梁瑩，梁薇，鄧毛子

(1.咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原系實(shí)驗(yàn)室，湖北咸寧437100;2.肇慶學(xué)院體育與健康學(xué)院，廣東肇慶526061)

目前，醫(yī)院對醫(yī)療藥品、器械的微波消毒與滅菌頻率多為2 450 MHz的箱式微波爐，因?yàn)榇祟愌b置與頻率更適宜于對小型和批量物品的處理［1］。關(guān)于培養(yǎng)基微波滅菌的報(bào)道已有不少，但是，有關(guān)照射過程中沸點(diǎn)時(shí)間上的滅菌效果還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室采用2 450 MHz，700 W微波爐對少量液體培養(yǎng)基進(jìn)行3種狀態(tài)的沸點(diǎn)時(shí)間滅菌效果觀察，主要為快速消毒或在緊急的沒有高壓消毒滅菌器的情況下，提供可靠的更充足更有效的最佳滅菌數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌枯草桿菌黑色變種芽胞菌片ATCC9372(Bacillus subtilus var.mucoides)生物指示劑，染菌量1.0×108cfu/片，北京鑫四環(huán)消毒技術(shù)開發(fā)中心研制。金黃色葡萄球菌ATCC25923(Staphyloccocus aureus)、大腸埃希菌ATCC25922(Escherichia coli)、普通變形桿菌ATCC49132(proteus vulgaris)，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教研室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂(生化試劑BR北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);普通液體培養(yǎng)基(由本室提供);微量糖管(葡萄糖、乳糖、甘露醇、尿素均來自杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.1.3 試劑蛋白胨(生化試劑，BR北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、牛肉膏粉(生化試劑，杭州天和微生物試劑有限公司)、NaCl(分析純，西安化學(xué)試劑廠)、NaOH(分析純，西安化學(xué)試劑廠)、pH試紙(天津塘沽化學(xué)試劑廠)、電子天平(上海精天電子儀器有限公司)。革蘭染液、鞭毛染液(由本室按《病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》［2］配制)。

1.1.4 設(shè)備格蘭仕微波爐(P7021TP-6型，700 W，2 450 MHz，佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9082D型，上海申賢恒溫設(shè)備廠)、全自動(dòng)不繡鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)、垂直流超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 供試菌懸液的制備將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、普通變形桿菌及枯草桿菌黑色變種芽胞菌片1片分別放入2 mL無菌普通液體培養(yǎng)基中，置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h，復(fù)活后，接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代3次增強(qiáng)細(xì)菌的活力。再用無菌普通肉湯配成濃度為1×109cfu/mL［3］的菌液，參照衛(wèi)生部《消毒技術(shù)規(guī)范》［4］(2002版)中規(guī)定操作方法進(jìn)行，保存于4℃冰箱，備用。

1.2.2 普通營養(yǎng)瓊脂平板的制備按照營養(yǎng)瓊脂瓶上的說明，用電子天平稱取營養(yǎng)瓊脂粉90 g，加入2 000 mL蒸餾水，加熱煮沸溶解，分裝500 mL三角瓶中，高壓蒸汽滅菌后，每個(gè)無菌平皿倒入20 mL，備用。

1.2.3 普通液體培養(yǎng)基的制備［5］用電子天平稱取NaCl 5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，蒸餾水1 000 mL，以此比例配制實(shí)驗(yàn)所需用量，加熱徹底溶解后，用NaOH調(diào)pH值為7.5，過濾，用250 mL三角瓶分裝，每瓶100 mL，包裝好，取29瓶高壓蒸汽滅菌，備用。其他需用量直接用于微波滅菌實(shí)驗(yàn)。將高壓蒸汽滅菌后的肉湯倒入3支試管，每管2 mL，備用。

1.2.4 微波對液體培養(yǎng)基沸騰點(diǎn)時(shí)間測試將100 mL的液體培養(yǎng)基設(shè)置為7個(gè)測試組，第1組100 mL×1瓶，第2組100 mL×2瓶，第3組100 mL×3瓶，第4組100 mL×4瓶，第5組100 mL×5瓶，第6組100 mL×6瓶，第7組100 mL×7瓶(微波爐最大容量)。設(shè)定微波高火。試驗(yàn)前三角燒瓶的棉塞要注入1 mL蒸溜水，防止棉塞干枯。實(shí)驗(yàn)主要觀察每組被照射的液體培養(yǎng)基中液體表面沸騰所需的時(shí)間、液體底部開始沸騰所需的時(shí)間及所有瓶完全沸騰所需的時(shí)間，結(jié)果見表1。測試完成后，每組液體培養(yǎng)基倒出3支試管，每管2 mL。同時(shí)取1 mL分別加入無菌瓊脂平板中，設(shè)3個(gè)重復(fù)。均置37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察有無細(xì)菌生長，結(jié)果見表2。

1.2.5 微波殺滅芽胞桿菌效果的試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組與1.2.4相同，將濃度為1×109cfu/mL的枯草桿菌黑色變種芽胞菌菌液1 mL，分別加入經(jīng)高壓蒸汽滅菌的100 mL液體培養(yǎng)基中，每組分別按微波照射后不生長細(xì)菌的最后時(shí)間4.5、5.0、7.0、9.0、12.0、19.0、25.0 min進(jìn)行試驗(yàn)，分別置微波高火作用，同時(shí)另一瓶100 mL加菌液不照射，作陽性對照，均置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，各組倒3支肉湯管，每管2 mL。并取1 mL分別加入瓊脂平板中，設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，肉眼觀察有無細(xì)菌菌落在瓊脂平板上生長。

1.2.6 液體培養(yǎng)基無菌檢測及保質(zhì)有效期試驗(yàn) 將有效時(shí)間被滅菌的試驗(yàn)組肉湯培養(yǎng)基、高壓滅菌過的微波殺滅芽胞桿菌試驗(yàn)組液體培養(yǎng)基及各試驗(yàn)組瓊脂平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)觀察7 d，置室溫約20℃空氣流通少的地方，連續(xù)觀察15 d的變化。

1.2.7 微波作用的液體培養(yǎng)基質(zhì)量檢測將微波作用后達(dá)到滅菌效果的各試驗(yàn)組肉湯管及對照組高壓蒸汽滅菌后的肉湯管分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及普通變形桿菌，置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h觀察其生長特征。然后，①分別將它們轉(zhuǎn)種無菌瓊脂平板中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況;②分別進(jìn)行革蘭染色［6］及鞭毛染色［7-8］，具體操作見《病原學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》和《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》。完成后油鏡下觀察形態(tài)、大小、染色性;③分別進(jìn)行微量糖管葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、苷露醇試驗(yàn)、克氏雙糖試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)等生化反應(yīng)，觀察微量糖管中測試菌的分解能力、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、顏色等有無變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波對液體培養(yǎng)基沸點(diǎn)的各時(shí)間及滅菌效果

表1 各測試組微波照射沸點(diǎn)時(shí)間Table 1 The boiling time of all test grorp

表2 各測試組沸點(diǎn)時(shí)間細(xì)菌生長情況Table 2 The bacterial growth phenomenon of all test group at different boiling time

由表1、表2可知，液體培養(yǎng)基在微波照射下取得3種狀態(tài)的沸騰時(shí)間。在表面沸騰時(shí)間及液體底部開始沸騰時(shí)間上瓊脂平板及肉湯管均有細(xì)菌生長，管中液體均勻混濁，瓊脂平板生長灰白色大小不等的菌落。在全部各瓶完全沸騰的時(shí)間上瓊脂平板及肉湯管均無細(xì)菌生長，管中液體清亮，平板無菌落。

2.2 微波殺滅芽胞桿菌效果的試驗(yàn)

枯草桿菌黑色變種芽胞菌在高壓滅菌的各肉湯管中，經(jīng)4.5、5.0、7.0、9.0、12.0、19.0、25.0 min微波有效時(shí)間的作用后，接種在瓊脂平板及肉湯試管中均無細(xì)菌生長，肉湯管中液體清亮。陽性對照管液體混濁，管底有絮狀沉淀，瓊脂平板表面形成圓形、粗糙、灰白色菌落。

2.3 無菌檢測及保質(zhì)有效期試驗(yàn)

通過7 d的無菌檢測和在20℃左右室溫下連續(xù)觀察15 d，照射后的肉湯培養(yǎng)基及瓊脂平板上均無細(xì)菌生長。肉湯管清亮，無混濁現(xiàn)象。

2.4 液體培養(yǎng)基質(zhì)量檢測

2.4.1 接種測試菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及普通變形桿菌在試驗(yàn)組肉湯管及對照組肉湯管中均呈均勻混濁狀態(tài)生長。在無菌瓊脂平板中，金黃色葡萄球菌均為菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1～2 mm，金黃色;大腸埃希菌均為圓形凸起，直徑2～3 mm的光滑型灰白色菌落;普通變形桿菌均呈擴(kuò)散生長，接種部位為中心的厚薄交替的灰白色波紋狀菌苔。由此可見，同一菌株在不同培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象無明顯差異。

2.4.2 革蘭染色將試驗(yàn)組肉湯管及對照組肉湯管中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及普通變形桿菌分別進(jìn)行革蘭氏染色及鞭毛染色后，油鏡下觀察到:金黃色葡萄球菌均為G+，球型，直徑0.8 μm左右，排列成葡萄串狀，無鞭毛的球菌;大腸埃希菌均為G-短桿菌，大小0.5 μm×(1～3)μm。具有周鞭毛;普通變形桿菌均為G-兩端鈍圓的小桿菌，大小(0.4～0.6)μm×(1.0～3.0)μm，具有周鞭毛。由此，試驗(yàn)組肉湯管和對照組肉湯管上的細(xì)菌形態(tài)染色特征均無明顯差異。

2.4.3 微量糖管試驗(yàn)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及普通變形桿菌在試驗(yàn)組各肉湯管及對照組各肉湯管培養(yǎng)后各試驗(yàn)菌的生化反應(yīng):金黃色葡萄球菌均分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;分解甘露醇產(chǎn)酸，分解尿素;大腸埃希菌均分解葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，分解甘露醇，不分解尿素;普通變形桿菌均分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解乳糖，分解甘露醇和尿素。

3 討論

100～700 mL液體培養(yǎng)基在2 450 MHz，700 W的微波照射下得到3種狀態(tài)的沸騰時(shí)間(表1)，表面沸騰到底部沸騰這2個(gè)時(shí)間都不能有效殺滅細(xì)菌。隨著整個(gè)被照射的培養(yǎng)基完全沸騰，為最佳的滅菌時(shí)間，也是達(dá)到最有效的滅菌效果(表2)。這可能就是熱效應(yīng)及非熱效應(yīng)。當(dāng)生物體受到微波輻射時(shí)，微波透射生物體被吸收后所產(chǎn)生的綜合生物效應(yīng)結(jié)果［9］。

利用國際通用消毒生物指標(biāo)菌枯草桿菌黑色變種芽胞菌對被微波照射的液體培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)控，并嚴(yán)格按照衛(wèi)生部的《消毒技術(shù)規(guī)范》執(zhí)行。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枯草桿菌黑色變種芽胞菌在液體培養(yǎng)基中被微波有效地全部殺滅，說明微波作用不但能殺滅細(xì)菌的繁殖體，更能殺滅細(xì)菌的芽胞，并且無菌檢測7 d未見長菌，室溫保存15 d無細(xì)菌生長，完全符合《消毒與滅菌效果的評價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)》(GB15981-1995)的國家標(biāo)準(zhǔn)。而金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及普通變形桿菌作為質(zhì)檢菌，經(jīng)過革蘭染色及鞭毛染色、分離接種培養(yǎng)、生化反應(yīng)等一系列實(shí)驗(yàn)，證明被作用后的液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分沒有受到影響，細(xì)菌的形態(tài)染色特征、細(xì)菌的生長特性、細(xì)菌的分解能力均在正常范圍內(nèi)。

據(jù)報(bào)道，利用2 450 MHz，700 W微波消毒母乳，可以預(yù)防南美洲錐蟲?。?0］;應(yīng)用微波輻射處理工業(yè)廢水，能殺滅大腸埃希菌、沙門菌、葡萄球菌、綠膿桿菌和旋毛(線)蟲等微生物［11］。谷小燕等［12］報(bào)道，可將微波滅菌后的方盒替代臨床治療護(hù)理中的無菌盤;王瑞等［13］報(bào)道，用微波對麥苗粉殺菌有利產(chǎn)品品質(zhì)和營養(yǎng)成分的保持。資料表明，微波消毒滅菌不但可在醫(yī)療衛(wèi)生方面廣泛應(yīng)用，而且已經(jīng)逐漸深入到工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品等各個(gè)領(lǐng)域。

本文通過實(shí)驗(yàn)表明，滅菌量與滅菌時(shí)間成正比，隨著滅菌定量的增高，滅菌時(shí)間也隨著相應(yīng)增長，但未見有規(guī)律的時(shí)間變化，這可能與微波爐內(nèi)的空間、分裝液體的三角瓶玻璃厚薄有關(guān)，微波的滅菌機(jī)制較為復(fù)雜，有待進(jìn)一步的研究討論。盡管如此，微波爐用于液體培養(yǎng)基的消毒滅菌還是最安全可靠、方便快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的一種方法，具有較高的實(shí)用價(jià)值，值得廣泛推廣。

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