馮杰，詹曉北，季新躍，鄭志永，王棟，張麗敏

1(江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)2(無(wú)錫市恒禾工程咨詢?cè)O(shè)計(jì)有限公司，江蘇 無(wú)錫，214031)

2(5)-乙基-4-羥基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(簡(jiǎn)稱HEMF)主要存在于醬油中，是醬油中的主體香味物質(zhì)［1］，故稱為醬油酮［2］，具有高強(qiáng)度的甜焦糖醬香特色［3］，是雜環(huán)香體類呋喃同系衍生物中極其重要而且用途極為廣泛的香料之一［4］。HEMF可代替天然香料添加在釀造食品如調(diào)味料、酒、無(wú)酒精飲料及果制品如果醬、果漿、罐頭等食品中，具有加強(qiáng)其天然香味的作用［5］。同時(shí)，HEMF是美國(guó)食用制造者協(xié)會(huì)(FEMA)認(rèn)可的安全食用香料。此外，最近日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)HEMF還具有抗腫瘤的活性［6］。

國(guó)內(nèi)目前還沒(méi)有關(guān)于對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)HEMF的研究和報(bào)道，國(guó)際上也鮮有報(bào)道。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，張海林等［8］在研究酵母菌產(chǎn)呋喃酮(HDMF和HEMF具有相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì))類物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)CaCl的添加對(duì)酵母菌株產(chǎn) HDMF有較大的促進(jìn)作用，Sugawara等［9］研究了酵母菌發(fā)酵產(chǎn)味噌的過(guò)程中產(chǎn)HEMF，產(chǎn)量在100 ppm以下，并且進(jìn)一步研究了HEMF的形成機(jī)制。Ohata等［3］利用13C同位素示蹤方法發(fā)現(xiàn)酵母菌發(fā)酵產(chǎn)HEMF的形成機(jī)制，主要是由戊糖和游離氨基酸通過(guò)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)酵母菌產(chǎn)生的酶作用后形成HEMF。

本研究以1株從醬油中篩選得到的產(chǎn)2(5)-乙基-4-羥基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮的耐高鹽度酵母菌株C.etchellsii CICIM Y0600作為研究對(duì)象，主要研究了在不同鹽度和添加不同種類氨基酸條件下，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物HEMF合成的變化情況。

1 材料與方法

1.1 菌種

Candida.etchellsii CICIM Y0600，江南大學(xué)生化工程與反應(yīng)器研究室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，葡萄糖 20，酵母粉 5，NaCl 180～240，瓊脂粉 1.5，pH 5.8 ～6.0。

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，葡萄糖 20，酵母膏 5，NaCl 180～240，pH 5.8～6.0。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 75，木糖 25，不同種類氨基酸 5，酵母粉 1，KH2PO410，MgSO4·7H2O 5，NaCl 180 ～240，pH 5.2。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

發(fā)酵罐:美國(guó)New Brunswick Scientific公司BioflowⅢSystem 7 L發(fā)酵罐。

1.4 分析方法

生物量的測(cè)定:取菌懸液5 mL，10 000 r/min離心10 min棄上清液后加入5 mL水稀釋后在分光光度計(jì)上于600 nm下測(cè)定吸光度(結(jié)果與干重法比對(duì)，換算為g/L)。

智能變電站是基于數(shù)字化建設(shè)，因此基于智能變電站的硬件是數(shù)字的基礎(chǔ)上，通過(guò)先進(jìn)的傳感器和通信網(wǎng)絡(luò)，從而實(shí)現(xiàn)全景采集變電站信息，和一個(gè)全面的數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，使變電站自動(dòng)化操作，維護(hù)和智能分析與決策能力實(shí)現(xiàn)，進(jìn)一步提高電力企業(yè)的管理水平和適應(yīng)能力。

還原糖的測(cè)定:DNS比色法［10］。

HEMF的測(cè)定:高效液相色譜(HPLC)法。條件:高效液相色譜儀為安捷倫1200，色譜柱為安捷倫ZORBAX XDB-C18 柱(150 ×4.6 mm，5 μm)，柱溫25℃;進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm。流動(dòng)相流速0.8 mL/min，流動(dòng)相組成:60%甲醇和40%雙蒸水。

2 結(jié)果與分析

2.1 C.etchellsii分批發(fā)酵過(guò)程曲線

以耐高鹽度的C.etchellsii為研究對(duì)象，選擇培養(yǎng)基中的甘氨酸作為氨基酸源，在180 g/L NaCl濃度條件下對(duì)其產(chǎn)HEMF進(jìn)行分批發(fā)酵研究，結(jié)果如圖1所示。

圖1 180 g/L NaCl濃度下C.etchellsii生長(zhǎng)和產(chǎn)HEMF過(guò)程曲線

由圖1中的C.etchellsii生長(zhǎng)和產(chǎn)HEMF過(guò)程曲線可知，菌體生長(zhǎng)分為3個(gè)階段，0～4 h為菌體生長(zhǎng)的遲滯期，此后4～40 h菌體生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期，產(chǎn)物HEMF開始產(chǎn)生，在40 h后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，最大菌體干重為11.11 g/L，而產(chǎn)物HEMF在120 h達(dá)到最大值57.74 mg/L。

2.2 不同NaCl濃度對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF影響

張海林等［8］在研究酵母菌產(chǎn)呋喃酮(HDMF和HEMF具有相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì))類物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，NaCl的添加對(duì)酵母菌株產(chǎn)HDMF有較大的促進(jìn)作用。由于本研究中C.etchellsii篩選自高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中，該類型醬油中的NaCl濃度為180～240 g/L，故在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充5 g/L甘氨酸，然后分別向發(fā)酵體系中添加180 g/L，200 g/L，220 g/L和240 g/L NaCl，考察NaCl濃度對(duì)C.etchellsii合成HEMF的影響。選擇發(fā)酵140 h時(shí)結(jié)束并分別對(duì)其生物量和HEMF產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，在200 g/L NaCl濃度條件下，菌體濃度最高，而在220 g/L NaCl濃度條件下，HEMF產(chǎn)量和對(duì)菌體濃度的產(chǎn)物得率最高。這說(shuō)明菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的最適條件不一致，這種情況下通常采用分階段調(diào)控的策略，最大程度的同時(shí)滿足菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成需要。

選擇初始的NaCl濃度為200 g/L，在發(fā)酵20 h，40 h和60 h分別補(bǔ)加NaCl至220 g/L，發(fā)酵140 h時(shí)結(jié)束并測(cè)定結(jié)果，如表2所示。

由表2中的數(shù)據(jù)分析可知，選擇初始200 g/L NaCl濃度，在發(fā)酵20 h，40 h和60 h分別補(bǔ)加NaCl至220 g/L后，發(fā)酵至140 h測(cè)得HEMF最終發(fā)酵產(chǎn)量分別為76.79 mg/L，98.11 mg/L和89.28 mg/L?？梢?jiàn)，利用兩階段添加NaCl策略在發(fā)酵40 h時(shí)補(bǔ)加NaCl在保證最大菌體濃度的同時(shí)，HEMF產(chǎn)量最高。

2.3 添加不同氨基酸對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF影響

Ohata等［3］利用13C同位素示蹤方法發(fā)現(xiàn)酵母菌發(fā)酵產(chǎn)HEMF的形成機(jī)制，主要是由戊糖和游離氨基酸通過(guò)美拉德反應(yīng)后的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)酵母菌產(chǎn)生的酶作用后形成HEMF。因此，氨基酸的添加對(duì)HEMF的合成有影響。為了考察氨基酸對(duì)C.etchellsii合成HEMF的影響，選擇200 g/L NaCl為條件，分別選擇20種游離氨基酸為氨基酸源對(duì)其產(chǎn)HEMF進(jìn)行研究，在發(fā)酵140 h時(shí)對(duì)其菌體濃度和HEMF含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。

圖2 添加不同氨基酸對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF影響結(jié)果

由圖2中20種游離氨基酸對(duì) C.etchellsii產(chǎn)HEMF影響結(jié)果可知，除酪氨酸(Tyr)對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF有抑制作用外，其他19種氨基酸對(duì)其產(chǎn)HEMF均有不同程度的促進(jìn)作用，其中，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)和賴氨酸(Lys)的促進(jìn)作用最明顯，在這4種條件下，HEMF的產(chǎn)量分別為76.77 mg/L、97.85 mg/L、88.45 mg/L 和 67.11 mg/L。

以添加不同氨基酸對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF影響為基礎(chǔ)，選擇200 g/L NaCl濃度，進(jìn)一步考慮不同種類的氨基酸組合對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF的影響。選取單個(gè)添加中產(chǎn)量較高的丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)和賴氨酸(Lys)為氨基酸源，對(duì)其進(jìn)行組合，在發(fā)酵140 h時(shí)對(duì)其菌體濃度和HEMF含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

表3 氨基酸組合添加對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF影響結(jié)果

由表3中的數(shù)據(jù)分析可知，氨基酸組合對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF有不同的影響，其中 Ala+Arg+Gly組合中HEMF產(chǎn)量和對(duì)菌體的產(chǎn)物得率最高，分別為101.74 mg/L和8.76 mg/g。而Ala+Arg+Gly+Lys組合中的HEMF產(chǎn)量和對(duì)菌體的產(chǎn)物得率也較高，分別為101.41 mg/L和8.65 mg/g，與Ala+Arg+Gly組合中差別不大，由于考慮到實(shí)際操作的可行性和簡(jiǎn)便性，因此可以確定Ala+Arg+Gly組合可以更好地促進(jìn)C.etchellsii產(chǎn)HEMF。

2.4 NaCl分階段調(diào)控結(jié)合氨基酸添加對(duì)C.etchellsii生產(chǎn)HEMF影響

為了進(jìn)一步強(qiáng)化 HEMF的發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度，將NaCl分階段調(diào)控與氨基酸添加結(jié)合應(yīng)用。選擇200 g/L NaCl為條件，根據(jù)2.2中的研究結(jié)果分別在40 h和60 h補(bǔ)加NaCl至220 g/L。氨基酸源選用Ala+Arg+Gly組合，在發(fā)酵140 h時(shí)對(duì)其菌體濃度和HEMF含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

表4 兩階段NaCl添加策略和氨基酸組合添加策略結(jié)合對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF影響結(jié)果

由表4中的結(jié)果分析可知，兩階段NaCl添加策略和氨基酸組合添加策略結(jié)合對(duì) C.etchellsii產(chǎn)HEMF均有不同程度的促進(jìn)作用，其中在發(fā)酵40 h時(shí)添加NaCl至220 g/L，并結(jié)合Ala+Arg+Gly組合時(shí)，C.etchellsii產(chǎn)HEMF和對(duì)菌體的產(chǎn)物得率最高，分別為110.74 mg/L和9.51 mg/g。

2.5 7 L發(fā)酵罐驗(yàn)證2種添加策略對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF影響

為了驗(yàn)證兩階段NaCl添加策略和氨基酸組合添加策略相結(jié)合對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF影響，在7 L發(fā)酵罐上對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF進(jìn)行驗(yàn)證研究，結(jié)果如圖3所示。

圖3 兩階段NaCl添加策略和氨基酸組合添加對(duì)C.etchellsii產(chǎn)HEMF上罐驗(yàn)證結(jié)果

由圖3中的過(guò)程曲線可知，發(fā)酵40 h時(shí)C.etchellsii生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，最大菌體濃度為10.91 g/L，在100 h HEMF產(chǎn)率最大，為121.51 mg/L，比空白(200 g/L NaCl且沒(méi)有添加氨基酸，圖3中未標(biāo)明)提高了21.2倍。

3 討論

實(shí)驗(yàn)以1株增香酵母菌C.etchellsii為研究對(duì)象，研究了在不同鹽度和添加不同種類氨基酸條件下，C.etchellsii菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物HEMF合成的情況。

由結(jié)果分析可知，發(fā)酵體系中添加200 g/L和220 g/L NaCl利于 C.etchellsii合成 HEMF，當(dāng) NaCl濃度增加到240 g/L時(shí)不利于菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物HEMF的生成。分析原因是菌體細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境與菌體生長(zhǎng)密切相關(guān)，由于C.etchellsii篩選自高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中，該類型醬油中的NaCl濃度為180～240 g/L，因此，經(jīng)過(guò)高鹽度環(huán)境的馴化，C.etchellsii已經(jīng)適應(yīng)在高濃度NaCl環(huán)境中生長(zhǎng)。但是，當(dāng)NaCl濃度過(guò)高(≥240 g/L)時(shí)，超過(guò)了C.etchellsii的適應(yīng)極限，此時(shí)菌體生長(zhǎng)緩慢，菌體濃度較小。因此，采取分階段調(diào)控NaCl濃度的策略，可在保證C.etchellsii正常生長(zhǎng)的同時(shí)獲得高產(chǎn)量的HEMF。而根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［8］，高鹽度環(huán)境利于HDMF和HEMF等呋喃酮類物質(zhì)的形成，根據(jù)C.etchellsii生長(zhǎng)的高鹽度環(huán)境猜測(cè)原因可能是在適合菌體生長(zhǎng)的環(huán)境下，高鹽度使得菌體細(xì)胞膜的通透性結(jié)構(gòu)有所改變，對(duì)底物的利用具有更高的選擇性，使得其代謝向利于HEMF生成的方向進(jìn)行。氨基酸作為C.etchellsii代謝產(chǎn)HEMF的前體物質(zhì)，在HEMF的產(chǎn)生過(guò)程中起重要作用，因此選擇不同種類和不同類別的氨基酸組合對(duì)于HEMF的生成是很重要的，通過(guò)研究結(jié)果可知，選擇Ala+Arg+Gly組合更利于HEMF的生成，這可能是C.etchellsii菌體內(nèi)源性形成這3種氨基酸的效率較低，需外援補(bǔ)充以滿足HEMF合成的需要。當(dāng)三者以合適的比例組合添加到發(fā)酵體系中時(shí)，對(duì)C.etchellsii菌體內(nèi)HEMF的合成產(chǎn)生了協(xié)同促進(jìn)效應(yīng)，從而提高了HEMF的產(chǎn)量。

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