呂國忠，張薇，2，孫曉東

（1.大連民族學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連 116605;2.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116029）

人參銹腐病菌雙胞柱孢的鑒定及其生物轉(zhuǎn)化功能研究

呂國忠1，張薇1，2，孫曉東1

（1.大連民族學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連 116605;2.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116029）

從采自遼寧省桓仁縣患有銹腐病的人參組織中分離得到多株柱孢屬真菌。通過柯赫氏法則證明柱孢屬真菌對人參具有致病性，可引起典型人參銹腐病。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，確定致病真菌SR79、SR86、SR88、SR90、SR91、SR94、SR95、SR96為雙胞柱孢Cylindrocarpon didymium。進(jìn)一步研究這些菌株對人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化作用，通過TLC和HPLC檢測，證明菌株SR79具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化活性，能夠?qū)⑷藚⒃碥誖b1和人參皂苷Rd轉(zhuǎn)化成稀有人參皂苷Rh2。結(jié)果表明，人參銹腐病菌SR79菌株具有人參皂苷生物轉(zhuǎn)化開發(fā)潛力。

銹腐病;致病真菌;雙胞柱孢;生物轉(zhuǎn)化

人參Panax ginseng C.A.Meyer是名貴藥用植物，因其具有悠久的藥用歷史和特殊功效，自古以來就受到東、西方人的普遍青睞，在中國、朝鮮、日本等國家被廣泛用于滋補(bǔ)保健和醫(yī)療［1］。在人工栽培條件下，人參常發(fā)生多種病害，其中最為普遍、嚴(yán)重的病害是人參銹腐病［2］。人參銹腐病（Cylindrocarpon destructans）是人參根部最嚴(yán)重的一種真菌病害，也是一種常見土傳病害，直接影響人參的產(chǎn)量和商品價值［3］。另外，人參是多年生宿根植物，連作障礙十分嚴(yán)重［4］，常導(dǎo)致栽種過患病人參的土壤幾十年內(nèi)不能再種植人參。中國東北地區(qū)是人參主要產(chǎn)區(qū)之一，人參銹腐病發(fā)病率在90%以上，造成人參減產(chǎn)30%左右，其危害以吉林和黑龍江省最為嚴(yán)重［5］。

目前，國內(nèi)外報道的人參銹腐病菌有4種真菌，尤其是C.destructans（Zinss）Scholten最為普遍，危害嚴(yán)重［6］。本研究中分離得到一株致病真菌C.didymium Harting，該致病菌與其他4種致病菌在大孢子形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)上存在差異。人參根感染銹腐病菌后，多種有機(jī)物含量發(fā)生變化，其中人參皂苷最為顯著［7］。皂苷是人參藥物活性的主要成分［8］，因此，人參皂苷含量多少和人參皂苷類型是評價人參內(nèi)在質(zhì)量的關(guān)鍵。人參感染銹腐病菌后，其人參皂苷含量較健康人參含量減少18.4%，并且隨著病級的升高而繼續(xù)下降［7］。作者認(rèn)為，人參感染銹腐病菌后人參皂苷含量下降，說明銹腐病菌具有皂苷降解或生物轉(zhuǎn)化功能。為了明確人參銹腐病菌SR79菌株是否存在對人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化功能，本文對此展開了深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

由遼寧省桓仁縣參茸場提供新鮮人參樣品。人參單體皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1、Rg3、Rh1、Rh2及對照品均購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。

1.2 儀器及試劑

薄層層析板Silica Gel－60F254（德國MERCK）;高效液相色譜分析儀（島津LC－20AD），色譜柱為C18 kromasil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm），由大連化物所提供。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL）;液體發(fā)酵培養(yǎng)基（麥麩20 g，5°麥芽汁80 mL，混勻，121℃滅菌30 min）。

1.4 人參銹腐病菌的分離和鑒定

1.4.1 人參銹腐病菌的分離

參考張?zhí)煊罘椒ǎ?］，用自來水將罹病的新鮮人參沖洗干凈，用濾紙吸干水分，然后，先用0.1%升汞浸泡1～1.5 min，經(jīng)無菌水沖洗4～5次，用75%酒精浸泡1～1.5 min，再經(jīng)無菌水沖洗3～4次。處理后在無菌條件下，用經(jīng)滅菌的手術(shù)剪將人參根系組織剪成小塊（4 mm×4 mm），分別置于直徑9 cm的PDA平板上。在25℃恒溫箱中培養(yǎng)5～7 d后觀察組織塊周圍有無菌落形成。待產(chǎn)生菌落后，挑取菌絲接種到PDA斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行純化和保藏備用。

1.4.2 濾紙培養(yǎng)法

參考張?zhí)煊罘椒ǎ?］將待分離的病組織沖洗干凈后，選擇典型罹病部位，切取組織塊（4 mm×4 mm）若干，經(jīng)升汞表面滅菌2～3 min，無菌水反復(fù)沖洗3次，置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，向皿中加人適量無菌水，于28℃下培養(yǎng)，待組織塊上長出菌絲時，將外觀不同的菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化，于25℃培養(yǎng)7～10 d，然后進(jìn)行菌落及形態(tài)的觀察。

1.5 致病性測定

試驗采用3年生健康人參根，用自來水沖洗干凈后于1%過氯酸鈉中消毒5 min，再用無菌水反復(fù)沖洗4次。采用針刺法接種菌株孢子懸液。在預(yù)定的接種點上接種，每根選取10個點，共接3根。接種后置于直徑20 cm的培養(yǎng)皿中，于28℃保濕培養(yǎng)，分別在8，15 d觀察接種點發(fā)病情況。以接種無菌水為空白對照。

1.6 菌種鑒定

對分離純化的菌株在培養(yǎng)6～12 d后進(jìn)行菌落特征和顯微形態(tài)觀察，參照相關(guān)真菌分類資料［10－11］，對菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.7 微生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)

參考李梁等方法［12］，將已鑒定的柱孢屬真菌菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃搖床振蕩培養(yǎng)3～5 d。將發(fā)酵液攪拌1～2 h，用雙層紗布過濾，濾液經(jīng)10 000 r·min－1離心10 min，取上清液加入300 mL 95%冰乙醇，4℃沉淀4 h。經(jīng)10 000 r·min－1離心10 min，倒掉上清，沉淀溶于10 mL0.02 mmol·L－1、pH5.0的醋酸－醋酸鈉緩沖液中，經(jīng)13 000 r·min－1離心10 min，最后得到上清酶液。取0.1 mL酶液與等體積單體人參皂苷混合，40℃下反應(yīng)24 h，加入0.2 mL正丁醇萃取1 h，取上清進(jìn)行TLC檢測，同樣取0.1 mL失活的酶液加入對應(yīng)單體皂苷作為空白對照。

1.8 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測

用移液槍吸取正丁醇層進(jìn)行TLC檢測，在V （氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶3∶0.5的系統(tǒng)中展開，噴10%H2SO4水溶液，110℃下烘干顯色，與空白對照的標(biāo)準(zhǔn)品單體人參皂苷比對。萃取液減壓回收正丁醇，蒸干后用0.1 mL甲醇充分溶解，取5 μL進(jìn)行HPLC檢測。色譜條件:色譜柱C18 kromasil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）;檢測波長203 nm;柱溫35℃;流動相A為乙腈，流動相B為高純水。梯度洗脫:流速0.6 mL· min－1，進(jìn)樣量5 μL。梯度洗脫時間見表1。

表1 高效液相梯度洗脫時間表

2 結(jié)果與討論

2.1 病原菌分離結(jié)果

從罹銹腐病的人參病根中經(jīng)多次分離得到多株柱孢屬真菌，經(jīng)對各菌株進(jìn)行針刺接種試驗，結(jié)果表明，在30個接種點中有18個接種點出現(xiàn)褐色病斑。8 d后，針刺接菌處出現(xiàn)典型銹腐病黑褐色病斑。15 d后，病斑擴(kuò)散，表皮呈黑褐色，組織破壞，皮內(nèi)深處腐爛、凹陷。上述經(jīng)接種發(fā)病的人參根按柯赫氏法則進(jìn)行病菌再分離，均獲得與接種時相同的病菌。

2.2 菌株鑒定

PDA上25℃培養(yǎng)7 d，菌落直徑達(dá)到25～30 mm，伴隨有白色菌絲生成。菌落初為米黃色，隨培養(yǎng)時間增加，菌落顏色逐漸加深，最后為褐色，培養(yǎng)基背面呈深褐色。在菌落初期大量產(chǎn)生單胞小型分生孢子（5～9 μm×3～4.5 μm），無色，橢圓形;分生孢子梗（16～25 μm×2.5～4 μm）細(xì)長，瓶梗形。不久產(chǎn)生大型分生孢子，1～2個隔膜，少數(shù)3個隔膜，多呈圓柱形，直或略彎曲;無隔大型分生孢子為8～20 μm×2.5～5 μm;單隔大型分生孢子為15～25 μm×3～7 μm;雙隔大型分生孢子為24～36 μm×5～8 μm。在菌落生長后期形成厚垣孢子，鏈生，球狀，壁光滑，直徑為8.5～12.5 μm，初無色，后呈深褐色（如圖1）。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，該致病菌為雙胞柱孢C.didymium Harting。

圖1 雙胞柱孢Cylindrocarpon didymum

人參銹腐病菌SR79菌株與文獻(xiàn)中描述的典型柱孢屬致病菌毀滅柱孢C.destructans的顯微形態(tài)比較見表2。

表2 菌株SR79與毀滅柱孢的形態(tài)特征比較

2.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測

2.3.1 TLC分析

將Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1作為底物與真菌菌株SR79、SR86、SR88、SR90、SR91、SR94、SR95、SR96進(jìn)行反應(yīng)，用移液槍吸取人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品及樣品各5～10 μL，分別點樣于薄層層析板上，層析結(jié)果顯示，菌株SR79的轉(zhuǎn)化作用最強(qiáng)。菌株SR79的層析圖如圖2，從中可以看出，該株真菌對各種人參皂苷均有轉(zhuǎn)化作用，其Rf值與標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的轉(zhuǎn)化效果見表3。從表3中可以明確看出，該菌株對人參皂苷Rb1、Rd轉(zhuǎn)化效果強(qiáng)，均能產(chǎn)生稀有人參皂苷20（s）－Rg3和Rh2。

圖2 人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的TLC分析

表3 SR79菌株轉(zhuǎn)化不同型人參皂苷的產(chǎn)物

2.3.2 HPLC檢測

在TLC分析基礎(chǔ)上，對菌株SR79底物Rb1和Rd的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行了HPLC檢測，結(jié)果如圖3 （截取0～50 min色譜圖）。經(jīng)HPLC檢測，在特定時間下，Rb1和Rd的主要代謝物分別與標(biāo)準(zhǔn)品Rd、20（s）－Rg3和Rh2有相同保留時間峰。因此，可以進(jìn)一步確定其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

圖3 活性菌株SR79轉(zhuǎn)化產(chǎn)物HPLC檢測圖（0～50 min）

3 結(jié)語

目前，國內(nèi)外對人參銹腐病菌C.didymium的研究較少。Brayford研究發(fā)現(xiàn)該病菌具有弱致病性［10］。Mackinaite＆Strukcinskas發(fā)現(xiàn)該菌是引起立陶宛紫花苜蓿根腐病的病原菌［13］。另外，據(jù)報道，與C.didymium形態(tài)相近的C.ehrenbergii是引起加拿大和美國紅車軸草和草木樨根腐病的病原菌［14－15］。Barbetti研究發(fā)現(xiàn)該菌對三葉草具有致病性，并對其真菌毒素進(jìn)行了相關(guān)研究［16］。然而，Blok＆Bollen（1995）研究認(rèn)為，雖然該菌從天冬根系中分離頻率較高，但對天冬無致病性［17］。張?zhí)煊钛芯空J(rèn)為該菌對西洋參無致病性［9］。由此看來，寄主不同，該菌致病性不同，而且不同菌株之間可能存在致病性差異。本研究篩選出8株柱孢屬真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定都為C.didymium，并通過致病性測定，證明該菌能夠引起人參銹腐病，影響人參的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值。作為我國新發(fā)生的人參銹腐病菌，該病菌應(yīng)引起重視。

許多研究表明，人參中二醇組的稀有人參皂苷（如Rh2、Rg3、Compound K等），在抗腫瘤活性方面表現(xiàn)出了獨特的作用，尤其對人參皂苷Rh2在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用研究較多［18］。由于人參皂苷Rh2在人參屬植物中的含量極低，只存在于紅參和山參中，一些研究者便采用化學(xué)方法進(jìn)行制備，但化學(xué)法有污染環(huán)境、副產(chǎn)物多等諸多缺點，相比之下，微生物轉(zhuǎn)化法資源豐富、種類繁多、底物特異性強(qiáng)，因此，目前很多研究者都在尋找能夠?qū)⒍碱惾藚⒃碥辙D(zhuǎn)化成Rh2的微生物或者酶［19－21］。本研究所篩選出的雙胞柱孢C.didymium能夠?qū)⑷藚⒍碱愒碥誖b1和Rd轉(zhuǎn)化成Rh2，其轉(zhuǎn)化機(jī)理是由于其能產(chǎn)生β－葡萄糖苷水解酶，水解人參皂苷Rb1和Rd C位上的β－葡萄糖基而得到的［22］。本研究僅就該菌株對人參皂苷的轉(zhuǎn)化作用進(jìn)行了初步探討，但該菌株產(chǎn)生的酶催化活性、酶分子結(jié)構(gòu)以及提高轉(zhuǎn)化效率等方面還有待進(jìn)一步研究。

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Identification of Ginseng Root Rust－rot Pathogen Cylindrocarpon didymium and Its Biotransformation of Ginsenosides

LV Guo－zhong1，ZHANG Wei1，2，SUN Xiao－dong1
（1.College of Environment and Resources，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China; 2.College of Life Science，Liaoning Normal University，Dalian Liaoning 116029，China）

Several Cylindrocarpon strains were obtained from rust rot disease－suspected roots of ginseg grown in Huanren areas of Liaoning province.They were confirned to be of pathogenicity to ginseng roots according to Koch＇s postulation.The pathogenic strains SR79，SR86，SR88，SR90，SR91，SR94，SR95，SR96 were morphologically identified as Cylindrocarpon didymium.Among these pathogens strain SR79 was found to show the specificity to transform Rb1and Rd ginsenosides into ginsenoside Rh2by methods of TLC and HPLC.This strain was shown to possess commercial potential in ginsenoside transformation.

root rust rot;pathogenic fungi;Cylindrocarpon didymium;biotransformation

S435.675

A

1009－315X（2012）03－0193－05

2011－11－07;最后

2011－11－27

國家自然科學(xué)基金資助項目（30770009）;中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目（DC10020109）。

呂國忠（1964－），男，遼寧昌圖人，教授，博士，學(xué)校優(yōu)秀學(xué)科帶頭人，主要從事真菌分類與資源利用研究。

（責(zé)任編輯 鄒永紅）