蔣本國(guó)，張旭凡，劉長(zhǎng)建

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116605）

四種木本植物葉芽不同生長(zhǎng)期SOD的檢測(cè)研究

蔣本國(guó)，張旭凡，劉長(zhǎng)建

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116605）

對(duì)楓藤等四種木本植物葉芽不同生長(zhǎng)期的SOD使用連苯三酚自氧化法進(jìn)行了檢測(cè)，以確定SOD含量較高的植物材料及其所在生長(zhǎng)階段，并研究了Mg2+及Ca2+對(duì)雪松SOD活力的影響。實(shí)驗(yàn)表明，楓藤葉芽在開(kāi)始取樣后第9天SOD活力達(dá)到最大值，為159.24 μ·g－1;遼東冷杉與雪松在第一次取樣時(shí)SOD活力達(dá)到最大值，分別為83.57和190.71 u·g－1;Mg2+、Ca2+加入均在0.1 mL（4 mg·mL－1）時(shí)，對(duì)雪松SOD活力的增強(qiáng)作用達(dá)到最大，分別為148%，138%。

超氧化物歧化酶（SOD）;葉芽;生長(zhǎng)期;Mg2+;Ca2+

超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于植物中，用于清除植物體內(nèi)自由基，保護(hù)植物細(xì)胞免受O2

·－的毒害作用［1］。SOD在食品、醫(yī)療領(lǐng)域中的應(yīng)用價(jià)值已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注。SOD可以防止皮膚變皺、變黑，形成老年斑［2］;可以預(yù)防并緩解肺氣腫和動(dòng)脈粥樣硬化［3］;可作為罐頭、果汁、啤酒等的添加劑，防止過(guò)氧化物引起的食品變質(zhì)及腐敗現(xiàn)象;還可作為水果、蔬菜等的良好保鮮劑［4］。本文使用連苯三酚自氧化法研究了楓藤等四種木本植物葉芽不同生長(zhǎng)階段SOD活力的變化［5］，以獲得較好的可用于提取制備SOD的材料。

1 材料與方法

1.1 材料

楓藤葉芽、遼東冷杉葉芽、馬尾松葉芽、雪松葉芽，以上四種葉芽都是在其葉芽萌發(fā)到長(zhǎng)度為1 cm左右進(jìn)行第一次取樣，測(cè)定SOD活力，以后每隔3 d采樣測(cè)定一次，直至葉片成熟。

1.2 儀器及試劑

紫外分光光度計(jì)（UV－2100）（龍尼柯儀器有限公司），高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（TGL－16）（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），勻漿機(jī)（T25basic） （IKA），pH計(jì)（SX－610）（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。試劑均為分析純（AR）。

1.3 方法

1.3.1 SOD酶液的提取

稱取4 g即采植物葉芽樣品，剪碎，放入勻漿管中，向管中加入20 mL 0.05 mol·L－1，pH 7.8 Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液，在冰浴中勻漿，勻漿后經(jīng)12 000 r·min－1、4℃下離心15 min，取上清液在60℃水浴鍋中保持15 min后用于活力測(cè)定。每隔3 d對(duì)植物葉芽采樣進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定

空白管、自氧化管與樣品管組成見(jiàn)表1。取兩支試管按表1加入25℃預(yù)熱過(guò)的pH8.2、50 mmol·L－1Tris－HCl緩沖液，然后加入預(yù)熱過(guò)的5 mmol·L－1鄰苯三酚（空白管用10 mmol·L－1HCl代替鄰苯三酚），迅速搖勻，立即傾入1 cm比色杯中，在325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，每隔30 s讀數(shù)一次，測(cè)定4 min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值增量為0.07［6］（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。實(shí)驗(yàn)中鄰苯三酚的加入量均為80 μL。

表1 空白管、自氧化管及樣品管的組成

1.3.3 SOD樣品的酶活力測(cè)定

按表1配制溶液，樣品管測(cè)定時(shí)先加入預(yù)熱的待測(cè)酶液，再加入鄰苯三酚，其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定。

1.3.4 Mg2+、Ca2+對(duì)雪松SOD活力的影響

空白管與加金屬離子的樣品管組成見(jiàn)表2。以雪松葉芽第9天采集材料所制備的SOD樣液進(jìn)行Mg2+、Ca2+對(duì)雪松SOD活力影響的測(cè)定，將2，4， 6，8，10 mg·mL－1的Mg2+、Ca2+溶液按表2中的量分別加入配制空白管與樣品管試液進(jìn)行測(cè)定。

表2 空白管與加金屬離子的樣品管組成

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法

樣品酶活力單位表示在25℃恒溫條件下，每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率50%的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。實(shí)驗(yàn)按下式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

式中，△A0為聯(lián)苯三酚的自氧化率，△A1為加入待測(cè)液后鄰苯三酚的自氧化率，V0為反應(yīng)液總體積，n為酶液稀釋倍數(shù)，VE為所加酶液體積。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物不同生長(zhǎng)期葉芽SOD活力測(cè)定

2.1.1 楓藤

楓藤SOD活力變化曲線如圖1。可以看出，楓藤SOD活力總體呈振蕩上升的趨勢(shì)，采樣第9天時(shí)SOD活力達(dá)到測(cè)定階段的最高值，為159.24 u·g－1。因此，提取楓藤SOD時(shí)應(yīng)該選擇在萌芽（從1 cm開(kāi)始）采樣后的第9天進(jìn)行。此期間楓藤SOD活力隨其葉芽生長(zhǎng)而增加，葉片接近成熟時(shí)其生物量較大，SOD活力總值顯著提高，之后則有所下降。

圖1 楓藤SOD活力變化曲線

2.1.2 遼東冷杉

遼東冷杉SOD活力變化曲線如圖2?？梢钥闯?，第一次采樣（1 cm）的冷杉SOD活力最高，達(dá)到83.57 u·g－1。此時(shí)冷杉處于剛開(kāi)始萌發(fā)的階段，葉子還沒(méi)舒展開(kāi)，說(shuō)明此時(shí)冷杉需要更多SOD的保護(hù)，把外界環(huán)境對(duì)幼芽的傷害降到最低。但其SOD活力隨著葉芽生長(zhǎng)快速降低，SOD活力較高的葉芽生物量較少，難以采集葉芽用于SOD的提取制備。因此雖然遼東冷杉生長(zhǎng)初期SOD活力較高，但并不適于SOD的提取制備。

圖2 遼東冷杉SOD活力變化曲線

2.1.3 馬尾松

馬尾松SOD活力變化曲線如圖3?？梢钥闯?，馬尾松SOD酶活力總體呈振蕩下降的趨勢(shì)，第2次采樣的葉芽達(dá)到最大，為73.93 u·g－1。說(shuō)明馬尾松剛開(kāi)始發(fā)芽時(shí)需要產(chǎn)生更多的SOD以達(dá)到保護(hù)嫩芽的作用，但隨著葉子的逐漸成熟SOD活力下降，這與遼東冷杉類似。其適于SOD提取的葉芽生物量小，因而不適于進(jìn)行SOD的提取制備。

圖3 馬尾松SOD活力變化曲線

2.1.4 雪松

雪松SOD活力變化曲線如圖4?？梢钥闯觯┧芍蠸OD活力隨著葉子的生長(zhǎng)，呈平穩(wěn)下降趨勢(shì)，初期嫩芽SOD活力最高，達(dá)到190.71 u·g－1。隨著葉片生長(zhǎng)接近成熟，SOD活力較低，但由于雪松中SOD活力初期較其他生物材料高很多，葉片接近成熟時(shí)SOD活力仍然比遼東冷杉、馬尾松初期葉芽高，因此在生物量較大時(shí)雪松葉片是比較適于SOD提取制備的材料。

圖4 雪松SOD活力變化曲線

2.2 Mg2+、Ca2+對(duì)SOD活力的影響

本實(shí)驗(yàn)以雪松為例，Mg2+、Ca2+對(duì)其SOD活力的影響曲線如圖5?？梢钥吹?，在分別加入2，4，6，8 mg·mL－1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Mg2+溶液各0.1 mL時(shí)，對(duì)雪松葉芽SOD活力都有不同程度的促進(jìn)作用，4 mg·mL－1時(shí)達(dá)到最大，為220.71 u· g－1。Mg2+濃度過(guò)低或過(guò)高對(duì)SOD活力促進(jìn)作用有所降低，若濃度低于實(shí)驗(yàn)中的最低值，或濃度高于實(shí)驗(yàn)中的最高值對(duì)SOD活力有抑制作用。

在分別加入2，4，6，8 mg·mL－1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ca2+溶液各0.1 mL時(shí)對(duì)雪松SOD活力都有不同程度的促進(jìn)作用，4 mg·mL－1時(shí)達(dá)到最大，為204.64 u·g－1，而在2，10 mg·mL－1時(shí)對(duì)SOD活力有明顯的抑制作用，Ca2+濃度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)抑制SOD活力。

Mg2+、Ca2+離子在酶促反應(yīng)中可以作為親電輔助因子促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，適當(dāng)濃度時(shí)對(duì)SOD活力的提高有明顯的促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

（1）楓藤中SOD活力隨著葉芽生長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，在開(kāi)始采樣后第9天達(dá)到最大值，為159.24 u·g－1，遼東冷杉和馬尾松中SOD酶隨著葉芽生長(zhǎng)呈減少趨勢(shì)，雪松在第一次取樣時(shí)測(cè)得的SOD活力最大，為190.71 u·g－1，之后逐漸下降，至葉片近成熟時(shí)仍有130 u·g－1左右。經(jīng)對(duì)比，遼東冷杉和馬尾松葉芽中在其生物量較大時(shí)SOD活力較低，不適于作為SOD提取材料;楓藤和雪松葉芽均在生物量較大時(shí)具有較高的SOD活力，作為SOD提取材料較適宜。

（2）Mg2+、Ca2+對(duì)雪松葉芽中SOD活力影響研究中獲知，Mg2+、Ca2+在分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 mg·mL－1溶液0.1 mL時(shí)，對(duì)SOD活力的增強(qiáng)作用最大，分別為148%，138%。

［1］TAKENAGA Mitsuko，OHTA Yuki，TOKURA Yukie.Lecithinized superoxide dismutase（PC－SOD）improved spinal cord injury－induced motor dysfunction through suppression of oxidative stress and enhancement of neurotrophic factor production［J］.Journal of Controlled Release，2006，110（2）:283－289.

［2］HEE Soon Choi，JAE Jin An.PEP－1－SOD fusion protein efficiently proteets against paraquat－indueed dopaminergie neuron damage in a Parkiuson disease mouse model［J］.FreeRadical Biology＆Medieine，2006，41: 1058－1068.

［3］TASAKI H，YAMASHITA K.Heparin－released extracellular superexide dismutase is reduced in patients with coronaryarteryatherosclerosis［J］.Atheroscleresis （Amsterdam，Netherlands），2006，187（1）:131－138.

［4］YE Nanhui，LIU Shutao，LIN Yanyun，et al.Protective effects of intraperitoneal injection of TAT－SOD against focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats［J］.Life Sciences，2011，89（23－24）:868－874.

［5］靜天玉，趙曉瑜.用終止劑改進(jìn)超氧化物歧化酶鄰苯三酚測(cè)活法［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1995，22 （1）:84－86.

［6］張宏，譚竹鈞.四種鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧化物歧化酶活性方法的比較［J］.內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，33（6）:677－681.

Study on Detection of SOD of Four Woody Plant Buds in Different Growth Periods

JIANG Ben－Guo，ZHANG Xu－fang，LIU Chang－Jian
（College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China）

The autoxidation of pyrogallol is used in the analysis and detection of SOD of Japanese creeper and other three kinds of woody plant buds in different growth periods，which was used to determine the species of plants and growth period with higher SOD.Meanwhile we also analyze the influence on the activity of SOD of cedar from Mg2+，Ca2+.The activity of SOD from japanese creeper＇leaves reaches maximum value，159.24 u·g－1，in the ninth day after being sample.The activity of SOD of Liaodong fir and cedar in the first sample analysis reaches maximum value，83.57 u·g－1and 190.71 u·g－1，respectively.When Mg2+and Ca2+with 0.1 mL（4 mg·mL－1）are added into cedar，the enhancement effect of the activity of SOD of cedar is best with 148%and 138%，respectively.

super－oxide dismutase;leaf bud;growth period;Mg2+;Ca2+

Q554.6

A

1009－315X（2012）03－0202－03

2012－03－07;最后

2012－03－20

蔣本國(guó)（1954－），男，黑龍江望奎人，副教授，主要從事有機(jī)化學(xué)與生物化學(xué)研究。

（責(zé)任編輯 鄒永紅）