馬 濤， 毛紅燕， 石太淵， 張睿

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品與加工研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

遼五味子黃酮純化及定性光譜分析

馬 濤1，2， 毛紅燕2， 石太淵1， 張睿1

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品與加工研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

選用4種大孔樹(shù)脂對(duì)遼五味子黃酮進(jìn)行了靜態(tài)吸附與解吸附試驗(yàn)。結(jié)果表明，HZ－818型樹(shù)脂對(duì)黃酮的吸附率可達(dá)76.24%，解吸率達(dá)到67.30%，與其他4種型號(hào)樹(shù)脂相比最適宜于遼五味子黃酮的分離純化。通過(guò)對(duì)HZ－818樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)，確定黃酮加樣質(zhì)量濃度為1.6 mg／m L時(shí)，上樣體積為65 m L，上樣流量1 m L／min，洗脫流量1.5 m L／min，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液用量為110 m L，可達(dá)到較好的洗脫效果，洗脫率可達(dá)到79.57%。提取物經(jīng)光譜分析，證實(shí)為黃酮類(lèi)化合物。

遼五味子；黃酮；大孔吸附樹(shù)脂；光譜分析

遼五味子（LiaoSchisandrachinensis），木蘭科植物也稱(chēng)為“北五味子”，主產(chǎn)地為我國(guó)遼寧省，是藥食同源功能性保健食品［1］。目前，我國(guó)對(duì)遼五味子的化學(xué)成分研究比較深入，已報(bào)道的有木脂素、三萜、倍半萜、有機(jī)酸、揮發(fā)油及多糖等成分［2－4］。但是，關(guān)于遼五味子含黃酮的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

大孔吸附樹(shù)脂是一類(lèi)吸附分離材料，由于其自身具有多孔結(jié)構(gòu)，可根據(jù)空隙大小對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行機(jī)械篩分，同時(shí)又帶有極性基團(tuán)，可通過(guò)范德華力和形成氫鍵對(duì)極性相近的化學(xué)成分進(jìn)行選擇性吸附［5］。它不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑且有較好吸附性能的有機(jī)高聚物吸附劑，近年來(lái)逐漸被應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的提取、分離、純化和中藥新藥的開(kāi)發(fā)研制［6－7］。為更好地開(kāi)發(fā)利用遼五味子黃酮類(lèi)物質(zhì)，作者采用大孔樹(shù)脂對(duì)遼五味子黃酮進(jìn)行純化及定性分析，為遼五味子的合理利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料遼五味子：購(gòu)于遼寧省桓仁縣；試驗(yàn)用水均為蒸餾水；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；AB－8、HZ－818、NKA－9、D－101大孔吸附樹(shù)脂：安徽三星樹(shù)脂有限公司產(chǎn)品；亞硝酸鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、石油醚（60～90℃）：均為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)儀器DHL－A電腦恒流泵：上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；DBS－160電腦全自動(dòng)部分收集器：上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；DZF－6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；JY92－Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；XA－1型固體樣品粉碎機(jī)：河南省鞏義市光壓儀器廠產(chǎn)品；7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）有限公司產(chǎn)品；TDL－5000B型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；Avatar 330傅立葉紅外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Nicolet公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 遼五味子黃酮的提取遼五味子果實(shí)→低溫下烘干（50℃）→粉碎機(jī)粉碎→過(guò)篩→按1 g∶25 m L的料液質(zhì)量體積比加體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶劑浸潤(rùn)→超聲處理（300 W，15 min）→離心→提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去乙醇，濃縮→石油醚脫脂→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去石油醚→待純化黃酮液

1.2.2 黃酮含量測(cè)定AlCl3比色法［8］。

1.2.3 樹(shù)脂的預(yù)處理與再生用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡48 h，充分溶脹后用蒸餾水洗至無(wú)醇，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%氫氧化鈉溶液浸泡12 h，蒸餾水洗至中性，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%鹽酸溶液浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性，備用。

1.2.4 靜態(tài)試驗(yàn)

1）靜態(tài)吸附量考察［9］用濾紙吸干預(yù)處理好的樹(shù)脂表面的水分后，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g，置于250 m L具塞磨口三角瓶中，加入黃酮質(zhì)量濃度為1.6 mg／m L的遼五味子黃酮的待純化液30 m L，25℃下，置于搖床（150 r／min）振蕩12 h，然后靜置12 h使其充分吸附，平行3份，測(cè)定此時(shí)溶液中的總黃酮的含量，按照下式計(jì)算吸附量（Q）、吸附率（A）。

式中：Q為吸附量（mg／g）；C0為起始質(zhì)量濃度（mg／m L）；Cr為剩余質(zhì)量濃度（mg／m L）；V為溶液體積（m L）；W為樹(shù)脂質(zhì)量（g）；A為吸附率。

2）靜態(tài)解吸性能考察 將上述已吸附飽和的大孔吸附樹(shù)脂濾出，用濾紙吸干藥液 （用蒸餾水清洗至樹(shù)脂表面無(wú)黃酮溶液殘留），置于250 mL錐形瓶中，精確加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇30 mL，置于搖床（150 r／min）振蕩12 h，然后靜置12 h，濾液進(jìn)行含量測(cè)定，平行3份，測(cè)出吸收度值并計(jì)算靜態(tài)解吸附率。

式中：D為解吸率；Q為吸附量（mg／g）；Cr為解吸后溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度（mg／m L）；W為樹(shù)脂干重（g）。

3）靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線的繪制 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g預(yù)處理好的樹(shù)脂，置于250 m L三角瓶中，各加入30 m L遼五味子黃酮待純化液（黃酮質(zhì)量濃度為1.6 mg／m L），25℃下振搖（150 r／min）12 h，每隔1 h移取0.1 m L上清液，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇定容至10 m L，測(cè)定其黃酮含量，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.5 動(dòng)態(tài)試驗(yàn)通過(guò)靜態(tài)試驗(yàn)，選擇出一種較優(yōu)的樹(shù)脂，對(duì)上樣量、上樣流速、洗脫液濃度、解析流速、洗脫體積進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。將預(yù)處理好的樹(shù)脂濕法裝入（D1.6 cm×30 cm）玻璃層析柱中，大孔吸附樹(shù)脂充分自然沉降，使填裝高度為柱高的2／3。將黃酮提取液上柱，待樣品溶液全部通過(guò)樹(shù)脂柱后用4BV的去離子水洗至流出液無(wú)色，用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇以一定洗脫速度洗脫，收集洗脫液。通過(guò)測(cè)定總黃酮含量考察各因素對(duì)樹(shù)脂吸附性能的影響，確定最佳吸附工藝條件。

1.2.6 定性光譜分析

1）紫外測(cè)定 分光光度計(jì)法：亞硝酸鈉，硝酸鋁顯色法。

2）紅外測(cè)定 KBr壓片法。

2 結(jié)果與分析

2.1 遼五味子黃酮的純化

2.1.1 大孔吸附樹(shù)脂的選擇4種大孔樹(shù)脂預(yù)處理后，對(duì)遼五味子黃酮的靜態(tài)吸附及解析實(shí)驗(yàn)，測(cè)得各種樹(shù)脂對(duì)黃酮的吸附與解吸結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，樹(shù)脂 HZ－818吸附黃酮效果最好，其次是NKA－9樹(shù)脂，黃酮吸附量都在35 mg／g以上。每種樹(shù)脂對(duì)黃酮的解吸結(jié)果分析表明，HZ－818樹(shù)脂的黃酮解吸率較大，而NKA－9雖然吸附率較大，但是解吸較困難。

表1 不同樹(shù)脂對(duì)五味子黃酮的吸附與解吸結(jié)果Tab.1 Adsorption capabilities and desorption rates of Liao Schisandra chinensis（Turcz.）Baill flavones

僅用樹(shù)脂的平衡吸附量和解吸率來(lái)評(píng)價(jià)其吸附性能是不全面的，合適的樹(shù)脂不僅要具有較大的吸附量、良好的解吸率，同時(shí)應(yīng)具有較快的吸附速率，所以我們又研究了其靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特征。圖1為3種樹(shù)脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

圖1 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Static－adsorption dynamic curve of macroporous resins

由圖1可知，HZ－818樹(shù)脂對(duì)遼五味子黃酮的吸附為快速平衡型，起始階段吸附量較大，5 h已基本接近吸附平衡，而NKA－9種樹(shù)脂起始吸附量雖較大，但到達(dá)平衡的時(shí)間較長(zhǎng)，10 h后才基本接近吸附平衡，D－101樹(shù)脂吸附量相對(duì)較少。結(jié)合樹(shù)脂對(duì)遼五味子黃酮的吸附與解吸附效果，選擇HZ－818樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。

2.1.2 動(dòng)態(tài)吸附－解析試驗(yàn)結(jié)果

1）上樣流量及上樣量的確定 通過(guò)調(diào)節(jié)恒流泵的流量對(duì)上柱樣液進(jìn)行吸附流量的選擇，以泄漏點(diǎn)最遲出現(xiàn)的吸附流量為宜［10］。

圖2 吸附流量與吸光度關(guān)系圖Fig.2 Relationship between adsorption velocity and absorbance

在上樣質(zhì)量濃度均為1.591 mg／m L，樣液體積均為80 m L的條件下，控制流量分別進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。5種吸附流速下的泄漏情況如圖2所示。由計(jì)算可知，流量為0.5、1、1.5、2.0、2.5 m L／min時(shí)，泄漏點(diǎn)依次為71，67，50，43，40 m L。流量為0.5 m L／min時(shí)，雖然滲漏點(diǎn)出現(xiàn)的最遲，但因?yàn)榱魉俾瑢?dǎo)致循環(huán)周期延長(zhǎng)，工作效率低。而進(jìn)樣速度為1 m L／min時(shí)，泄漏點(diǎn)盡管出現(xiàn)得稍早，但工作效率高于0.5 m L／min。其它條件下泄漏點(diǎn)出現(xiàn)的太早，吸附效率低，而且在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，速度過(guò)快容易導(dǎo)致進(jìn)樣管堵塞。因此上樣流量定為1 m L／min，上樣量為65 m L。

2）洗脫液體積分?jǐn)?shù)的確定 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性不同，對(duì)黃酮的洗脫能力也不同。取已處理好的大孔吸附樹(shù)脂柱，將待純化液以1 m L／min流速上樣，上樣量為65 m L。用5 BV蒸餾水洗脫，除去蛋白質(zhì)和多糖，然后依次用6 BV體積分?jǐn)?shù)10%、30%、50%、70%和90%的乙醇梯度洗脫，流量定為2 m L／min，測(cè)定各部分洗脫液中總黃酮的含量，計(jì)算各部分解吸率。結(jié)果如圖3所示，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫時(shí)不僅能將大部分黃酮洗脫下來(lái)，而且最節(jié)省乙醇用量。

圖3 不同洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮純化的影響Fig.3 Effect of the concentration of ethanol on Purifieation

3）洗脫液流量的影響 洗脫液流量直接影響大孔吸附樹(shù)脂對(duì)總黃酮的洗脫效果。流量過(guò)大容易形成拖尾現(xiàn)象且洗脫不徹底，過(guò)小則生產(chǎn)周期明顯延長(zhǎng)，成本增加。試驗(yàn)采用吸附黃酮后的樹(shù)脂柱以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇為洗脫液，洗脫流量分別對(duì)應(yīng)0.5、1、1.5、2.0、2.5 m L／min。對(duì)解析效果作比較，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同解吸流量與吸光度的關(guān)系Fig.4 Relationship between desorption velocity and absorbance

由圖4可以看出，以1.5 m L／min的流量進(jìn)行洗脫得到的峰形沒(méi)有明顯拖尾現(xiàn)象，洗脫時(shí)間最短，效率最高，而2.0 m L／min和2.5 m L／min的洗脫峰比1.5 m L／min的峰形寬且拖尾比較嚴(yán)重，表明洗脫不徹底，效率較低。1.0 m L／min雖然洗脫率于1.5 m L／min時(shí)相當(dāng)，但是洗脫時(shí)的峰拖尾嚴(yán)重，洗脫時(shí)間明顯延長(zhǎng)，效率低下，不利于生產(chǎn)。因此選擇解析流量為1.5 m L／min為宜。

4）洗脫液用量的確定 吸附黃酮后的樹(shù)脂柱以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇為洗脫液，洗脫流量控制為1.5 m L／min。用部分收集器收集洗脫液，6 m L／管，測(cè)定其吸光度，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同洗脫劑用量對(duì)異黃酮純化的影響Fig.5 Effect of the dosage of ethanol on Purification

由圖5可知，隨著洗脫液用量的增加，洗脫液中黃酮質(zhì)量濃度逐漸增加，第10管洗脫液中黃酮質(zhì)量濃度最高。隨著洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)，隨后各部分洗脫液中異黃酮質(zhì)量濃度逐漸減少，至第19管時(shí)幾乎沒(méi)有所要的黃酮成分可以洗脫下來(lái)。因此，大孔吸附樹(shù)脂的乙醇洗脫量為110 m L。

2.2 定性光譜分析

2.2.1 遼五味子黃酮的紫外—可見(jiàn)光譜分析遼五味 子 黃 酮 提 取 物 加 入 Na N02、Al（NO3）3和NaOH顯色處理后，經(jīng)過(guò)紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描得到圖譜6。由圖可知，紫外—可見(jiàn)光譜中有兩個(gè)主要的吸收峰組成，其中之一出現(xiàn)在430～450 nm（峰帶Ⅱ），另一個(gè)在490～500 nm（峰帶Ⅰ）。一般來(lái)說(shuō)，峰帶Ⅱ是苯甲?；鸬模鍘Б袷怯晒鹌；到y(tǒng)引起。

圖6 紫外—可見(jiàn)光譜Fig.6 UV－visible spectrum

2.2.2 遼五味子黃酮的紅外分析取經(jīng)過(guò)干燥的遼五味子黃酮樣品1 g，與100～200 mg經(jīng)干燥的KBr粉末在紅外燈下，于瑪瑙研缽研磨均勻，壓成薄片，進(jìn)行紅外光譜測(cè)定［11］，結(jié)果如圖6所示。由圖可見(jiàn)，波數(shù)3 415.76 cm－1為黃酮類(lèi)化合物的羥基吸收峰；2 935.61 cm－1分子中飽和碳?xì)渖炜s振動(dòng)產(chǎn)生；波數(shù)1 735.17 cm－1的吸收峰是由C＝O引起。1 518.48 cm－1為芳環(huán)振動(dòng)吸收引起；圖中1 074.21 cm－1為烷烴吸收峰；綜上所述，推測(cè)提取物為多羥基黃酮類(lèi)物質(zhì)。

圖7 黃酮的紅外光譜圖Fig.7 IR－spectrum of Ampelopsis gross edentate flavones

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)所選4種樹(shù)脂遼五味子黃酮的吸附與解吸性能的研究，篩選出HZ－818樹(shù)脂為理想的分離純化的樹(shù)脂，其吸附率為76.24%，解吸率為67.30%。

HZ－818樹(shù)脂對(duì)遼五味子黃酮吸附分離的最佳工藝參數(shù)為：上柱量為65 m L，上柱流量1 m L／min，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為洗脫液控制洗脫液流量1.5 m L／min，洗脫液用量為110 m L。純化物經(jīng)光譜分析表明是多羥基黃酮類(lèi)化合物。

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Separation Purification and Spectrum of Flavonoids from LiaoSchisandrachinensis

MATao1，2，MAOHong－yan2，SHITai－yan1，ZHANGRui1

（1.Food Processing Institute，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang 110161，China 2.School of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China）

This manuscript select four different macroporous resins that were used to static adsorption and desorption attached experiment for flavonoids of LiaoSchisandra chinensis（Turcz.）Baill.Among them，the highest adsorption capability of 76.24%and desorption rate of 67.30%were achieved at macroporous resin HZ－818 and was chosen.By using resin HZ－818，the optimum process conditions was determined and listed as follows：sample concentration 1.6 mg／m L，the sample size 65ml，and sample flow rate 1mg／min；70%ethanol as eluent at 1.5 m L／min，and eluent dosage for 110 m L.Under the optimum conditions，the elution ratio of flavones achieved at 79.57%.

LiaoSchisandrachinensis，favones，macroporous adsorption resin，spectral analysis

Q 657.32

A

1673－1689（2012）01－0101－05

2011－01－13

馬濤（1962－），男，新疆喀什人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事糧油食品儲(chǔ)藏保鮮與深加工研究。Email：matao－09＠163.com