耿興超，洪敏，宋瑩，林志，張亮，李波，王軍志

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，陜西西安710032;2.中國食品藥品檢定研究院國家藥物評價(jià)監(jiān)測中心，北京100050;3.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006;4.博爾誠北京科技有限公司，北京100176)

雷公藤甲素對Wistar大鼠免疫毒性相關(guān)基因表達(dá)的影響

耿興超1，2，洪敏2，宋瑩3，林志2，張亮4，李波2，王軍志2

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，陜西西安710032;2.中國食品藥品檢定研究院國家藥物評價(jià)監(jiān)測中心，北京100050;3.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006;4.博爾誠北京科技有限公司，北京100176)

目的應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究雷公藤甲素對大鼠胸腺全基因表達(dá)譜的影響，從基因水平探討雷公藤甲素引起免疫抑制毒性的潛在分子作用機(jī)制。方法Wistar大鼠，連續(xù)28 d ig給予雷公藤甲素0.5和1.0 mg·kg－1以及環(huán)孢素A 20 mg·kg－1(陽性對照)，進(jìn)行T細(xì)胞依賴抗體反應(yīng)檢測、免疫器官組織病理學(xué)檢查和胸腺組織基因芯片實(shí)驗(yàn)。結(jié)果與溶媒對照組相比，雷公藤甲素0.5和1.0 mg·kg－1組和環(huán)孢素A組大鼠血清中T細(xì)胞依賴抗體應(yīng)答水平均受到了顯著抑制。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素1.0 mg·kg－1使胸腺皮髓質(zhì)淋巴細(xì)胞數(shù)量輕度減少，環(huán)孢素A使胸腺髓質(zhì)皮質(zhì)化?；蛐酒瑱z測結(jié)果顯示，雷公藤甲素1.0 mg·kg－1給藥第7天引起422個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其基因功能主要涉及DNA依賴的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、核轉(zhuǎn)運(yùn)、微管蛋白復(fù)合體裝配、核小體裝配、線粒體DNA轉(zhuǎn)錄、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和線粒體DNA復(fù)制等。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與移植排斥和自身免疫性疾病等多個(gè)與免疫抑制相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控途徑。結(jié)論雷公藤甲素1.0 mg·kg－1能夠引起大鼠胸腺基因表達(dá)譜的顯著性改變，其免疫毒性的主要機(jī)制可能是通過下調(diào)免疫毒性相關(guān)基因的表達(dá)，抑制淋巴細(xì)胞的增殖。

雷公藤內(nèi)酯;胸腺;免疫;毒性作用;基因表達(dá)譜

雷公藤甲素(triptolide)是從雷公藤中分離出的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，具有免疫抑制、抗炎、抗生育及抗腫瘤等多種生物活性［1］。雷公藤甲素大劑量能引起一系列的毒性反應(yīng)，包括肝、腎和免疫毒性等。其中，免疫毒性通常會引起機(jī)體免疫功能低下或發(fā)生障礙，導(dǎo)致多種繼發(fā)性感染(如敗血癥、肺炎、腦膜炎等)和腫瘤性病變等。雷公藤甲素引起免疫抑制毒性可能通過抑制T淋巴細(xì)胞增殖和白細(xì)胞介素2的產(chǎn)生，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞的凋亡，抑制樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞功能等［2］。然而雷公藤甲素的免疫抑制毒性在基因水平的作用機(jī)制還未見文獻(xiàn)報(bào)道。

近年來，已有使用基因組學(xué)技術(shù)研究免疫功能的報(bào)道［3］，通過研究與淋巴細(xì)胞分化、活化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、自我和非我識別、天然和獲得性免疫調(diào)控、免疫反應(yīng)種屬差異、自身免疫性疾病等相關(guān)基因的改變，增加對免疫過程和機(jī)制的理解。胸腺是非常敏感的靶器官［4］，當(dāng)暴露于免疫毒性物質(zhì)時(shí)，胸腺組織形態(tài)的變化以及基因的調(diào)控與免疫毒性的評價(jià)具有特定的關(guān)聯(lián)性，使用胸腺組織作為研究對象觀察基因表達(dá)譜的變化，對于研究免疫毒性藥物的免疫毒性產(chǎn)生機(jī)制具有重要作用和意義。

本研究通過觀察Wistar大鼠ig給予雷公藤甲素28 d的免疫毒性，探討大鼠胸腺基因表達(dá)譜的變化，分析免疫毒性相關(guān)的差異表達(dá)基因，同時(shí)結(jié)合其他免疫毒性評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)一步驗(yàn)證和闡明雷公藤甲素的免疫毒性作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、儀器和試劑

雷公藤甲素，批號:TTL01011，購自北京美迪克斯生物技術(shù)有限公司;玉米油，批號:20090210，購自秦皇島金海食品工業(yè)有限公司;鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)，批號:019K4762，購自美國Sigma公司;RNAlater樣品儲存液，批號:136259743，購自德國Qiagen公司;RNA擴(kuò)增與熒光標(biāo)記試劑盒，批號:0006088011，雜交試劑盒，批號:0006081570，大鼠8×60 K全基因組表達(dá)譜芯片，批號:0006077112，均購自美國Agilent公司。

SPECTRAmax-PLUS型酶標(biāo)儀為美國Molecular Devices公司產(chǎn)品;Nano Drop紫外分光光度計(jì)為美國Thermo Fisher科技公司產(chǎn)品;凝膠電泳儀為Elchrom公司產(chǎn)品;芯片雜交儀，G3微陣列芯片掃描儀為美國Agilent公司產(chǎn)品;Light Cycler?480實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)為瑞士羅氏公司產(chǎn)品。

1.2 動物、分組和給藥

Wistar大鼠，60只，雌性，體質(zhì)量170～220 g，SPF級，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號:SYXK(京)2006-0026。飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)動物室，溫度20～25℃，日溫差≤3℃，相對濕度40%～70%，換氣次數(shù)為10～20次·h－1，照明時(shí)間為12 h自動切換。大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為溶媒對照組、環(huán)孢素A 20 mg·kg－1(陽性對照)組、雷公藤甲素0.5和1.0 mg·kg－1組，每組15只;每天1次、連續(xù)28 d ig給藥，溶媒對照組ig給予溶媒玉米油。

1.3 T細(xì)胞依賴抗體的檢測

假期時(shí)，很多尼姑和陳蓮曲珠一樣，會為信眾念經(jīng)祈福，或者組織信眾教授藏文、宣講一些與“構(gòu)建和諧社會、維護(hù)藏區(qū)穩(wěn)定”“和諧寺觀教堂創(chuàng)建工作”等相關(guān)政策相宜的佛教教義。

1.4 組織病理學(xué)檢查

雷公藤甲素組大鼠分別于第7，14和28天剖解，每次5只，分別取胸腺、脾、腸系膜淋巴結(jié)和胸骨用10%甲醛固定，修塊取材，逐級乙醇脫水，石蠟包埋，滑動切片機(jī)切片，經(jīng)HE染色，光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.5 基因芯片法檢測大鼠胸腺組織相關(guān)基因表達(dá)

對第7天雷公藤甲素1.0 mg·kg－1引起的422個(gè)基因進(jìn)行GO功能注釋及富集度分析，如表2所示，主要差異表達(dá)基因的基因功能涉及DNA依賴的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、核轉(zhuǎn)運(yùn)、微管蛋白復(fù)合體裝配、核小體裝配、線粒體DNA轉(zhuǎn)錄、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和線粒體DNA復(fù)制等功能。對第7天環(huán)孢素A的228個(gè)基因進(jìn)行功能注釋及富集度分析，發(fā)現(xiàn)主要差異表達(dá)基因的基因功能則主要涉及免疫反應(yīng)、免疫球蛋白分泌、T細(xì)胞增殖、B細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等幾個(gè)方面。

第7和第14天大鼠剖檢后，迅速分離小部分胸腺組織，按照1∶10體積比加入RNAlater樣品儲存液，整個(gè)過程注意避免RNA的降解，4℃下讓RNAlater樣品儲存液充分滲透組織24 h后，置于－80℃長期保存。

1.5.2 RNA提取、體外逆轉(zhuǎn)錄和表達(dá)探針的制備

每組3個(gè)樣本，按照Trizol試劑按照說明書提取樣品總RNA，使用紫外分光儀進(jìn)行總RNA定量，保證RNA樣品的純度，使用瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA完整性。將質(zhì)量合格的RNA按照RNA擴(kuò)增與熒光標(biāo)記試劑盒說明擴(kuò)增得到Cy3標(biāo)記的cRNA。

1.5.3 基因芯片雜交和掃描、圖像采集及數(shù)據(jù)分析

最后，在新疆南路被堵截的情況下，急需在北路設(shè)立一個(gè)新疆與內(nèi)地之間的中轉(zhuǎn)站。“左宗棠從俄國買糧取道布倫托海，為了糧食的護(hù)運(yùn)調(diào)遣西征捷勇馬隊(duì)三營統(tǒng)領(lǐng)補(bǔ)用總兵馮桂增移駐沙灣地方擇要駐扎，因?yàn)樯碁车胤接型ú紓愅泻５穆窂??！盵注]中國第一歷史檔案館編：《光緒朝朱批奏折》第113輯，中華書局，1996年版，第42頁。

使用上述提取的總RNA，根據(jù)SAM軟件分析結(jié)果，按照統(tǒng)計(jì)學(xué)的基因變化顯著性差異，選擇顯著性最大的7個(gè)基因作為代表性基因進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(表1)，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，以β肌動蛋白作為內(nèi)參照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測部分顯著性差異表達(dá)基因，以驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。

本文基于實(shí)踐，從構(gòu)建課程體系、準(zhǔn)確定位課程、豐富研修資源、轉(zhuǎn)變研修形式四個(gè)方面，梳理了“研修一體”背景下，區(qū)域教師職后教育課程的創(chuàng)新經(jīng)驗(yàn)。之所以稱其為創(chuàng)新，是因?yàn)樵谟伞敖萄小焙汀芭嘤?xùn)”向“研修一體”轉(zhuǎn)化的過程中，必須突破舊的思維定勢和常規(guī)戒律，而創(chuàng)新的本質(zhì)就是突破。這種突破的立足點(diǎn)是教師的專業(yè)成長，這種突破的載體是課程，這種突破的意義是探尋教師職后教育的專業(yè)化。

使用掃描儀掃描芯片上Cy3的熒光信號。芯片上每一點(diǎn)的信號強(qiáng)度代表了Cy3表達(dá)的cRNA與芯片雜交的信號強(qiáng)度。提取芯片數(shù)據(jù)，在2組大鼠中雜交信號值都超過800的基因判定為是有差異表達(dá)的基因，去除同一基因在不同樣本中信號值的CV值在0.15以下的基因，即把恒定表達(dá)的看家基因去掉，然后進(jìn)行非監(jiān)督聚類分析，用軟件分析兩組樣本之間的差異基因，其中倍數(shù)變化大于2，q＜0.05作為判斷基因差異表達(dá)的條件。然后使用超幾何分布對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能及富集度分析，并使用數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行通路分析。

1.5.4 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測差異表達(dá)基因

用Agilent雜交試劑盒與Agilent大鼠8×60 K表達(dá)譜芯片在Agilent雜交爐中65℃雜交17 h，然后洗滌芯片。

另取大鼠12只，分組同1.2，ig給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)2周后，于左后足跖部注射KLH 300 μg進(jìn)行免疫，注射體積為每只0.1 ml。繼續(xù)ig給藥至28 d后采血，將血清梯度稀釋，用ELISA方法檢測血清中抗KLH特異性IgG抗體，抗體水平用抗體終點(diǎn)滴度表示。

Tab.1 Primers for 7 differentially expressed genes by triptolide

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

8.“現(xiàn)代農(nóng)業(yè)+電子商務(wù)”上行創(chuàng)新。深入開展電子商務(wù)進(jìn)農(nóng)村綜合示范工程，在渝東17個(gè)區(qū)縣（自治縣）推進(jìn)國家級電子商務(wù)進(jìn)農(nóng)村綜合示范工程，在渝西12個(gè)涉農(nóng)區(qū)推進(jìn)市級電子商務(wù)進(jìn)農(nóng)村綜合示范工程。積極培育多元化農(nóng)村電子商務(wù)市場主體，鼓勵引導(dǎo)電商企業(yè)與合作社、種植養(yǎng)殖大戶等建立直采直供關(guān)系，推動農(nóng)產(chǎn)品線下流通與線上營銷融合發(fā)展，著力打造重慶地域特色的農(nóng)產(chǎn)品知名電商品牌，探索重慶特色的農(nóng)產(chǎn)品線下“上行”網(wǎng)銷模式。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤甲素對T細(xì)胞依賴抗體反應(yīng)的影響

圖1 T細(xì)胞依賴抗體反應(yīng)檢測結(jié)果顯示，KLH免疫14 d后，與溶媒對照組相比，雷公藤甲素0.5和1.0 mg·kg－1組和環(huán)孢素A組大鼠血清中抗KLH特異性IgG抗體應(yīng)答水平均受到顯著抑制(P＜0.01)，其中雷公藤甲素1.0 mg·kg－1對IgG抗體應(yīng)答水平明顯高于雷公藤甲素0.5 mg·kg－1(P＜0.01)。

Fig.1 Effect of triptolide on anti-keyhole limpet hemocyarin(KLH)IgG level in rat serum.Rats were ig given triptolide 0.5 and 1.0 mg·kg－1and cyclosporin A 20 mg·kg－1，once daily，for 28 d.On the 14th day，KLH 300 μg was injected at left foot of rats.After 28 d，blood was collected and IgG level were detected by ELISA.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group.##P＜0.01，compared with triptolide 0.5 mg·kg－1group.

2.2 雷公藤甲素對組織病理學(xué)的影響

對各種在制品解吸濕過程數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，結(jié)果見表1和表2。從表1和表2可以看出，對煙草在制品解吸濕過程平衡含水率建立二次多項(xiàng)式擬合模型，相對濕度和平衡含水率相關(guān)性表現(xiàn)為極顯著。對于每種煙草在制品，在40%～80%的相對范圍之內(nèi)，可求出任意與之對應(yīng)的平衡含水率。反之，設(shè)定每種煙草在制品需要的平衡含水率，可確定與之對應(yīng)的環(huán)境相對濕度。

給藥28 d后，正常對照組和雷公藤甲素0.5 mg·kg－1組大鼠多種組織器官均未見明顯組織病理學(xué)改變(圖2A);而雷公藤甲素1.0 mg·kg－1組大鼠的組織病理學(xué)檢查主要表現(xiàn)為胸腺皮髓質(zhì)淋巴細(xì)胞數(shù)量輕度減少(圖2B)，胸骨骨髓細(xì)胞數(shù)量輕度減少，脾出現(xiàn)代償性紅髓髓外造血;環(huán)孢素A組大鼠的組織病理學(xué)改變主要表現(xiàn)為胸腺髓質(zhì)皮質(zhì)化(圖2C)。

2.3 芯片檢測基因表達(dá)譜變化

Trizol試劑提取總RNA樣本，經(jīng)Nano Drop紫外分光儀檢測A260nm/A280nm均在1.9～2.0;甲醛變性凝膠電泳定性分析，結(jié)果可見清晰的28S和18S的RNA條帶，表明RNA沒有降解，純度較高，符合芯片實(shí)驗(yàn)要求。

Fig.2 Effect of triptolide on histopathological changes in thymus of Wistar rats(HE×100).See Fig.1 for rat treatment except KLH administration.A:vehicle control group;B:triptolide 1.0 mg·kg－1group;C:cyclosporin A 20 mg·kg－1group.The area of thymus medulla was moderately reduced.

將環(huán)孢素A和雷公藤甲素組與對照組樣本的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，共篩選到11 862個(gè)基因。然后對這些基因進(jìn)行非監(jiān)督聚類分析，結(jié)果可見聚類的差異表達(dá)基因與時(shí)間具有較好的相關(guān)性，第7天和第14天的大鼠分別聚類在一起。使用差異基因分析軟件分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在第7天雷公藤甲素0.5 mg·kg－1共引起14個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，雷公藤甲素1.0 mg·kg－1則引起422個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(表2)，在第14天雷公藤甲素1.0 mg·kg－1僅引起23個(gè)差異表達(dá)基因。環(huán)孢素A 20 mg·kg－1在第7天共引起228個(gè)顯著性差異表達(dá)基因(其中表達(dá)下調(diào)基因219個(gè)，上調(diào)基因9個(gè))，在第14天引起111個(gè)差異表達(dá)基因(其中表達(dá)下調(diào)基因108個(gè)，上調(diào)基因3個(gè))。

2.4 差異表達(dá)基因功能及通路分析

1.5.1 芯片組織樣本制備

她在回家的出租車上哭了。她有些莫名奇妙自己的眼淚。她的第一次，和一個(gè)男人，他們沒有任何的戀愛程序而是直接上了床。這讓她覺得有些微的恥辱，但也有些興奮。她喜歡他，之前很朦朧，現(xiàn)在很確定。

Tab.2 Significant enrichment analysis of GO terms of the differentially expressed genes using the R language package software in triptolide 1.0 mg·kg－1group after 7 d treatment

此外，使用京都基因和基因組百科全書(kyoto encycloedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫對雷公藤甲素1.0 mg·kg－1差異表達(dá)基因進(jìn)行通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)基因主要參與了移植排斥和自身免疫性疾病等一系列與免疫反應(yīng)密切相關(guān)的信號通路。

對于使用過程中進(jìn)行焊補(bǔ)、有表面裂紋覺得有必要進(jìn)行埋藏性缺陷檢測的部位，以及使用中出現(xiàn)焊接接頭泄露的部位，需要采用超聲、衍射時(shí)差法或射線等探傷方式進(jìn)行埋藏性缺陷檢測。

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證相關(guān)基因的表達(dá)

qRT-PCR的結(jié)果顯示，從雷公藤甲素1.0 mg·kg－1引起的7個(gè)代表性差異表達(dá)基因，其中Ghrh，Pcyox1l，V1ra14，Ryr2，Lass4和Inhbb 6個(gè)基因的表達(dá)差異趨勢和芯片顯示的結(jié)果基本一致(圖3)。個(gè)別基因如Ghrh的變化倍數(shù)在兩種檢測方法中略有差異，可能是由于基因芯片和RT-PCR檢測方法的靈敏度差異所致。

Fig.3 Effects of triptolide on gene expression of Ghrh，Pcyox11，V1ra14，Ryr2，Lass4 and Inhbb were validated by microarray test and qRT-PCR.Fold changes in gene expression levels between triptolide 1.0 mg·kg－1group and control group were compared between qRT-PCR and microarray.±s，n=3(qRT-PCR).Array data were calculated by SAM software.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素能夠引起大鼠產(chǎn)生明顯的免疫抑制毒性，并引起胸腺基因表達(dá)譜發(fā)生改變，給藥第7天的差異表達(dá)基因數(shù)量以及與免疫毒性的相關(guān)性明顯高于第14天，提示免疫毒性相關(guān)基因的調(diào)控主要發(fā)生在藥物毒性的早期階段，這與國外文獻(xiàn)［5－6］報(bào)道結(jié)果相一致。

將圖1中6個(gè)水文站作為分析對象，計(jì)算在不同保證率P（20%，50%，75%，90%，95%）情況下降水量XP［2］。

此外，雷公藤甲素1.0 mg·kg－1免疫毒性差異基因表達(dá)的數(shù)量明顯高于雷公藤甲素0.5 mg·kg－1，結(jié)合T細(xì)胞依賴抗體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)和組織病理學(xué)檢查結(jié)果，也發(fā)現(xiàn)大鼠連續(xù)28 d ip給予雷公藤甲素1.0 mg·kg－1后出現(xiàn)較為明顯的免疫抑制毒性反應(yīng)，機(jī)體對外源性物質(zhì)的免疫應(yīng)答水平明顯下降，胸腺皮髓質(zhì)淋巴細(xì)胞數(shù)量輕度減少，而雷公藤甲素0.5 mg·kg－1抗體應(yīng)答水平雖有一定的降低但并未出現(xiàn)組織病理學(xué)的改變。這表明雷公藤甲素引起的免疫毒性差異基因表達(dá)與劑量具有一定的相關(guān)性，和組織病理學(xué)檢查結(jié)果也具有較好的一致性。歐盟框架計(jì)劃6曾指出，毒理基因組學(xué)與組織病理學(xué)相結(jié)合是毒性分子機(jī)制研究的最有效工具［7］，結(jié)合本研究結(jié)果，也證實(shí)了使用基因組學(xué)技術(shù)與組織病理學(xué)結(jié)合評價(jià)免疫毒性切實(shí)可行。

雷公藤甲素引起胸腺基因表達(dá)譜變化的絕大部分基因?yàn)橄抡{(diào)基因，這些差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)、代謝調(diào)節(jié)和激素分泌等幾個(gè)方面。其中細(xì)胞生長增殖相關(guān)基因變化最為顯著，這些下調(diào)基因主要表現(xiàn)為抑制DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯、核小體裝配、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和干擾細(xì)胞周期等方面。結(jié)合近年來文獻(xiàn)報(bào)道，有多項(xiàng)研究表明雷公藤甲素對多種淋巴細(xì)胞都有明顯的抑制增殖的作用，如抑制植物血凝素等對淋巴細(xì)胞的非特異性刺激，抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中特異性抗原相關(guān)的淋巴細(xì)胞的增殖，阻止淋巴細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，抑制T細(xì)胞的增殖等［8］。而雷公藤甲素1.0 mg·kg－1免疫毒性的組織病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為胸腺皮髓質(zhì)淋巴細(xì)胞數(shù)量輕度減少，基本與上述差異基因表達(dá)調(diào)控的結(jié)果一致，這表明抑制淋巴細(xì)胞的增殖可能是雷公藤甲素產(chǎn)生免疫毒性的主要機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素A引起的差異表達(dá)基因主要涉及免疫反應(yīng)、免疫球蛋白分泌、T細(xì)胞增殖、B細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等幾個(gè)方面，基因的改變與文獻(xiàn)報(bào)道的作用機(jī)制基本一致，這也在一定程度上證明本研究芯片結(jié)果的可靠性。此外，結(jié)合KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的差異表達(dá)基因主要在免疫相關(guān)反應(yīng)過程如移植排斥和自身免疫性疾病發(fā)揮抑制作用，表明本研究獲得的差異表達(dá)基因與雷公藤甲素的免疫系統(tǒng)毒性具有較好的相關(guān)性，這也與文獻(xiàn)［9－10］的報(bào)道結(jié)果相一致。

綜上所述，使用基因芯片技術(shù)研究雷公藤甲素的免疫毒性，結(jié)果顯示基因表達(dá)譜的變化與T細(xì)胞依賴抗體反應(yīng)檢測和組織病理學(xué)檢查結(jié)果具有較好的一致性，說明基因芯片技術(shù)在評價(jià)免疫毒性方面切實(shí)可行，同時(shí)也為闡明雷公藤甲素免疫毒性機(jī)制提供了基因水平上的數(shù)據(jù)支持。還需要對相關(guān)基因從核酸表達(dá)和蛋白表達(dá)水平上進(jìn)一步驗(yàn)證，對現(xiàn)有基因進(jìn)一步分析，同時(shí)使用更多的免疫毒性化合物研究免疫毒性相關(guān)基因表達(dá)譜的變化，闡釋免疫毒性差異表達(dá)基因和免疫功能改變之間的相關(guān)性。

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Effect of triptolide on immunotoxicity-related gene expression in rats with microarray

GENG Xing-chao1，2，HONG Min2，SONG Ying3，LIN Zhi2，ZHANG Liang4，LI Bo2，WANG Jun-zhi2
(1.School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University，Xi'an710032，China;2.National Center for Safety Evaluation of Drugs，National Institute for Food and Drug Control，Beijing100050，China;3.School of Pharmaceutical Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou510006，China;4.BioChain Beijing Science-Technology Inc.，Beijing100176，China)

OBJECTIVETo explore the effect of triptolide on the gene expression profiles in rat thymus with microarray and to further investigate the molecular mechanism of its immnuosupression toxicity.METHODSWistar rats were ig given triptolide 0.5 and 1.0 mg·kg－1and cyclosporin A 20 mg·kg－1(positive control)，once daily，for 28 d.T-cell-dependent antibody response assay，histopathology examination of immune organs and microarray test of thymus were performed respectively.RESULTSCompared with vehicle control group，T cell dependent anti-keyhole limpet hemocyanin(KLH)specific antibody response level significantly decreased in triptolide 0.5 and 1.0 mg·kg－1groups and ciclosporin A group.Histopathology examination showed that the number of lymphocytes in thymus cortex and medulla was slightly reduced in triptolide 1.0 mg·kg－1group and the area of thymus medulla was moderately reduced in cyclosporin A group.In microarray test，about 442 down-regulated genes were remarkably altered in triptolide 1.0 mg·kg－1group.The functions of these differentially expressed genes were associated with regulation of transcription，nuclear transport，tubulin complex assembly，nucleosome assembly，transcription from mitochondrial promoter，translation，amino acid transport，and mitochondrial DNA replication.KEGG pathway analysis results showed that these differentially expressed genes were mainly involved in transplant rejection and autoimmune disease.CONCLUSIONTriptolide 1.0 mg·kg－1can cause significant change in gene expression profiles in rat thymus，and its mechanism of immunotoxicity might be inhibition of the lymphocytes proliferation by down-regulating the expression of immunotoxicityrelated genes.

triptolide;thymus gland;immunity;toxic actions;gene expression profiling

The project supported by National Science and Technology Major Projects for″Major New Drugs Innovation and Development″(2008ZX09305-2);and Beijing Nova Program(2010B070)

WANG Jun-zhi，E-mail:wangjz@nicpbp.org.cn，Tel:(010)67095782

R992

A

1000-3002(2012)06-0870-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.016

2011-10-18接受日期:2012-05-21)

(本文編輯:付良青)