解芳 靳小雷 徐家杰 盧建建 張超 曾海峰 許美邦 田甜 滕利

體內(nèi)構(gòu)建組織工程骨的示蹤觀察：CM-DiI長(zhǎng)效示蹤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性研究

解芳 靳小雷 徐家杰 盧建建 張超 曾海峰 許美邦 田甜 滕利

目的 探索組織工程骨體內(nèi)成骨時(shí)，CM-DiI長(zhǎng)效示蹤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性，為種子細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸研究提供標(biāo)記方法。方法 分離比格犬BMSCs，成骨誘導(dǎo)至第2代，用熒光染料CM-DiI進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記。熒光倒置顯微鏡觀察標(biāo)記后的細(xì)胞形態(tài)，MTT比色法測(cè)定標(biāo)記前后BMSCs的增殖狀況，檢測(cè)標(biāo)記前后Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）、骨鈣素（BGLAP）和骨黏連蛋白（SPARC）的表達(dá)。最后，CM-DiI熒光標(biāo)記后的BMSCs與β-TCP復(fù)合共培養(yǎng)后植入比格犬背部皮下，8周后取材，熒光顯微鏡下觀察BMSCs體內(nèi)轉(zhuǎn)歸，HE染色觀察異位成骨情況。結(jié)果CM-DiI標(biāo)記后早期細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，48 h后熒光增強(qiáng)，72 h內(nèi)熒光強(qiáng)度無(wú)明顯減弱。BMSCs在CM-DiI標(biāo)記前后細(xì)胞形態(tài)基本一致，兩組間細(xì)胞的增殖率無(wú)明顯差別；標(biāo)記后RT-PCR檢測(cè)Col-Ⅰ、BMP-2、BGLAP、SPARC表達(dá)，顯示標(biāo)記后的BMSCs亦可向成骨方向分化。掃描電鏡檢測(cè)到標(biāo)記后細(xì)胞在β-TCP上增殖良好，細(xì)胞基質(zhì)分泌豐富。細(xì)胞-支架復(fù)合物植入比格犬皮下，8周后熒光顯微鏡觀察到標(biāo)記細(xì)胞仍存在，且HE染色可見(jiàn)支架孔隙中有類(lèi)骨基質(zhì)沉積。結(jié)論 CM-DiI對(duì)BMSCs的生長(zhǎng)增殖、成骨分化無(wú)明顯影響，對(duì)體內(nèi)組織工程骨中BMSCs的示蹤時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)8周，可用作體內(nèi)細(xì)胞的長(zhǎng)效示蹤劑。

組織工程骨 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 異位成骨 CM-DiI

種子細(xì)胞是組織工程骨的重要組成部分，BMSC是一種比較理想的骨組織工程種子細(xì)胞，體外二維培養(yǎng)已不能滿足研究的需要，與支架材料三維共培養(yǎng)構(gòu)建組織工程骨已日益成為研究熱點(diǎn)。但目前還未有較好的體內(nèi)外源性細(xì)胞的示蹤方法。而具有生物活性的熒光染料可作為示蹤劑在激發(fā)光下顯示細(xì)胞形態(tài)，并可顯示細(xì)胞與支架材料植入體內(nèi)后較長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞生長(zhǎng)分布情況。

CM-DiI（1,1'-d ioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）是一種熒光活性染料。研究顯示，CM-DiI無(wú)細(xì)胞毒性，不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，在549 nm激發(fā)光下可產(chǎn)生發(fā)射波長(zhǎng)為565 nm的紅色熒光[1]。

本研究主要觀察CM-DiI對(duì)犬BMSCs體外生長(zhǎng)增殖、成骨分化的影響，以及標(biāo)記后的BMSCs與支架材料復(fù)合共培養(yǎng)植入體內(nèi)，在皮下異位成骨部位示蹤BMSCs的生物學(xué)轉(zhuǎn)歸情況及對(duì)體內(nèi)成骨的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

普通級(jí)成年比格犬4只[許可證號(hào)：SCXK(京)2007-0005]，體質(zhì)量 10～13 Kg，雌雄不限，經(jīng)北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)檢站檢測(cè)，由瑪斯公司提供，于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的規(guī)定。

CM-DiI（Molecular Probes 公司，美國(guó)）；Ficoll-Paque Plus液（Amersham Biosciences公司，美國(guó)）；地塞米松、β-磷酸甘油鈉、L-2-磷酸抗壞血酸（Sigma公司，美國(guó)）；DMEM低糖培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、Hanks液、胰蛋白酶、EDTA（HyClone 公司，美國(guó)）；RT-PCR 試劑盒（Promega 公司，美國(guó)）；MTT（Servar公司，美國(guó)）；β-TCP（上海貝奧路生物材料有限公司）。

倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；倒置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)（Leica公司，德國(guó)）；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（UVP公司，美國(guó)）；掃描電鏡（Philips公司，荷蘭）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 比格犬BMSC的分離培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)

犬麻醉后常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，于髂后上棘穿刺抽取骨髓液10 mL，加入含3 000 U肝素的50 mL無(wú)菌離心管中。取3 mL肝素化的骨髓液，加入Hank's液3 mL，制成6 mL稀釋骨髓液。分別取3 mL 1.077 g/mL Ficoll液，加入4只15 mL離心管中，小心加入6 mL稀釋骨髓液，2 000 r/min離心20 min；有核細(xì)胞形成白色云霧狀的分層界面，小心吸取該細(xì)胞層，用含10%胎牛血清的DMEM以1 000 r/min離心5 min，共2遍，細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液按照12×104cells/cm2的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿，加入含10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、50 μmol/L L-2-磷酸抗壞血酸的DMEM成骨條件培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天換液1次，第7天細(xì)胞達(dá)80%融合后傳第1代，第9天傳第2代。具體方法參見(jiàn)前期研究[2]。

1.2.2 CM-DiI標(biāo)記BMSCs的體外觀察

CM-Dil用質(zhì)量濃度為100%的DMSO溶解制成1.0 g/L工作液并過(guò)濾。取第2代成骨誘導(dǎo)的BMSCs，均分為兩組，隨機(jī)取一組進(jìn)行熒光標(biāo)記，在培養(yǎng)皿中加入5μg/mL CM-DiI溶液（由5μL工作液溶于1 mL PBS制得）2～3 mL。在37℃、5%CO2孵箱中恒溫靜置5 min，在4℃冰箱中靜置15 min。吸出CM-DiI，用PBS洗滌2次，加入成骨條件培養(yǎng)液后置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察48 h后細(xì)胞熒光強(qiáng)度及形態(tài)變化。

1.2.3 標(biāo)記前后BMSCs的增殖情況

MTT比色法測(cè)定標(biāo)記前后第2代BMSCs的增殖情況。將標(biāo)記CM-DiI與未標(biāo)記CM-DiI的BMSCs胰蛋白酶-EDTA消化后制成細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，加成骨條件培養(yǎng)基200 μL，每組 3個(gè)復(fù)孔，放置于 37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng) 1 d、3 d、5 d、7 d 和 9 d，棄上清，每孔加入20 μL MTT工作液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。震蕩5 min，以波長(zhǎng)492 nm在酶標(biāo)儀上比色，測(cè)定吸光度OD值。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原、骨黏連蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和骨鈣素的表達(dá)

分別收集第1、2代標(biāo)記及未標(biāo)記的成骨誘導(dǎo)BMSCs，Trizol液提取總RNA后，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、骨粘連蛋白（SPARC）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、骨鈣素（BGLAP）的表達(dá)。 RT反應(yīng)條件：65℃、5 min，37℃、2 min，37℃、60 min，70 ℃、15 min；PCR 反應(yīng)條件：94 ℃、30 sec，55℃、30 sec，72℃、45 sec，共 30個(gè)循環(huán)，68℃、延伸5 min。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.5 細(xì)胞-支架復(fù)合物的構(gòu)建及電鏡檢測(cè)

將β-TCP加工成5 mm×5 mm×3 mm的長(zhǎng)方體，將成骨誘導(dǎo)并用CM-DiI標(biāo)記的第2代BMSCs制成20×106cells/mL濃度的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液均勻滴加于材料表面，放置于含培養(yǎng)基的15 mL離心管中，800 r/min離心，以使細(xì)胞與材料復(fù)合均勻。放置于12孔板中靜置4 h，于37℃、5%C02條件下培養(yǎng)。4 h后自培養(yǎng)皿周邊緩慢加入2 mL成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，其后隔日換液一次，復(fù)合共培養(yǎng)3～7 d，備用。

在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞在材料表面包括孔隙內(nèi)壁的附著、生長(zhǎng)和增殖情況。復(fù)合培養(yǎng)第3、7天后的BMSCs-TCP標(biāo)本分別用2.5%戊二醛磷酸緩沖液（pH 7.4）固定 24 h（4 ℃冰箱），PBS 洗滌 3 次，70%、80%、90%、100%的乙醇梯度脫水，浸入醋酸異戊酪，臨界點(diǎn)干燥，鍍金膜，掃描電鏡下觀察細(xì)胞在材料表面的附著生長(zhǎng)情況。

1.2.6 比格犬背部皮下植入細(xì)胞-支架復(fù)合物及BMSCs的示蹤觀察

比格犬禁食12 h后，鹽酸氯胺酮/速眠新以0.12 mL/Kg劑量肌注麻醉后，與犬背部正中線作縱形切口，血管鉗向兩側(cè)分離至脂肪層淺層，形成皮下腔隙，將細(xì)胞-支架復(fù)合物用生理鹽水沖洗表面的培養(yǎng)基后，放入皮下腔隙中。逐層關(guān)閉切口，分層縫合。術(shù)后3 d每天肌肉注射青霉素鈉80萬(wàn)U。術(shù)后8周麻醉動(dòng)物，取出移植的復(fù)合物，一部分以30%甲酸脫鈣，石蠟包埋切片，HE染色觀察其成骨情況；另一部分以10%甲醛溶液固定3 d，8%EDTA脫鈣2～3 周后（每 2～3 天更換脫鈣液），制作 25 μm 厚冰凍切片，用DAPI染液染核8 min，熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記的情況。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，組間均數(shù)比較行一維方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 犬BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)增殖及成骨分化情況

原代培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞形態(tài)由稀疏時(shí)的多角形變?yōu)榧忓N狀，原代培養(yǎng)7 d后，成纖維細(xì)胞樣集落形成單位（CFU-F）生長(zhǎng)密集，細(xì)胞呈梭形漩渦狀密集排列，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，集落中心出現(xiàn)較密的多邊形細(xì)胞，需進(jìn)行消化傳代。傳代后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入快速增殖期，且細(xì)胞體積逐漸增大，細(xì)胞數(shù)逐漸增多。

2.2 CM-DiI標(biāo)記BMSCs的體外觀察

應(yīng)用CM-DiI標(biāo)記第2代BMSCs后，置于倒置相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞仍呈梭形，生長(zhǎng)良好，細(xì)胞透光性好，形態(tài)完整（圖1）；熒光顯微鏡下可見(jiàn)被標(biāo)記細(xì)胞均發(fā)出紅色熒光（圖2）。在體外培養(yǎng)48 h后細(xì)胞中熒光增強(qiáng)，在72h內(nèi)無(wú)明顯變化。體外繼續(xù)培養(yǎng)后細(xì)胞可連續(xù)再傳代，提示細(xì)胞穩(wěn)定性好。

2.3 細(xì)胞增殖情況測(cè)定

MTT檢測(cè)結(jié)果表明，CM-DiI標(biāo)記與未標(biāo)記的細(xì)胞在培養(yǎng)第 1、3、7、9 天無(wú)顯著性差異，P>0.05；但第5天兩組結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05（表2），兩者的生長(zhǎng)增殖趨勢(shì)基本一致。

2.4 RT-PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原、骨黏連蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨鈣素的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，CM-DiI標(biāo)記及未標(biāo)記的第1、2代成骨誘導(dǎo)后 BMSCs均有 Col-Ⅰ、SPARCBMP-2和BGLAP的表達(dá)（圖4），故選用第2代標(biāo)記的BMSCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 細(xì)胞支架復(fù)合共培養(yǎng)及電鏡檢測(cè)結(jié)果

BMSCs/β-TCP復(fù)合物共培養(yǎng)3 d后，可見(jiàn)細(xì)胞伸展?fàn)顟B(tài)良好，細(xì)胞分散黏附于β-TCP孔隙邊緣（圖4A）。復(fù)合物共培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞明顯增多，可見(jiàn)支架材料孔隙大部分由細(xì)胞占據(jù)，細(xì)胞在孔隙中生長(zhǎng)增殖情況良好（圖4B）。

BMSCs/β-TCP復(fù)合共培養(yǎng)3 d后，在掃描電鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)飽滿，周?chē)梢?jiàn)少量細(xì)胞外基質(zhì)（圖5A）。復(fù)合共培養(yǎng)7 d后材料孔隙中的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞大多為梭形，排列較為規(guī)則，向四周伸出偽足，偽足之間互相融合，周?chē)梢?jiàn)大量的細(xì)胞外基質(zhì)（圖5B）。

圖1 比格犬第2代BMSCs組織學(xué)觀察（倒置相差顯微鏡，200×）Fig.1 Histological observation of BMSCs(P2)of Beagle dogs after being osteoblast-induced(inverted phase contrast microscope,200×)

2.6 組織工程骨皮下成骨及BMSCs體內(nèi)示蹤結(jié)果

術(shù)后8周，于比格犬皮下取材后行HE染色可見(jiàn)，β-TCP支架材料尚未完全降解，支架材料的孔隙邊緣有紅色的骨基質(zhì)沉積，骨基質(zhì)內(nèi)側(cè)有纖維結(jié)締組織浸入，孔隙之間的交通良好（圖6）。

熒光顯微鏡下觀察，相應(yīng)成骨區(qū)域可見(jiàn)胞漿紅色的細(xì)胞，幾乎所有標(biāo)記紅色熒光的細(xì)胞核重復(fù)被DAPI染色，兩者重疊表達(dá)（圖7）。

圖2 CM-DiI標(biāo)記的比格犬第2代BMSCs組織學(xué)觀察（熒光顯微鏡，200×）Fig.2 Histological observation of BMSCs(P2)of Beagle dogs after being labeled with CM-DiI(fluorescence microscope,200×)

表2 CM-DiI標(biāo)記后與未標(biāo)記組BMSCs的MTT檢測(cè)結(jié)果Table 2 The results of MTT assay in CM-DiI labeled group and unlabeled group of BMSCs

圖3 RT-PCR檢測(cè)ColⅠ、SPARC、BMP-2和BGLAP的表達(dá)Fig.3 The expression of ColⅠ,SPARC,BMP-2 and BGLAP tested by RT-PCR

圖4 CM-DiI標(biāo)記后BMSCs在支架材料上的生長(zhǎng)情況(倒置相差顯微鏡)Fig.4 The growth of CM-DiI labeled BMSCs after being seeded on the scaffold(inverted phase contrast microscope)

圖5 CM-DiI標(biāo)記后BMSCs在支架材料上的生長(zhǎng)情況（掃描電鏡）Fig.5 The growth of CM-DiI labeled BMSCs after being seeded on the scaffold(SEM)

圖6 8周后取材行HE染色觀察組織工程骨的異位成骨情況（倒置相差顯微鏡，50×）Fig.6 The ectopic osteogenesis of tissue engineered bone in vivo showed by HE staining after harvested on the 8th week(inverted phase contrast microscope,50×)

圖7 8周后取材熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)幾乎所有標(biāo)記紅色熒光的細(xì)胞核重復(fù)被DAPI染色，兩者重疊表達(dá)（熒光顯微鏡，200×）Fig.7 The fluorescent microscope showed cells with red fluorescence in cytoplasm and with blue fluorescence in nucleus by DAPI staining,the area with red fluorescence was corresponding with the area of ectopic osteogenesis(fluorescence microscope,200×)

3 討論

種子細(xì)胞是組織工程骨的關(guān)鍵要素之一，深入研究種子細(xì)胞在體內(nèi)微環(huán)境中的生物學(xué)轉(zhuǎn)歸是研究組織工程骨的重要基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)常用的干細(xì)胞體內(nèi)示蹤方法包括：①質(zhì)粒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等載體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)；②5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）；③超順磁性氧化鐵（SPIO）；④熒光量子點(diǎn)（QDs）等[3-6]。但這些方法步驟繁瑣，增加了實(shí)驗(yàn)的難度及風(fēng)險(xiǎn)。為了找到一種簡(jiǎn)便易行、重現(xiàn)性高的染色方法，本實(shí)驗(yàn)采用CM-DiI對(duì)BMSCs進(jìn)行標(biāo)記，并觀察體內(nèi)外的標(biāo)記效果以及對(duì)細(xì)胞的影響。

CM-DiI是一種親脂性羰花青染料，因此易嵌入生物質(zhì)膜內(nèi)作側(cè)向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，從而標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞膜，并且還可以通過(guò)活體細(xì)胞的胞飲作用進(jìn)入胞漿，也標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞漿。在549 nm激發(fā)光下可以產(chǎn)生發(fā)射波長(zhǎng)為565 nm的紅色熒光[7]。1986年，Honig等[7]首次報(bào)道DiI可作為體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的熒光示蹤劑。隨后又有CM-DiI標(biāo)記肝細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、羊膜干細(xì)胞等相關(guān)報(bào)道出現(xiàn)[8-11]。以往研究顯示，CM-DiI在體內(nèi)外均不能被代謝，對(duì)活體細(xì)胞無(wú)毒性。在體內(nèi)不存在CM-DiI于細(xì)胞間的滲透，對(duì)這些分裂能力較強(qiáng)的細(xì)胞標(biāo)記效果優(yōu)良,對(duì)被標(biāo)記細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)無(wú)影響[12]。但尚未有報(bào)道顯示，CM-DiI是否對(duì)BMSCs的成骨分化造成影響。

本實(shí)驗(yàn)成功分離比格犬BMSCs，可在體外大量擴(kuò)增，并向成骨方向誘導(dǎo)，可以滿足組織工程骨構(gòu)建的需求。CM-DiI標(biāo)記BMSCs的方法操作簡(jiǎn)便快捷，標(biāo)記后即刻通過(guò)熒光顯微鏡觀察，顯示BMSCs形態(tài)良好，CM-DiI標(biāo)記前后的細(xì)胞形態(tài)基本一致，呈現(xiàn)紅色熒光，48 h后細(xì)胞膜中紅色熒光顆粒增多，熒光增強(qiáng)，在72 h內(nèi)無(wú)明顯變化。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)標(biāo)記組與未標(biāo)記DiI組相比，除第5天外，第 1、3、7、9 天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），兩者的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明CM-DiI不影響B(tài)MSCs的生長(zhǎng)增殖，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。

通過(guò)RT-PCR檢測(cè)標(biāo)記前后成骨特異性蛋白Col-I、BMP-2、ON、BGLAP 的表達(dá)，顯示 BMSCS 的成骨分化未受明顯影響。說(shuō)明CM-DiI可以滿足體外細(xì)胞標(biāo)記的基本需求。

最后，將體外構(gòu)建的組織工程骨移植于比格犬背部皮下，術(shù)后8周仍能觀察到CM-DiI標(biāo)記的BMSCs在移植部位均勻分布。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在冰凍切片的過(guò)程中組織干燥易導(dǎo)致CM-DiI熒光衰減，所以標(biāo)本固定后不宜脫水處理，且要用甘油磷緩封片以防組織干燥，另外，CM-DiI染色不宜用酒精脫水。為了驗(yàn)證切片上的熒光來(lái)自移植的BMSCs而不是組織的自發(fā)熒光，進(jìn)行了DAPI染色。結(jié)果顯示，DAPI染色與紅色熒光重疊在一起，提示觀察到的具有細(xì)胞形態(tài)的熒光即為移植體內(nèi)的BMSCs，并且與HE染色的成骨區(qū)域重合，說(shuō)明植入的BMSCs可以在選擇部位定居下來(lái)且存活良好，進(jìn)一步證實(shí)了CM-DiI在體內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)示蹤BMSCs的可行性。

總之，CM-DiI對(duì)BMSCs的生長(zhǎng)增殖、成骨分化無(wú)明顯影響，對(duì)體內(nèi)組織工程骨中BMSCs的示蹤可長(zhǎng)達(dá)8周，可用作體內(nèi)細(xì)胞的長(zhǎng)效示蹤劑，為研究組織工程骨種子細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)轉(zhuǎn)歸提供了一種方便快捷且相對(duì)經(jīng)濟(jì)的長(zhǎng)效示蹤方法。

[1]Swift MJ,Crago PE,Grill WM,et al.Applied electric fields accelerate the diffusion rate and increase the diffusion distance of DiI in fixed tissue[J].J Neurosci Methods,2005,141(1):155-163.

[2]解芳,滕利,曹誼林,等.犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離純化和成骨誘導(dǎo)分化：Ficoll液密度梯度離心法體外分離的可行性[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(6):951-956.

[3]Yang HN,Park JS,Na K,et al.The use of green fluorescence gene(GFP)-modified rabbit mesenchymal stem cells(rMSCs)co-cultured with chondrocytes in hydrogel constructs to reveal the chondrogenesis of MSCs[J].Biomaterials,2009,30(31):6374-6385.

[4]Lequeux C,Mojallal A,Damour O,et al.Adipose derived stem cells:efficiency,toxicity,stability of BrdU labeling and effects on self-renewal and adipose differentiation[J].Mol Cell Biochem,2011,351(1-2):65-75.

[5]Ju S,Teng G,Zhang Y,et al.In vitro labeling and MRI of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood[J].Magn Reson Imaging,2006,24(5):611-617.

[6]Higuchi Y,Wu C,Chang KL,et al.Polyamidoamine dendrimerconjugated quantum dots for efficient labeling of primary cultured mesenchymal stem cells[J].Biomaterials,2011,32(28):6676-6682.

[7]Honig MG,Hume RI.Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures[J].J Cell Biol,1986,103(1):171-187.

[8]Miki R,Yoshida T,Murata K,et al.Fate maps of ventral and dorsal pancreatic progenitor cells in early somite stage mouse embryos[J].Mech Dev,2012,128(11-12):597-609.

[9]Sun X,Chen M,Li J,et al.E13.5 retinal progenitors induce mouse bone marrow mesenchymal stromal cells to differentiate into retinal progenitor-like cells[J].Cytotherapy,2011,13(3):294-303.

[10]Choi YS,Dusting GJ,Stubbs S,et al.Differentiation of human adipose-derived stem cells into beating cardiomyocytes[J].J Cell Mol Med,2010,14(4):878-889.

[11]Cheglakov IB,Rytenkov AN,Yarygin KN,et al.Vital dye dil and fluorescent magnetic microparticles do not affect the phenotype of mesenchymal stem cells from human amnion and their differentiation capacity[J].Bull Exp Biol Med,2008,145(4):504-510.

[12]張?jiān)扑?高建華,魯峰,等.熒光活性染料DiI標(biāo)記人脂肪干細(xì)胞[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2007,11(15):2897-2899.

[13]韓明子,鄒亞男,趙憲琪,等.DiI熒光示蹤劑在小鼠骨髓細(xì)胞肝內(nèi)移植中的研究[J].中華器官移植雜志,2003,24(4):251.

The Study on Biological Change of BMSCs During the Osteogenesis of Tissue-Engineered Bone in Vivo:the Feasibility of CM-DiI as a Long-Term Tracer of BMSCs

XIE Fang,JIN Xiaolei,XU Jiajie,LU Jianjian,ZHANG Chao,ZENG Haifeng,XU Meibang,Tian Tian,TENG Li.Plastic Surgery Hospital,Peking Union Medical College&Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100144,China.

TENG Li(E-mail:zzyytl@yahoo.com.cn).

ObjectiveTo investigate the feasibility of CM-DiI on long-term tracing the biological change of bone mesenchymal stem cells(BMSCs)during osteogenesis of tissue engineered bone (TEB)in vivo,and to offer an alternative labeling method for tracing seed cells in vivo in future.MethodsAfter BMSCs were separated from bone marrow in Beagle dogs and osteo-induced to the second generation (P2),the cells were labeled with the fluorescent dye CM-DiI.The morphologic change of BMSCs after labeling was observed by fluorescence convert microscope.The proliferative ability was tested by MTT colorimetric between the labeling and un-labeling groups.The expression of Collagen I,BMP-2,BGLAP,and SPARC were detected through RT-PCR between the two groups.Lastly,CM-DiI-labeling BMSCs and beta-TCP were cocultured into TEB which was implanted subcutaneously into Beagle dogs.Eight weeks later,the implant was harvested and the biological change of BMSCs was observed by fluorescence convert microscope.At the same time,the ectopic osteogenesis of the TEB was tested by HE staining.ResultsShortly after being labeled with CM-DiI,ringlike red fluorescence was present in the cytoplasm of BMSCs.48 hours later,the fluorescence was enhanced and was not weaken during 72 hours.The morphology of labeled BMSCs was consistent with unlabeled ones.There was no significant difference in the proliferative ability between the labeled and unlabeled groups.The expression of Col-Ⅰ,BMP-2,BGLAP,SPARC revealed that the CMDiI labeled BMSCs were induced into osteoblasts successfully either.After seeding into β-TCP,the proliferation of labeled BMSCs was normal and abundant extracellular matrix (ECM)was observed in the pores of the ceramic by scanning electron microscope (SEM).After harvesting the composite of labeled cells and ceramic 8 weeks later,the cells with red fluorescence were observed by fluorescent microscope.HE staining revealed deposited osteoid in the pores of ceramic.ConclusionCMDiI has no obvious impact on the growth,proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs.The BMSCs in the composite of TEB could be traced as long as 8 weeks.It suggests a feasible method in monitoring of cells in vivo.

Tissue engineered bone;Bone mesenchymal stem cells;Ectopic osteogenesis;CM-DiI

Q813.1+1

A

1673－0364（2012）04－0195－06

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.004

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金（5201020104）。

100144 北京市 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院。

滕利（E-mail：zxyytl@yahoo.com.cn）。

2012年6月8日；

2012年7月11日）