼球采血收集全血后脫臼斷頸處死,沿大曲度打開小鼠胃組織后置于液氮速凍或于4%多聚甲醛組織固定液中。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)倫理原則和要求。

1.2.1 胃黏膜損傷指數(shù)測(cè)定

胃黏膜損傷的嚴(yán)重程度根據(jù)先前描述的方法計(jì)算胃潰瘍指數(shù)[11]:0:無損傷;1:黏膜紅斑;2:小潰瘍(<1 mm);3:中度潰瘍(1～2 mm);4:大面積潰瘍(2～3 mm);5:超大面積潰瘍(≥3 mm)。隨后,收集胃組織并提交用于組織學(xué)檢查和生化分析。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測(cè)

取出儲(chǔ)存在-80 ℃的胃組織。將組織浸泡在試劑盒中提供的提取物中,用動(dòng)物組織勻漿器在低溫下制備成10%濃度的組織勻漿,用于后續(xù)測(cè)試。使用商業(yè)試劑盒分析組織中的MDA、GSH、NO水平和SOD酶活性,并按蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行歸一化處理。

1.2.3 胃組織病理學(xué)觀察

將固定在4%多聚甲醛中的組織標(biāo)本取出,在乙醇和二甲苯中脫水,并嵌入石蠟中。將石蠟切成5 μm厚的切片,放在涂有10%聚賴氨酸的載玻片上。帶有切片的載玻片在50 ℃下培養(yǎng)45 min,以提高組織切片對(duì)玻璃的附著力,然后用蘇木精和伊紅染色,然后用光鏡進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)分析。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

GES-1細(xì)胞購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)(北京,中國(guó))。細(xì)胞在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),溫度為37 ℃,含有5%的二氧化碳。生長(zhǎng)培養(yǎng)基為DMEM/HIGH GLUCOSE,輔以10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(體積分?jǐn)?shù))青霉素-鏈霉素溶液。

1.3.2 細(xì)胞存活率

小麥肽對(duì)GES-1細(xì)胞活力的影響是通過CCK-8方法測(cè)定的。將細(xì)胞接種在96孔板中,密度為每孔1×104,培養(yǎng)24 h。用不同質(zhì)量濃度的小麥肽(0、50、100、200、400、600、1 200、1 800 μg/mL)處理細(xì)胞24 h和乙醇(0、1%、2%、3%、4%、5%、6%,體積分?jǐn)?shù))處理細(xì)胞12 h,每個(gè)濃度設(shè)5次重復(fù)。在每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8,繼續(xù)孵化1.5 h。使用用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度,以反映細(xì)胞活力。細(xì)胞活力的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.3.3 細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)檢測(cè)

將細(xì)胞接種在6孔板中,密度為每孔1×106,待細(xì)胞完全貼壁后。用不同濃度的小麥肽預(yù)培養(yǎng)24 h后,每孔加入5%的乙醇,培養(yǎng)12 h,將GES-1細(xì)胞破碎。根據(jù)制造商的說明,使用檢測(cè)試劑盒測(cè)量細(xì)胞MDA、GSH水平和SOD酶活性。

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)

胃組織蛋白的收集。小鼠胃組織溶于RIPA裂解液并徹底均質(zhì),然后在14 000×g(5 min,4 ℃)下離心,以獲得總蛋白。使用BCA方法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。GES-1細(xì)胞蛋白收集:GES-1細(xì)胞在冰上用裂解緩沖液裂解,用BCA方法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。然后用10%的聚丙烯酰胺十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳裝載樣品,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,然后用30 mL 5%的脫脂奶粉將膜封閉2 h。之后,用TBST清洗聚偏二氟乙烯膜,在4 ℃下與第一抗體搖晃孵育過夜。用TBST清洗聚偏二氟乙烯膜,用第二抗體孵育2 h后,用強(qiáng)化化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行可視化,使用圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±SE表示。結(jié)果通過單程方差分析(ANOVA)進(jìn)行分析。使用Origin 2021(OriginLab公司,Northampton,MA,USA)進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)。P<0.05被作為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重和飼料攝入量變化

圖1-a顯示小鼠灌胃乙醇后體重變化。酒精干預(yù)顯著抑制了小鼠體重增加(P<0.05)。在小麥肽干預(yù)結(jié)束后,H-WP組的小鼠體重顯著高于乙醇模型組(P<0.05)。由圖1-b中小鼠飼料攝入量變化發(fā)現(xiàn),乙醇處理后各組小鼠飼料攝入量不存在顯著差異。由圖1-c損傷指數(shù)評(píng)分可以看出,用0.3、0.6、0.9 g/kg小麥肽處理的小鼠胃損傷指數(shù)為15.01、14.30、11.67,小麥肽能夠以劑量依賴的方式顯著降低胃黏膜損傷(P<0.05)。這些結(jié)果表明小麥肽可有效降低乙醇給藥引起的胃損傷的嚴(yán)重程度。

a-21 d小鼠體重變化;b-小鼠飼料攝入量變化;c-小鼠胃組織損傷指數(shù)

2.2 小麥肽對(duì)乙醇處理小鼠胃組織MDA、SOD、GSH和NO水平的影響

小麥肽預(yù)處理對(duì)氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響如圖2所示,數(shù)據(jù)表明,乙醇攝入導(dǎo)致氧化應(yīng)激加重,脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增加。與對(duì)照組相比,乙醇模型組,MDA水平顯著升高108%(P<0.05),SOD活性和GSH含量顯著降低37.82%和46.29%(P<0.05)。小麥肽預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了乙醇處理導(dǎo)致的胃組織抗氧化能力抑制作用,與模型組相比,小麥肽預(yù)處理顯著提高了H-WP組內(nèi)SOD活性(42.29%)和GSH含量(67.59%),以及M-WP組內(nèi)GSH含量(73.32%)(P<0.05)。小麥肽預(yù)處理顯著降低了H-WP與M-WP組內(nèi)MDA水平(P<0.05),H-WP組MDA含量降低至空白組水平。NO含量在乙醇處理后顯著升高(P<0.05),中、高劑量中小鼠胃組織內(nèi)NO含量顯著降低(P<0.05)。這些結(jié)果表明乙醇誘導(dǎo)了胃內(nèi)氧化應(yīng)激發(fā)生,小麥肽組胃組織內(nèi)MDA和NO含量顯著降低,SOD活性與GSH含量顯著提高,說明小麥肽具有良好的抗氧化活性,減輕由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胃潰瘍。

a-MDA;b-SOD;c-GSH;d-NO

2.3 組織學(xué)檢查

空白對(duì)照組胃組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整,胃腺組織清晰可見,細(xì)胞排列緊密,沒有明顯組織損傷(圖3-a)。模型組胃組織出現(xiàn)明顯胃黏膜上皮黏膜損傷嚴(yán)重,固有層糜爛嚴(yán)重,腺體排列紊亂,上皮組織受到嚴(yán)重破壞(圖3-b)。小麥肽預(yù)處理對(duì)胃黏膜具有保護(hù)作用,其中0.3 g/kg小麥肽處理后,小鼠胃組織上皮細(xì)胞脫落減少,胃黏膜固有層糜爛減輕,胃組織損傷較為嚴(yán)重(圖3-c)。0.6 g/kg組小鼠胃組織上皮細(xì)胞脫落減少,部分位置存在輕微糜爛,腺體排列整齊,胃組織黏膜損傷減輕。0.9 g/kg的小麥肽預(yù)處理對(duì)胃組織潰瘍具有顯著改善作用,腺體結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞排列完整,局部存在細(xì)胞脫落(圖3-d和圖3-e)。

a-對(duì)照;b-乙醇;c-L-WP;d-M-WP;e-H-WP

2.4 小麥肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)胃組織炎癥的影響

炎癥是乙醇誘導(dǎo)胃黏膜損傷的重要因素,我們檢測(cè)了乙醇誘導(dǎo)小鼠胃黏膜損傷后,胃組織中炎癥相關(guān)蛋白IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO的相對(duì)表達(dá)變化(圖4)。乙醇處理后,模型組中促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)與MPO蛋白表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。小麥肽預(yù)處理抑制了乙醇誘導(dǎo)胃組織炎癥,3個(gè)小麥肽組中IL-1β、TNF-α與MPO表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。炎癥因子IL-6在中、高劑量小麥肽處理后顯著降低。因此,小麥肽可能通過降低乙醇誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)改善胃黏膜損傷。

a-組織中炎癥因子相對(duì)表達(dá)量;b-IL-1β;c-MPO;d-TNF-α;e-IL-6

2.5 小麥肽對(duì)GES-1存活率的影響

實(shí)驗(yàn)使用CCK-8法評(píng)估小麥肽與乙醇對(duì)GES-1細(xì)胞的毒性作用。如圖5所示,通過添加不同濃度的乙醇,選擇適合的乙醇濃度建立細(xì)胞損傷模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到5%時(shí),GES-1細(xì)胞活力顯著下降(圖5-a),因此,實(shí)驗(yàn)添加5%濃度乙醇以建立細(xì)胞損傷模型。用依次增加濃度的小麥肽處理細(xì)胞24 h,CCK-8結(jié)果顯示,孵育24 h后,200 μg/mL及以上的小麥肽處理顯著增加了GES-1細(xì)胞存活率,質(zhì)量濃度為50、100 μg/mL的小麥肽對(duì)GES-1細(xì)胞活力無顯著影響(P>0.05)。在細(xì)胞部分實(shí)驗(yàn)中,我們確定3個(gè)濃度小麥肽(50、100、200 μg/mL)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖5-b)。

為驗(yàn)證小麥肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了使用小麥肽預(yù)處理后,乙醇對(duì)GES-1細(xì)胞存活率影響,結(jié)果如圖5-c所示,小麥肽處理顯著改善了乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞活性降低(P<0.05)。這表明小麥肽添加對(duì)乙醇導(dǎo)致的GES-1細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

a-乙醇對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響;b-小麥肽對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響;c-小麥肽預(yù)處理后5%乙醇對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響

2.6 小麥肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)GES-1抗氧化能力的影響

與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了GES-1細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力與GSH、MDA 含量。如圖6所示,與空白對(duì)照組相比,乙醇模型組MDA含量顯著升高(P<0.05),SOD酶活力與GSH含量顯著降低(P<0.05)。不同濃度的小麥肽處理顯著抑制了細(xì)胞中MDA含量升高,SOD酶活力和GSH含量顯著升高。因此,小麥肽能夠有效改善乙醇誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

a-MDA;b-SOD;c-GSH

2.7 小麥肽通過PI3K/AKT/Mtor通過激活減輕乙醇誘導(dǎo)胃黏膜上皮損傷

PI3K/AKT/mTOR級(jí)聯(lián)參與自噬過程的調(diào)節(jié)已通過多種胃病理學(xué)模型的不斷發(fā)展的研究得到證實(shí)。為探究小麥肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)胃損傷模型中的自噬相關(guān)過程調(diào)節(jié)作用,實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達(dá)相對(duì)變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組相比,乙醇添加激活了PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 顯著提高(圖7-a)。小麥肽逆轉(zhuǎn)了乙醇對(duì)PI3K/AKT/mTOR通路激活的激活作用,相對(duì)于乙醇模型組,小麥肽p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR顯著降低。LC3-Ⅱ水平對(duì)應(yīng)自噬水平,因此,我們通過Western Blot檢測(cè)LC3-Ⅱ表達(dá)量來分析細(xì)胞自噬發(fā)生水平。結(jié)果如圖7-b所示,中、高劑量的小麥肽預(yù)處理組中自噬調(diào)控核心蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。

a-PI3K/AKT/mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量;b-LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量;c-PI3K;d-AKT;e-mTOR;f-LC3-Ⅱ

3 結(jié)論

酒精是導(dǎo)致胃黏膜上皮損傷甚至胃潰瘍的主要外源因素之一,在之前的研究中,酒精可以通過抑制胃細(xì)胞自噬反應(yīng)加劇胃黏膜上皮損傷[7]。小麥肽已被證明具有抗炎、抗氧化特性[12]。本研究的主要發(fā)現(xiàn)是小麥肽可以通過減輕乙醇抑制胃組織細(xì)胞自噬反應(yīng)改善胃黏膜損傷。目前研究中,小麥肽在體內(nèi)研究中改善了乙醇誘導(dǎo)的胃組織損傷,降低了組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和促炎因子的表達(dá)。在體外模型中,小麥肽同樣具有較好的抗氧化能力,同時(shí)可以抑制PI3K/AKT/mTOR 通路,提高LC3-Ⅱ蛋白表達(dá),研究結(jié)果表明,細(xì)胞自噬反應(yīng)可能是小麥肽改善胃黏膜屏障損傷的潛在機(jī)制。

乙醇在胃中被吸收時(shí),胃中存在的酒精脫氫酶會(huì)催化乙醇產(chǎn)生乙醛,而胃中存在的黃嘌呤氧化酶會(huì)催化乙醛的代謝,產(chǎn)生自由基[13],這在酒精誘導(dǎo)胃黏膜損傷中發(fā)揮重要作用。當(dāng)活性氧代謝物過量產(chǎn)生超過內(nèi)源性保護(hù)因素(如SOD和GSH)時(shí),會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化發(fā)生,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能喪失和改變,破壞膜組織。小麥肽是一種抗氧化肽,可以通過增強(qiáng)抗氧化酶活力,清除氧化自由基,抑制脂質(zhì)過氧化發(fā)生;此外,小麥肽還具有亞鐵離子螯合能力,調(diào)節(jié)NF-κB和NRF2相關(guān)通路改善細(xì)胞氧化損傷。在本實(shí)驗(yàn)中,小麥肽預(yù)處理顯著提高了體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞內(nèi)SOD活力和GSH水平,抑制了乙醇誘導(dǎo)的NO含量增加。上述結(jié)果表明,小麥肽可以通過增強(qiáng)抗氧化能力和降低NO含量保護(hù)乙醇造成的胃黏膜損傷。

氧化應(yīng)激與炎癥存在于多種消化道疾病中,氧化應(yīng)激會(huì)引起細(xì)胞蛋白和DNA損傷、脂質(zhì)過氧化發(fā)生,破壞胃黏膜屏障功能,通透性增加,導(dǎo)致有害物質(zhì)轉(zhuǎn)移,誘發(fā)炎癥產(chǎn)生[10,14-15],此外,活性氧還會(huì)誘導(dǎo)NF-κB與MAPK通路激活,誘導(dǎo)破壞性炎癥的產(chǎn)生[16]。因此,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了小麥肽對(duì)炎癥因子和中性粒浸潤(rùn)標(biāo)志MPO的表達(dá)的影響[17-18]。中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)在損傷和炎癥過程中起著至關(guān)重要的作用,它在各種組織中聚集和釋放組織破壞物質(zhì),包括胃黏膜病變[19]。在本研究中,觀察到乙醇處理小鼠胃內(nèi)MPO表達(dá)量顯著升高,小麥肽降低了胃內(nèi)MPO蛋白相對(duì)表達(dá)水平。抑制中性粒細(xì)胞滲入是一種重要的抗炎機(jī)制,小麥肽可以通過減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),改善胃黏膜損傷。此外,小麥肽預(yù)處理可以明顯抑制IL-1β等促炎因子的產(chǎn)生,減輕胃部炎癥的發(fā)生。這些結(jié)果與之前的研究一致[20]。

自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、進(jìn)化上保守的過程,在不利條件被激活,以維持蛋白質(zhì)的新陳代謝和分解代謝之間的平衡,以及細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。LC3-Ⅱ被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物的自噬體標(biāo)記,并且LC3-Ⅱ的含量總是與自噬體的數(shù)量成正比[21-22]。阿司匹林和乙醇處理都被發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)mTOR信號(hào)減少自噬誘發(fā)的GES-1的凋亡和組織損傷[7]。在本實(shí)驗(yàn)中,乙醇誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞中LC3-II蛋白水平下降證明了細(xì)胞自噬受損。通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),乙醇對(duì)自噬的抑制作用是由PI3K/AKT/mTOR途徑激活介導(dǎo)的,在乙醇處理后,GES-1細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化增加,通路被激活,自噬受到抑制。小麥肽處理改善了乙醇對(duì)自噬抑制作用,抑制PI3K/AKT/mTOR通路激活,并顯著增加了LC3-II蛋白表達(dá)量。這些結(jié)果表明,小麥肽可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬作用,減輕乙醇對(duì)胃黏膜的損傷,但目前的研究還不夠完善,小麥肽調(diào)節(jié)自噬的作用和機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)研究了小麥肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)胃黏膜損傷的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,小麥肽有效改善乙醇誘導(dǎo)的小鼠體重減輕,減少胃黏膜組織損傷,通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小麥肽可以通過提高抗氧化能力,降低乙醇引起的組織內(nèi)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化水平升高。此外,小麥肽預(yù)處理抑制了乙醇導(dǎo)致的組織內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集和促炎因子表達(dá)。通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),小麥肽通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路,驅(qū)動(dòng)自噬過程。目前,本實(shí)驗(yàn)對(duì)小麥肽通過激活自噬調(diào)節(jié)乙醇性胃損傷研究還不夠全面,需要進(jìn)一步研究小麥肽對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)作用對(duì)自噬的影響,全面了解小麥肽對(duì)自噬調(diào)控機(jī)制和胃組織保護(hù)作用,這對(duì)開發(fā)小麥肽作為一種天然膳食補(bǔ)充劑輔助治療酒精性胃炎具有重要意義。