任振華，王佳茵，王淑艷，張 穎，鄒春林，張 愚*

(1首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞生物室，北京100053;2安徽醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，合肥230032)

慢病毒介導(dǎo)GDNF基因?qū)κ承泛锕撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

任振華1，2，王佳茵1，王淑艷1，張 穎1，鄒春林1，張 愚1*

(1首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞生物室，北京100053;2安徽醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，合肥230032)

目的 探討慢病毒介導(dǎo)膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)對食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(cMSCs)生物學(xué)特性的影響。方法 無菌條件下取食蟹猴骨髓，梯度密度離心法分離培養(yǎng)cMSCs，以含有GDNF基因的慢病毒感染cMSCs。利用ELISA、Real-time PCR、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、BrdU摻入法等實(shí)驗(yàn)方法，觀察慢病毒感染后GDNF基因的表達(dá)，以及慢病毒感染前后的cMSCs的表面抗原表達(dá)、體外增殖和分化能力。結(jié)果 感染慢病毒后，體外培養(yǎng)的cMSCs高表達(dá)GDNF。慢病毒感染后cMSCs的細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD90和Stro-1陽性細(xì)胞比例增高。BrdU摻入結(jié)果顯示，與對照組(0.61±0.11)比較，GDNF慢病毒感染組(0.50±0.13)明顯降低(P＜0.05)。但GDNF慢病毒感染并沒有影響cMSCs體外脂肪誘導(dǎo)分化能力。結(jié)論 慢病毒感染影響cMSCs的表面抗原表達(dá)和體外增殖能力，但對cMSCs體外脂肪分化能力無影響。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;慢病毒;細(xì)胞增殖;細(xì)胞分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種異質(zhì)的成體干細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成成脂肪、骨及軟骨細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療和組織工程［1－2］。同時(shí)，MSCs容易通過各種載體進(jìn)行基因修飾，應(yīng)用于基因治療［3］。另一方面，因MSCs的低免疫原性，在移植治療中扮演免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)作用［4］。事實(shí)上，MSCs早已被認(rèn)為是干細(xì)胞移植中最有希望的靶細(xì)胞，近來成為關(guān)注的熱點(diǎn)。

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)對多巴胺能神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元及腸道神經(jīng)元等多種神經(jīng)元均具有促存活及損傷保護(hù)作用，因此，極有希望用于神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的治療［5］。GDNF作為一種大分子的蛋白質(zhì)難以通過血腦屏障，使其實(shí)際應(yīng)用于臨床的研究一直沒有取得突破性的進(jìn)展。以MSCs為載體，慢病毒感染GDNF基因，構(gòu)建基因工程細(xì)胞，使其成為分泌GDNF的細(xì)胞生物泵，為GDNF基因修飾的干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了可能［6］。本研究通過GDNF慢病毒載體感染食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(cynomolgus monkey mesenchymal stem cells，cMSCs)，在體外培養(yǎng)條件下，測定其GDNF基因和蛋白表達(dá)水平。同時(shí)鑒于外源性基因修飾可能對細(xì)胞帶來的影響，對比感染GDNF慢病毒前后cMSCs生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:3只3～4歲健康成年食蟹猴，猴泡沫病毒(Simian foamy viruse，SFV)檢測陰性［7］，由廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司提供，動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)按照國際AAALAC靈長類動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物病原體檢疫和生物安全檢驗(yàn)合格。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:Alpha-MEM、青鏈霉素、GlutaMAXTM-I Supplement、0.25%Trysin-EDTA、反轉(zhuǎn)錄酶SSⅡ和Trizol(Invitrogen公司);MSC Qualified FBS(Gibco公司);Ficoll-Paque TM Plus單核細(xì)胞分離液(StemCell公司);rTaq酶(TaKaRa公司);DNA mini kit(Qiagen公司);引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。FITC-CD106、PE-CD73、FITC-CD90、Percp-CD14、APC-CD34、Percp-CD45、FITC-CD19 和FITC-HLA-DR(Pharmingen公司);FITC-CD105(Serotec公司);PE-STRO-1(Santa Cruz公司)。MSCs分化試劑(Lonza Walkersville公司);油紅 O、番紅O、核固紅、核固綠、BrdU及其抗體、衰老細(xì)胞組織化學(xué)染色試劑盒(Sigma-Aldrich公司)。GDNF的ELISA檢測試劑盒(Promega公司);端粒酶ELISA檢測試劑盒(Roche公司);病毒包裝293T細(xì)胞由北京大學(xué)生命科學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DUET101-GDNF和DUET101-GFP、包裝質(zhì)粒CMV△8.91和PMD.G由美國Johns Hopkins大學(xué)程臨釗教授惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 cMSCs體外培養(yǎng)及慢病毒感染:cMSCs原代培養(yǎng)見文獻(xiàn)［8］，第2～4代 cMSCs以2×104細(xì)胞/cm2密度種植在Alpha-MEM培養(yǎng)基，包含10%FBS、1%青鏈霉素、1%GlutaMAX，5%CO2、37 ℃孵箱培養(yǎng)，持續(xù)傳代培養(yǎng)。cMSCs感染慢病毒方法見文獻(xiàn)［7］，簡略如下，細(xì)胞培養(yǎng)24 h，等到細(xì)胞長滿70%，更換新鮮培養(yǎng)基，根據(jù)GDNF慢病毒滴度和細(xì)胞數(shù)量，按拷貝數(shù)10加入病毒上清。孵育20 h后棄去轉(zhuǎn)染液，加入新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增。cMSCs感染GFP慢病毒作為空載慢病毒對照。

1.2.2 慢病毒感染前后GDNF蛋白及基因表達(dá):以2×105個(gè)/mL的濃度接種于6孔板中，48 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)基上清，采用ELISA方法測定GDNF分泌量，具體操作參照試劑盒步驟進(jìn)行，以1×106個(gè)細(xì)胞為單位，每組重復(fù)接種3孔。用 Trizol提取慢病毒感染前后 cMSCs的mRNA，以隨機(jī)引物將mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。用RT-PCR和Real-time PCR檢測GDNF基因表達(dá)。人GDNF擴(kuò)增引物為:上游，5'-ACTGACTTGGGTCTGG GCTATG-3';下游，5'-TTTGTCACTCACCAGCCTTCTA TTT-3'，擴(kuò)增片段大小為138 bp。食蟹猴GAPDH為內(nèi)參，擴(kuò)增引物為:上游，5'-ATGACATCAAGAAGGT GGTG-3';下游，5'-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3'，擴(kuò)增片段大小為177 bp。食蟹猴β-actin擴(kuò)增引物為:上游，5'-TCACCACCACGGCCGAGCG-3';下游，5'-TCTCCTTCTG CATCCTGTCG-3'，擴(kuò)增片段大小為350 bp。

1.2.3 cMSCs表面標(biāo)志:分別收集慢病毒感染前后的cMSCs，PBS洗滌2次，重懸在包含1%BSA的PBS，分別加入PE或FITC標(biāo)記的單抗CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD106、Stro-1 和HLA-DR熒光抗體(表1)，4℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測，Win MDI 2.9軟件分析結(jié)果。

1.2.4 cMSCs增殖:cMSCs以2×104細(xì)胞/cm2密度種植，培養(yǎng)24 h后，加入10 μmol/L的 BrdU，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，2N鹽酸作用40 min，血清封閉后加入小鼠抗BrdU抗體，4℃過夜，室溫復(fù)溫后加入羅丹明標(biāo)記的熒光二抗，DAPI復(fù)染后鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算BrdU標(biāo)記指數(shù)。

1.2.5 cMSCs分化:按照cMSCs分化試劑操作步驟(http://www．lonza．com)，參考文獻(xiàn)［8］，感染慢病毒前后的cMSCs體外誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞。步驟簡略如下，cMSCs以2.1×104細(xì)胞/cm2密度種植，細(xì)胞達(dá)到100%匯合后，加入誘導(dǎo)/維持培養(yǎng)基，培養(yǎng)3個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)5～6 d，之后繼續(xù)在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7 d。福爾馬林固定，油紅O染色。為了定量檢測脂肪分化，油紅O染色后，加入100%異丙醇抽提，分光光度計(jì)510 nm檢測提取液吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組之間的差異用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染后GDNF基因及蛋白表達(dá)

慢病毒感染組表達(dá) GDNF(圖1A)。感染組GDNF基因mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組和空載組(P＜0.01)(圖1B)。細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA測定結(jié)果顯示，與對照組比較，感染組GDNF分泌量明顯增高(P＜0.01)(圖2)。樣本n=3，每個(gè)樣本重復(fù)檢測3次。

2.2 慢病毒感染對cMSCs表面標(biāo)志的影響

cMSCs高水平表達(dá)CD73、CD105和CD90，中等水平表達(dá) CD106和 Stro-1，不表達(dá) CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR(圖3)。慢病毒感染后，出現(xiàn)部分細(xì)胞表達(dá)的CD45、CD14和HLA-DR，CD106和Stro-1的陽性細(xì)胞數(shù)也有所增加(圖3)。對CD19、CD34、CD73、CD105 和CD90 陽性細(xì)胞比例沒有影響。

2.3 慢病毒感染對cMSCs增殖的影響

與未感染慢病毒的cMSCs比較，感染慢病毒后的cMSCs體外增殖潛能明顯降低(P＜0.05)(圖4)。樣本n=3，每個(gè)樣本重復(fù)檢測3次。

表1 流式細(xì)胞儀熒光抗體Table 1 Details of fluorescent antibody used in Flow Cytometry

圖1 cMSCs表達(dá)GDNF基因Fig 1 Expression of GDNF gene in cMSCs after infection of lentivirus

圖2 ELISA檢測GDNF分泌量Fig 2 Detection of GDNF secretion by ELISA

2.4 慢病毒感染對cMSCs分化的影響

病毒感染后cMSCs體外誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞(圖5A，B)。慢病毒感染未影響cMSCs誘導(dǎo)分化成脂肪(圖5C)。樣本n=3，每個(gè)樣本重復(fù)檢測3次。

3 討論

圖3 慢病毒感染影響cMSCs表面標(biāo)志表達(dá)Fig 3 Effect of cell surface markers after lentivirus infection

圖4 慢病毒感染后cMSCs體外增殖Fig 4 The proliferation of cMSCs after lentivrus infection

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)均證實(shí)，GDNF家族因子對中腦多巴胺能神經(jīng)元有極強(qiáng)的促存活和損傷保護(hù)功能，阻止帕金森病黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生神經(jīng)退行性變［5－6］。但GDNF作為一種大分子的蛋白質(zhì)難以通過血腦屏障，使其一直難以應(yīng)用于臨床。腦內(nèi)直接注入GDNF，作用范圍局限，且濃度難以控制。病毒基因治療由于長期病毒感染，存在臨床風(fēng)險(xiǎn)。以基因修飾的細(xì)胞為載體，腦內(nèi)移植GDNF基因修飾的細(xì)胞，為GDNF分泌提供了一個(gè)生物泵，有望成為GDNF治療帕金森病的新途徑，為GDNF治療帕金森病的研究提供了希望［6］。

MSCs可以自體取材，體外擴(kuò)增，可作為基因工程改造細(xì)胞，不存在免疫排斥，上述優(yōu)點(diǎn)使MSCs成為各種疾病基因治療中不可替代的重要載體［9］。另一方面，MSCs作為基因工程細(xì)胞，易于接受外援基因。對比各種基因轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCs的方法，慢病毒具有最高的感染效率，并能穩(wěn)定表達(dá)［10］。慢病毒屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科為RNA病毒，對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)［11］。

之前的研究顯示，無論質(zhì)粒、還是病毒載體均可攜帶目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCs，而不影響干細(xì)胞的特征［12］。本實(shí)驗(yàn)通過GDNF慢病毒載體感染食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(cMSCs)，對比GDNF慢病毒感染前后cMSCs的生物學(xué)特性。結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)外源性GDNF基因后，cMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志發(fā)生變化，cMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志發(fā)生改變，出現(xiàn)CD45、CD14和HLA-DR陽性細(xì)胞，CD106和Stro-1的陽性細(xì)胞比例也有所增加?？赡苡绊懸蛩匕ú《靖腥具^程中細(xì)胞膜的損傷，傳代消化酶的影響，以及外源性基因表達(dá)對細(xì)胞膜蛋白的影響等。另一方面，慢病毒感染并沒有影響細(xì)胞體外的分化成脂肪的能力，但影響cMSCs的體外增殖能力。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，盡管MSCs是外源基因的理想載體，但慢病毒的感染影響干細(xì)胞的部分生物學(xué)特性，因此，在利用MSCs作為載體進(jìn)行基因治療前，應(yīng)該綜合分析其生物學(xué)特性的改變，及其帶來的影響。

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Effects of lentivirus-mediated GDNF on biologic characteristics of cynomolgus monkey mesenchymal stem cells

REN Zhen hua1，2，WANG Jia-yin1，WANG Shu-yan1，ZHANG Ying1，ZOU Chun-lin1，ZHANG Yu1*

(1.Cell Biology Laboratory，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053;2.Dept．of Anatomy，Anhui Medical University，Hefei 230032，China)

ObjectiveTo explore the effects of lentivirus-mediated GDNF on biologic characteristics of cynomolgus monkey mesenchymal stem cells．MethodsThe bone marrow mononuclear cells of cynomolgus monkey were isolated by density-gradient centrifugation and MSCs were culturedin vitro．GDNF lentivirus were used to infect cynomolgus monkey MSCs(cMSCs)．Using ELISA，Real-time PCR，flow cytometry(FCM)，BrdU incorporation and other experimental methods，GDNFgene expression，cell surface markers，proliferation and differentiation of cynomolgus monkey MSCs were observed before and after the infection of lentivirus．ResultsAfter the infection of GDNF lentivirus，cMSCs highly expressed GDNFin vitro，and moreover，cell morphology and adipocyte differentiation of cMSCs did not change significantly，but cell surface markers CD34，CD90 and Stro-1 positive cells increasedin vitro，and compared with control(0.61±0.11)，the proliferative potential of GDNF group(0.50±0.13)showed a significant decrease．ConclusionsThe cell surface markers and the proliferative potential of cMSCs changed after the infection of GDNF lentivirus，but the adipocyte differentiation ability of MSCs had no effect．

bone mesenchymal stem cells;lentivirus;cell proliferation;cell differentiation

Q 28;Q 789

A

1001-6325(2012)05-0533-06

2011－06－16

2011－11－14

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20091107120004);北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才隊(duì)伍建設(shè)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(20090214);安徽醫(yī)科大學(xué)博士科研資助基金(XJ201008)

*通信作者(corresponding author):zhangyualex1975@tom．com