苑淑賓，朱愛意

(浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316004)

溶藻弧菌Vibrioalginolyticus是一種嗜鹽性革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢、莢膜[1]，隸屬于弧菌科Vibrionaceae、弧菌屬Vibrio，是一種常見的海洋致病菌，在世界各地海水及河口處廣泛分布[2]，并且其數(shù)量居海水類弧菌之首[3]。因其生物學(xué)性狀有許多與副溶血性弧菌相似，在《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第8版(1974)中將其列為副溶血性弧菌生物I型菌(副溶血弧菌為生物l型)?？蓪?duì)人引起傷口感染、食物中毒[4]、中耳炎[5]等疾病。同時(shí)，它也是魚、蝦、貝等海水養(yǎng)殖動(dòng)物的一種條件致病菌，當(dāng)環(huán)境惡化時(shí)機(jī)體免疫機(jī)能下降，溶藻弧菌病容易爆發(fā)[6]，特別當(dāng)水溫在25～32℃下容易流行[7]，因此養(yǎng)殖動(dòng)物的溶藻弧菌病多發(fā)生在夏季，爆發(fā)時(shí)往往會(huì)造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失[8]。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，有關(guān)溶藻弧菌致病性的研究越來越多，人們對(duì)其致病機(jī)理的認(rèn)識(shí)也越來越詳細(xì)。本文主要針對(duì)溶藻弧菌的病原性、致病性及其防治的研究進(jìn)展作了概述。

1 病原學(xué)特征

目前為止，溶藻弧菌能夠使其致病的已見報(bào)道的魚類有很多，黑鯛Sparus macrocephlus、大黃魚Pseudosciaena crocea等[9～20]感染溶藻弧菌病的主要癥狀表現(xiàn)為：表皮發(fā)生潰瘍、出血、常有黑斑，眼球凸起、充血，腹部充水腫脹，腎臟發(fā)白，脾臟腫大、常有小瘤伴生，肝臟充血、損傷；平鯛Rhabdosargus sarba、鮸狀黃姑魚Nibea miichthioides[21～23]等感染溶藻弧菌后導(dǎo)致潰瘍病，感染初期病魚體色變深，感染組織常發(fā)生充血、發(fā)炎等癥狀，嚴(yán)重時(shí)病魚鰭間組織逐漸散開、潰爛，鰭條潰爛，體表其他感染部位可能會(huì)發(fā)生損傷、潰爛，再嚴(yán)重可能最終導(dǎo)致死亡；溶藻弧菌還能引起日本對(duì)蝦Penaeus japonicus[24]、斑節(jié)對(duì)蝦Penaeus monodon等[25]的白斑病，主要癥狀表現(xiàn)為：甲殼有白斑；還會(huì)導(dǎo)致中國(guó)明對(duì)蝦Fenneropenaeus chinensis[26-27]黑鰓、褐斑綜合癥，也有人稱之為紅腿病，主要癥狀表現(xiàn)為：部分鰓絲呈深黑色，從甲殼外側(cè)可見頭胸甲殼內(nèi)部有黑色物質(zhì)附著，體表甲殼有黑斑。還可導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei[28]會(huì)染上紅體病，整個(gè)蝦體變成紅色，肝胰臟有些腫脹，頭胸甲容易剝離。溶藻弧菌感染不同魚、蝦、貝類，導(dǎo)致的病癥略有不同。

2 致病機(jī)理

細(xì)菌生物膜(Biofilm，BF)，也可稱為生物被膜，主要是指附著于有生命或無生命物體表面被細(xì)菌胞外大分子包裹的有組織的細(xì)菌群體[29～32]。BF中存在各種主要的生物大分子，比如蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物質(zhì)。BF的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成包括細(xì)菌起始粘附、BF發(fā)展和成熟等階段，是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程。在不同階段，細(xì)菌的BF生理生化特性也不同?；【鷮俚募?xì)菌幾乎都能形成具自我保護(hù)功能的生物膜，使其更易入侵和感染生物體，而BF的存在可能與慢性疾病的產(chǎn)生和疾病的大流行有關(guān)[31]。

總體而言，BF細(xì)菌主要有兩種致病機(jī)制：

(1)抗免疫機(jī)制：對(duì)抗宿主機(jī)體免疫防御機(jī)制，BF細(xì)菌可利用多種方式，比如抑制中性粒細(xì)胞的趨化作用、減少宿主機(jī)體細(xì)胞因子(cytokine)的產(chǎn)生、酶解宿主細(xì)胞因子等。

(2)抗藥機(jī)制：BF的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)決定了它的抗藥性。BF細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性要超過浮游細(xì)菌10～1 000倍。BF抗宿主機(jī)體免疫防御的機(jī)制或抗藥往往是多個(gè)機(jī)制協(xié)同起作用。

溶藻弧菌是一種重要的伺機(jī)性病原體，在人體和養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物上能夠引起各種不同癥狀的弧菌病。同其他具生物膜的細(xì)菌一樣，溶藻弧菌的致病性由它與宿主細(xì)胞間的相互作用決定的，致病過程大致包括粘附、侵襲、體內(nèi)增殖及產(chǎn)生毒素等過程[29]。生物膜細(xì)菌主要是在侵襲宿主機(jī)體的和增殖的過程中損傷組織細(xì)胞，同時(shí)在宿主體內(nèi)產(chǎn)生毒素等一些代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物能夠通過破壞或者是干擾宿主的全身或局部的正常新陳代謝或機(jī)能，而并且最終引起宿主發(fā)生病變[30]。而致病菌引發(fā)宿主發(fā)生病變過程與其產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物有關(guān)。

2.1 致病因子

溶藻弧菌的致病因子有很多種，主要包括四個(gè)大部分，分別是粘附素、胞外產(chǎn)物(如堿性絲氨酸蛋白酶和膠原蛋白酶等)、外膜蛋白及攝鐵系統(tǒng)等。不同的致病因子在其感染宿主的不同時(shí)期起著不同的作用。

2.1.1 粘附素(Adhesin)

細(xì)菌感染的第一步是粘附，通過粘附，致病菌才有可能侵入宿主體內(nèi)，進(jìn)而產(chǎn)生并毒素，并最終使宿主致病[31]。通過粘附病原菌在宿主易感細(xì)胞上獲得立足點(diǎn)，繁殖，然后通過釋放毒素和酶類損壞宿主組織或細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致感染。而細(xì)菌的粘附作用主要依靠粘附素來完成，粘附素能夠特異性識(shí)別并結(jié)合到宿主細(xì)胞。宿主感染致病的一個(gè)必要條件就是細(xì)菌的粘附，粘附對(duì)于細(xì)菌侵入宿主并進(jìn)一步有效發(fā)揮毒素等的作用具有重要意義[32]。

溶藻弧菌粘附素方面的研究不多國(guó)外的學(xué)者對(duì)溶藻弧菌粘附素作了一定的研究。BAFFONE等[33]研究了20株溶藻弧菌對(duì)Hep-2細(xì)胞的粘附情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有11株菌對(duì)Hep-2細(xì)胞有比較強(qiáng)的粘附作用。ZANETTI等[34]的研究發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌可粘附在上皮細(xì)胞上。BALEBONA等[35-36]研究表明，溶藻弧菌對(duì)鯉魚Cyprinus carpio上皮細(xì)胞、黑鯛紅細(xì)胞無粘附作用；但是對(duì)黑鯛的腸粘膜、鰓、表皮都有較強(qiáng)的粘附作用；但可粘附在大鱗大麻哈魚(King salmon)胚胎細(xì)胞上。

粘附一般需要具備兩個(gè)基本條件：粘附結(jié)構(gòu)和宿主細(xì)胞表面有特異性受體。除了這兩個(gè)基本條件之外，粘附還與細(xì)菌本身的一些生物學(xué)特性及環(huán)境因子有關(guān)系[28,37]。致病菌對(duì)真核細(xì)胞表面的粘附一般需要粘附素來介導(dǎo)，粘附素在真核細(xì)菌的感染過程中起著重要作用?；【恼掣剿乜梢苑譃楹芏喾N，總體上可分為菌毛粘附素和非菌毛粘附素兩大類，菌毛粘附素包括菌毛、纖毛等；外膜蛋白、脂多糖、胞外多糖等則屬于非菌毛粘附素[38]。

鞭毛在溶藻弧菌粘附宿主過程中起重要作用。MEADOWS[39]提出假設(shè)：細(xì)菌的鞭毛在細(xì)菌感染的粘附過程中有著無可替代的重要作用。DeBOER等[40]在MEADOWS研究的基礎(chǔ)上作出假設(shè)：周生鞭毛是使溶藻弧菌能夠粘附在宿主或環(huán)境中物體表面的一個(gè)重要因素。根據(jù)鞭毛的位置，可以分為兩種鞭毛類型：端鞭毛和周生鞭毛。但是條件不同時(shí)，兩種鞭毛的地位和作用也不同。在液態(tài)環(huán)境下以端鞭毛為主，而在固態(tài)環(huán)境下則以后者為主。BELAS等[41]對(duì)不同類型鞭毛的弧菌在甲殼質(zhì)上的吸附特性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明：當(dāng)在適應(yīng)表達(dá)周生鞭毛的條件下，像溶藻弧菌這樣具有混合類型鞭毛的弧菌，它們?cè)诩讱ど系奈角闆r符合“朗繆爾吸附等溫式”，但是當(dāng)菌濃度達(dá)到一定程度時(shí)會(huì)出現(xiàn)吸附飽和的現(xiàn)象；而在適應(yīng)表達(dá)端鞭毛的條件下則不符合朗繆爾吸附等溫式”，也無飽和現(xiàn)象。研究結(jié)果也表明了：周生鞭毛菌相對(duì)端鞭毛菌對(duì)甲殼質(zhì)的親和力要強(qiáng)，而且周生鞭毛菌可以抑制端鞭毛菌的吸附。這些結(jié)果說明周生鞭毛有利于溶藻弧菌的吸附。BORDAS等[42]在BELAS等的基礎(chǔ)上展開了溶藻弧菌對(duì)黑鯛表皮粘液的粘附動(dòng)力學(xué)研究，其研究結(jié)果與BELAS等的結(jié)果一致。SAKAMOTO等[43]對(duì)具有不同形態(tài)的2株突變體的運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)具有端鞭毛的YM4可以借助其端鞭毛進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，而無端鞭毛的NMB198菌株的溶藻弧菌不能運(yùn)動(dòng)。

2.1.2 脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)

組成細(xì)菌內(nèi)毒素的主要部分是脂多糖(LPS)，它由一條特異鏈、核心多糖和類脂A三部分組成，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的主要成分之一。陳昌福等[44]對(duì)柱狀嗜纖維菌的研究結(jié)果表明脂多糖是柱狀嗜纖維菌重要的一種共同保護(hù)性抗原，如果以脂多糖作免疫抗原，可以顯著增強(qiáng)動(dòng)物的免疫保護(hù)力。在病原弧菌中，鰻弧菌Vibrioanguillarum、創(chuàng)傷弧菌V.vulnificus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、海魚弧菌V.damsela、霍亂弧菌V.cholera、擬態(tài)弧菌V.mimicus等的脂多糖都已經(jīng)被證明與弧菌的致病過程有關(guān)，脂多糖是這些病原弧菌共有的一種重要致病因子[45]。1981年，HISATSUNE等[46]研究了溶藻弧菌的糖組分，發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌的脂多糖與一般的細(xì)菌不同，它的內(nèi)核骨架成分不是2-酮-3-脫氧-D-甘露糖型-辛酮糖酸(KDAO)，而是KDAO類似物。陳曉燕等[45,47]研究了點(diǎn)帶石斑魚Epinephelus coioides野生五帶豆娘魚Abudefduf vaigiensis人工感染溶藻弧菌后LPS在魚體組織內(nèi)的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：溶藻弧菌的脂多糖可以被腎臟、脾臟、肝臟、小腸等內(nèi)臟組織吸附。鄢慶枇等[48]對(duì)溶藻弧菌脂多糖對(duì)大黃魚的毒性情況進(jìn)行了研究，在對(duì)大黃魚肌肉注射劑量為0.2 cm3不同濃度脂多糖溶液的毒性試驗(yàn)中，脂多糖注射濃度為0.5 mg/cm3時(shí)，5 d內(nèi)能引起大黃魚死亡；當(dāng)脂多糖質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/cm3時(shí)，大黃魚的死亡率達(dá)到100%。以劑量為0.2 cm3濃度為9×108個(gè)/cm3的溶藻弧菌進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，40%的大黃魚獲得免疫保護(hù)。

2.1.3 攝鐵系統(tǒng)(Ferric uptake system)

鐵攝取系統(tǒng)在溶藻弧菌的生存和致病性方面，都有重要的作用[49]。眾所周知，鐵是血紅蛋白結(jié)合氧原子的一個(gè)要素，機(jī)體感染溶藻弧菌后，弧菌的攝鐵系統(tǒng)從宿主血紅蛋白中奪取鐵，從而導(dǎo)致宿主機(jī)體供氧不足，貧血，甚至死亡。到現(xiàn)在為止，有關(guān)溶藻弧菌攝鐵系統(tǒng)方面的研究還比較少。BALEBONA等[50]研究發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌有能從宿主鐵螯合蛋白中獲得鐵離子的載鐵體。錢榮華等[37]通過對(duì)溶藻弧菌鐵調(diào)蛋白基因的克隆、表達(dá)及其特征分析研究，結(jié)果顯示：該基因序列全長(zhǎng)為994 bp，當(dāng)中包含開放讀碼框450 bp，編碼150個(gè)氨基酸殘基的蛋白，推導(dǎo)的相對(duì)分子量為16.78 kDa。確定了在編碼序列的上下游的RBS序列、-10序列、-35序列和2個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄終止子，但沒有發(fā)現(xiàn)存在于大腸桿菌fur基因中的“鐵盒子”。氨基酸序列中的高度保守區(qū)域?yàn)镚46位至D104的位段，在這一位段中包括含組氨酸豐富鐵結(jié)合模型(H3-D-H-LV-C-L-D-C-G)。SDS-PAGE分析表明，fur基因可在大腸桿菌中大量表達(dá)，Western-blot分析結(jié)果顯示，fur蛋白具有免疫反應(yīng)性。王蓬勃等[49]研究了海洋動(dòng)物病原菌溶藻弧菌的鐵攝取機(jī)制，溶藻弧菌能夠在高濃度鐵螯合劑2′-2′二聯(lián)吡啶的培養(yǎng)基中存活，在限鐵環(huán)境中，溶藻弧菌生長(zhǎng)受到抑制，補(bǔ)加鐵可以消除這種抑制作用。通過鐵載體定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)分離于發(fā)病魚體的溶藻弧菌MVP01產(chǎn)鐵載體量大于分離于海水的菌株NO1111587?；パa(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明溶藻弧菌的鐵載體粗提物能夠被鐵載體合成缺陷的大腸桿菌突變株AN93利用，在鐵限制培養(yǎng)環(huán)境中，溶藻弧菌合成了約80 kD鐵調(diào)控外膜蛋白。

2.1.4 外膜蛋白(Outer membrane protein，OMP)

近幾年來，專家學(xué)者們較深入地研究了弧菌的OMP，研究發(fā)現(xiàn)OMP和細(xì)菌的粘附及攝鐵過程密切相關(guān)，它們相互起作用，OMP也是一種非常重要的致病因子[52]。一般弧菌具有多種OMP，目前已知弧菌最小分子量為39 kDa的OMP實(shí)際上是最小弧菌的血凝素，粘蛋白、胎球蛋白等糖蛋白能夠抑制它的血凝作用，而單糖類、二糖類以及N-乙酞糖類則不會(huì)抑制血凝作用，能介導(dǎo)最小弧菌近距離粘附在紅細(xì)胞上。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌具有兩種分子量分別為72 kDa和77 kDa的OMP，它們受鐵離子調(diào)節(jié)，主要參與鐵的吸收過程[53]。在鰻弧菌775的攝鐵系統(tǒng)中有一個(gè)重要組成部分就是鰻弧菌775的外膜蛋白OM2，它的分子量大小為86 kDa。OMP作為鰻弧菌素與鐵離子復(fù)合物的受體而發(fā)揮作用，而最終使宿主致病。除了OM2之外，在鰻弧菌攝鐵的過程中還有另外一種外膜蛋白OM3也有參與，它的分子量大小為79 kDa。SIMON等[54]的研究認(rèn)為鰻弧菌的主要外膜蛋白可能是鰻弧菌各個(gè)不同血清型的共同抗原。

2.1.5 胞外產(chǎn)物(Extracellular Products，ECP)

胞外產(chǎn)物也是一種重要的致病因子溶藻弧菌可以產(chǎn)生多種胞外產(chǎn)物，這些胞外產(chǎn)物大都與其致病性有關(guān)，比如蛋白酶類及外毒素，它們是導(dǎo)致宿主致病的主要毒力因子[37]。

a.ECPase

ECPase具有淀粉酶、酪蛋白酶、卵磷脂酶和脂肪酶等4種酶活性，其中淀粉酶的活性最高，酪蛋白酶、脂肪酶活性次之，卵磷脂酶活性較低[56,58]。林業(yè)杰等[55]對(duì)溶藻弧菌致病性的研究結(jié)果表明：發(fā)現(xiàn)小鼠感染此菌后3 h即開始發(fā)病，至48 h全部死亡；有5.5%和22.5%的菌株分別產(chǎn)生ST和LT腸毒素。BALEBONA等[56]經(jīng)肌肉將ECPase注射魚體，6 h后觀察到注射部位有細(xì)胞溶解的現(xiàn)象，24～72 h就可引起死亡，由此推斷ECPase對(duì)魚類細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性。LEE等[57]研究發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌ECP在對(duì)蝦的溶藻弧菌病中起著重要作用，能夠引起日本對(duì)蝦血漿中抗脂多糖因子消失、血藍(lán)蛋白減少。ECPase能溶解斷斑石鱸Pomadasys hasta、眼斑擬石首魚Sciaenops ocellatus和赤點(diǎn)石斑魚Epinephelus akaara的紅細(xì)胞，而不能溶解雞、羊和O型人的紅細(xì)胞；對(duì)小白鼠和石斑魚的LD50分別為0.08 mg/g和0.17 mg/g，95%可信限分別為0.06～0.12 mg/g和0.07～0.28 mg/g；50 mmol/L EDTA和 100 mmol/L苯甲基磺酰氟能使溶藻弧菌胞外蛋白酶(Extracellular proteinase，ECPase)的活性分別下降83.40%和51.32%；ECPase對(duì)熱穩(wěn)定性較差，堿性條件下活性較高，其最適溫度為50℃，最適pH為8.0。

b.溶血素(Helmolysin)

溶血素是一種能特異性地結(jié)合于紅細(xì)胞的抗原型的靈敏的、互補(bǔ)固定抗體，這種抗體可由該表面抗原刺激而產(chǎn)生，可導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解釋放出血紅蛋白?，F(xiàn)已證明溶血素是鰻弧菌和副溶血弧菌重要的毒力因子[59]。BAFFONE等[60]研究了20株海域分離出的溶藻弧菌，其中有1株菌能夠產(chǎn)生腸毒素，并且進(jìn)而導(dǎo)致小白鼠致病，但這20株溶藻弧菌都沒有溶血活性。權(quán)太淑等[61]從溶藻弧菌中檢出耐熱溶血素，神奈川實(shí)驗(yàn)有86%的菌株呈現(xiàn)陽性。

c.堿性絲氨酸蛋白酶(Alkaline serine exoprotease，AspA)

堿性絲氨酸蛋白酶是一種蛋白酶，在動(dòng)植物、真菌、病毒以及細(xì)菌中廣泛存在。AspA主要參與蛋白質(zhì)的翻譯后加工、組織降解、細(xì)胞分裂、病原體感染和細(xì)胞凋亡等多個(gè)過程。1981年，LONG等[62]首次報(bào)道了溶藻弧菌可以產(chǎn)生堿性絲氨酸蛋白酶。CHEN等[63-64]研究認(rèn)為堿性絲氨酸蛋白酶是溶藻弧菌分泌的主要蛋白酶，能使對(duì)蝦致死，可被酶抑制劑苯甲基磺酸氟(PMSF)所抑制。HARE[65-66]和DEANE等[67]對(duì)溶藻弧菌能產(chǎn)生堿性絲氨酸蛋白酶的種類以及組氨酸調(diào)節(jié)堿性絲氨酸蛋白酶的產(chǎn)生機(jī)制作了研究，發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌能產(chǎn)生6種分子量不同的SDS抗性的堿性絲氨酸蛋白酶，堿性絲氨酸蛋白酶抑制劑可以抑制這些蛋白酶的活性，組氨酸(His)對(duì)這6種酶的活性沒有抑制作用，這6種蛋白酶的分子量都小于30 kDa。DEANE[68]用極限培養(yǎng)基或琥珀酸極限培養(yǎng)基得到了3種SDS抗性的堿性絲氨酸蛋白酶的ProA、B、C分子量。1989年，DEANE等[69]已經(jīng)測(cè)出了ProA的核苷酸序列。LEE等[70-71]有報(bào)道稱溶藻弧菌能產(chǎn)生一種堿性絲氨酸蛋白酶，這種酶的分子量大小為33 kDa。

d.其他胞外產(chǎn)物的研究

除以上介紹的幾種常見的毒素因子外，膠原酶也是研究較多的一種胞外產(chǎn)物。它是一種含鋅的金屬蛋白酶，但是這種酶只作用于膠原或其變性明膠[73-75]。膠原酶的三螺旋結(jié)構(gòu)完好時(shí)，不容易降解，必須在受到破壞在后才能降解。內(nèi)源性組織膠原酶雖然在增生性瘢痕中的含量比較高，但是它的活性作用受到TIMP的抑制，因此不能有效地發(fā)揮[76]。

總之，細(xì)菌體內(nèi)導(dǎo)致有機(jī)體致病的毒力因子可能有很多，一般情況下是多種毒力因子相互作用的結(jié)果。LEE等[51]報(bào)道，從死亡及瀕死的龍蝦的肝臟、胰腺和血淋巴中分離出一種弧菌，經(jīng)鑒定為溶藻弧菌，該菌的毒力因子主要為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、細(xì)胞外溶血素及ECPase，尤其是細(xì)胞外產(chǎn)物起著主要作用。

3 溶藻弧菌病的防治

目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)溶藻弧菌疫苗的研究相對(duì)國(guó)外較多，特別是滅活疫苗和亞單位疫苗，國(guó)內(nèi)現(xiàn)已有了較為詳細(xì)的研究。

免疫刺激是能夠增強(qiáng)魚體免疫力和疾病抵抗力的一種有效方式，因此溶藻弧菌的滅活疫苗能夠在一定程度上提高機(jī)體免疫能力。曹劍香等[78]用甲醛滅活溶藻弧菌，將滅活疫苗通過口服免疫凡納濱對(duì)蝦，從而獲得了較高的免疫保護(hù)率。王海芳等[77]用溶藻弧菌制備全細(xì)胞、全細(xì)胞-FCA、LPS 3種疫苗，經(jīng)免疫接種后，結(jié)果表明：免疫組的抗體效價(jià)及其他各免疫指標(biāo)較對(duì)照組顯著要高，在攻毒之后，都表現(xiàn)出很好的免疫保護(hù)力，其中最高的屬全細(xì)胞-FCA組，免疫保護(hù)力高達(dá)85.7%。丁燏等[13]用福爾馬林滅活法溶藻弧菌，制備了溶藻弧菌的全菌疫苗，免疫接種后發(fā)現(xiàn)：滅活疫苗提高了黃鰭鯛Sparus latus的免疫功能，使得在攻毒時(shí)黃鰭鯛的死亡率大為減少。

KRUPESHA SHARMA等[31]研究了各種營(yíng)養(yǎng)濃度和孵化時(shí)間條件下的溶藻弧菌生物膜的形成。結(jié)果表明：溶藻弧菌生物膜形成的最佳條件是在0.15%的胰酶解大豆酪蛋白肉湯中培育3 d，生物膜細(xì)胞在80℃條件下10 min或者浸在10%的福爾馬林中24 h完全滅活。與游離細(xì)胞相比，SDS-PAGE形成的生物膜細(xì)胞可以抑制4種蛋白質(zhì)、表達(dá)3種蛋白質(zhì)。初步的研究表明溶藻弧菌在刺激斑節(jié)對(duì)蝦的非特異性免疫在對(duì)熱和對(duì)化學(xué)物質(zhì)的抗性等方面生物膜細(xì)胞要優(yōu)于游離細(xì)胞。因此，只要控制環(huán)境也可以有效地避免溶藻弧菌的感染。

脂多糖作為革蘭氏陰性菌的一種致病因子，在病原菌的感染機(jī)制中起著不可替代的作用，但與此同時(shí)，脂多糖也可表現(xiàn)出顯著的有益作用，如在輕微的感染條件下，它不僅可以增強(qiáng)機(jī)體的非特異性抵抗力，還能夠抗腫瘤以及誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體[79]。雖然脂多糖是一種重要的疫苗材料，但是要想將LPS制成疫苗用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的病害預(yù)防，首先必需要解決兩個(gè)方面的問題：安全性和保護(hù)率。由于脂多糖對(duì)養(yǎng)殖魚類具有一定的毒性，高劑量時(shí)可能會(huì)引起養(yǎng)殖動(dòng)物的死亡，即使在低劑量時(shí)，也可能會(huì)引起魚體器官的損傷，因此，需要對(duì)LPS進(jìn)行一定的處理，盡可能地降低它的毒性，但同時(shí)又要保留它的抗原性。LPS抗體對(duì)動(dòng)物體免疫保護(hù)率較低的原因是最主要由于脂多糖的抗原性較弱。只有在其不對(duì)機(jī)體造成損傷的前提下提高LPS的抗原性，才能提高LPS對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫保護(hù)性。

外膜蛋白OMP也是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的最重要的一個(gè)部分，外膜蛋白與細(xì)菌的致病性和免疫保護(hù)性緊密相關(guān)，在致病過程中起著重要作用。外膜蛋白主要是在細(xì)菌細(xì)胞的生理過程中起關(guān)鍵作用，它是制備疫苗的一種重要原材料，具有重要的研究?jī)r(jià)值和廣闊的開發(fā)前景[80-81]。近年來，病原細(xì)菌OMPs的保護(hù)抗原性方面一直是外膜蛋白研究的重點(diǎn)內(nèi)容[52,82]。經(jīng)研究，OmpW是一種主要的抗原，它在細(xì)菌感染中起著非常重要的作用，現(xiàn)在在霍亂弧菌中已經(jīng)證明OmpW具有一定的免疫原性[83-84]。還有另外一種廣泛分別于弧菌和發(fā)光菌中的外膜蛋白OmpK，在副溶血弧菌中作為一種寬宿主性噬菌體KVP40的受體[85]。把溶藻弧菌外膜蛋白作為模式抗原制備出ISCOMs，經(jīng)免疫大黃魚、進(jìn)行安全和免疫力試驗(yàn)測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明：溶藻弧菌外膜蛋白是較為安全、純凈的一種抗原；免疫組菌體凝集效價(jià)較對(duì)照組高，免疫組個(gè)體之間也有差異。而免疫組的血清ELISA抗體水平明顯高于對(duì)照組；攻毒試驗(yàn)組存活率可達(dá)100%，對(duì)照組存活率為20%；試驗(yàn)表明溶藻弧菌外膜蛋白ISCOMs安全，免疫大黃魚后可產(chǎn)生免疫保護(hù)力[86]。

黃志堅(jiān)等[87]研究了溶藻弧菌外膜蛋白，結(jié)果表明：溶藻弧菌OMP的分子量為58 kDa，OMP的保護(hù)性效果比溶藻弧菌滅活菌苗和溶藻弧菌脂多糖好，因此可以證明溶藻弧菌OMP具有相對(duì)較強(qiáng)的免疫原性。楊智慧等[88]對(duì)溶藻弧菌、哈維氏弧菌V.harveyi、副溶血弧菌等19株海水魚類致病性弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列進(jìn)行克隆和測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OmpK基因核苷酸序列之間的相似度在72%～100%。另外，推測(cè)氨基酸序列的相似度71%～100%。該研究不僅在基因水平上證實(shí)了海水魚致病性弧菌中廣泛存在外膜蛋白OmpK，而且證明了它們之間具有較高的相似度。因此可以推測(cè)：外膜蛋白OmpK是溶藻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌的一種共同抗原，具有一定的研究?jī)r(jià)值，同時(shí)也是一種較好的亞單位疫苗原材料，如果將之作為疫苗的話，有可能會(huì)使機(jī)體同時(shí)對(duì)幾種病原體產(chǎn)生抗性，為一苗多抗的可能性奠定了理論基礎(chǔ)。

將溶藻弧菌的外膜蛋白為模式抗原，制備出ISCOMs，以此免疫大黃魚，結(jié)果顯示：獲得較高的凝集抗體效價(jià)和的免疫保護(hù)力，溶藻弧菌的外膜蛋白ISCOMs安全性也較好[86]。這種免疫刺激復(fù)合物可以由皂苷將可溶性抗原成分組裝成，它的免疫功能較其它常規(guī)滅活苗效果顯著，已展現(xiàn)了其優(yōu)越的免疫學(xué)價(jià)值，為溶藻弧菌的防治開辟了一條新的道路。

[1]STEFAN H,HELMUT W,KARIN N B,et al.Isolation of Vibrio alginolyticus from seawater aquaria[J].Int J Hyg Environ Health,2000,203:169-175.

[2]KANEKO T,COLWELL R R.Ecology of Vibrio parahae-molyticus and related organisms in the Atlantic ocean off South Carolina and Georgia[J].Appl Microbiol,1973,28:1 009-1 017.

[3]林業(yè)杰,陳亢川,陳拱立,等.溶藻弧菌噬菌體的分離[J].微生物學(xué)報(bào),1993,33(4):285-289.

[4]封會(huì)茹,游京蓉,劉玉堂,等.溶藻弧菌引起暴發(fā)型食物中毒的病原學(xué)研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2003,15(4):331-334.

[5]ARDIC N,OZYURT M.Case report:Otitis due to Vibrio alginolyticus[J].Mikrobiyol Bul,2004,38:145-148.

[6]胡超群,陶保華.對(duì)蝦弧菌病及其免疫預(yù)防的研究進(jìn)展[J].熱帶海洋,2000,19(3):84-94.

[7]CARLOS R,ALICIAE T,JUAN L B,et al.Association of Aeromonas hydrophila and Vibrio alginolyticus with Larval Mortalities of Scallop(Argopecten purpuratus)[J].Journal of Invertebrate Pathology,1996,67:213-218.

[8]LIU C H,CHEN J C.Effect of ammonia on the immuneresponse of white shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio alginolyticus[J].Fish&Shellfish Immunology,2004,16:321-334.

[9]BALEBONA M C ZORRILLA I,MORINIGO M A,et al.Survey of bacterial pathologies affecting farmed gilt-heat sea bream(Sparus aurata L.)in southwestern Spain from 1990 to 1996[J].Aquaculture,1998,166:19-35.

[10]鄢慶枇,王 軍,蘇永全,等.網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚弧菌病研究[J].集美大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2001,6(3):191-196.

[11]黃志堅(jiān),何建國(guó).鮭點(diǎn)石斑魚細(xì)菌病原的分離鑒定和致病性[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2002,41(5):64-67.

[12]陳寅兒,金 珊,王國(guó)良.鱸魚溶藻弧菌病的血液生理生化指標(biāo)研究[J].臺(tái)灣海峽,2005,24(1):104-108.

[13]丁 燏,徐 剛.黃鰭鯛弧菌病病原特性及其全菌苗的研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2004(2):1-5.

[14]李永芹,簡(jiǎn)紀(jì)常,吳灶和.紅鰭笛鯛弧菌病病原的研究[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2004,24(6):1-5.

[15]LIU P C,LIN J Y,HSIAO P T,et al.Isolation and characterization of pathogenic Vibrio alginolyticus from diseased cobia Rachy centroncanadum[J].Journal of Basic Microbiology,2004,44:23-28.

[16]鄭國(guó)興,李 何,黃寧宇,等.文蛤病原菌(溶藻弧菌)的分離與性狀及病文蛤組織的電鏡觀察[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),1991,15(2):85-95.

[17]陳洪大,于曉莉,葉永慶,等.雜色蛤病原菌-溶藻弧菌的分離與回接感染試驗(yàn)[J].水產(chǎn)科學(xué),1993,12(9):11-14.

[18]林永添.紫貽貝大量死亡原因的初步研究[J].現(xiàn)代漁業(yè)信息,2006,21(7):23-26.

[19]張朝霞,王 軍,張蕉南,等.東山九孔鮑細(xì)菌性疾病研究[J].臺(tái)灣海峽,2001,20(2):193-199.

[20]SANGSTER C R,SMOLOWITZ R M.Description of Vibrio alginolyticus infection in cultured Sepia officinalis,Sepia apama,and Sepia pharaonis[J].Biol Bull,2003,205:233-234.

[21]李 軍,馮 娟,劉 旭,等.香港地區(qū)養(yǎng)殖平鯛的病原菌(溶藻膠弧菌)研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),1998,22(3):275-278.

[22]黃志明.從皮膚潰瘍的鮸狀黃姑魚檢出弧菌[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2002,17(4):223-225.

[23]陳曉燕,胡超群,陳 償.人工養(yǎng)殖點(diǎn)帶石斑魚弧菌病病原菌的分離及鑒定[J].海洋科學(xué),2003,27:68-72.

[24]LEE K K,YU S R,YANG T I,et al.Isolation and characterization of Vibrio alginolyticus isolated from diseased kuruma prawn,Penaeus japonicus[J].Lett Appl Microbiol,1996,22:111-114.

[25]LEE K K,YU S R,CHEN F R,et al.Virulence of Vibrio alginolyticus isolated from diseased tiger prawn,Penaeus monodon[J].Current Microbiology,1996,32:229-231.

[26]于占國(guó).溶藻弧菌引起中國(guó)對(duì)蝦紅腿病的回接實(shí)驗(yàn)觀察[J].海洋學(xué)報(bào),1996,18(6):135-139.

[27]楊季芳,吳友呂,祝希雅.中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)成期細(xì)菌性黑鰓、褐斑綜合癥的病原生物學(xué)研究[J].東海海洋,1992,10(4):27-36.

[28]陳 強(qiáng),鄢慶枇,馬 甡.溶藻弧菌致病性研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué),2006,30(8):83-89.

[29]吳后波,潘金培.病原弧菌的致病機(jī)理[J].水生生物學(xué)報(bào),2003,27(4):422-426.

[30]徐建國(guó).分子醫(yī)學(xué)細(xì)菌學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2000:131-152.

[31]KRUPESHA SHARMA S R,SHANKAR K M,SATHYANARAYANA M L,et al.Development of biofilm of Vibrio alginolyticus for oral immuno-stimulation of shrimp[J].Aquacult Int,2010.

[32]戴卓捷,楊光明,汪正清.細(xì)菌粘附素的分子結(jié)構(gòu)和裝配機(jī)制[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2001,29(3):55-59.

[33]BAFFONE W,CITTERIO B,VITTORIA E,et al.Determination of several potential virulence factors in Vibrio spp.isolated from seawater[J].Food Microbiology,2001,18:479-488.

[34]ZANETTI S,DERIU A,VOLTERRA L,et al.Virulence factors in Vibrio alginolyticus strains isolated from aquatic environments[J].Ann Ig,2000,12:487-491.

[35]BALEBONA M C,ANDREU M J,BORDAS M A,et al.Pathogenicity of Vibrio alginolyticus for Cultured Gilt-Head Sea Bream(Sparus aurata L.)[J].Applied and Environmental Microbiology,1998,64:4 269-4 275.

[36]BALEBONA M C,MORRINIGO M A,BORREGO J J.Hydro-phobicity and adhesion to fish cells and mucus of Vibrio strains isolated from infected fish[J].Int Microbiol,2001,4:21-26.

[37]錢榮華.溶藻弧菌主要毒力相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及其免疫原性研究[D].2007.

[38]WANG X H,LEUNG K Y.Biochemical characterization of different types of adherence of Vibrio species to fish epithelial cells[J].Microbiology,2000,146:989-998.

[39]MEADOWS P S.The attachment of bacteria to solid surfaces[J].Arch Mikrobiol,1971,75:374-381.

[40]DeBOER W E,GOLTEN G,SCHEFFERS W A.Effects of some physical factors on flagellation and swarming of Vibrio alginolyticus[J].Neth J Sea Res,1975,9:197-213.

[41]BELAS M R,COLWELL R R.Adsorption kinetics of laterally and polarly flagellated Vibrio[J].Journal of Bateriology,1982,151:1 568-1 580.

[42]BORDAS M A,BALEBONA M C,ZORRILLA I,et al.Kinetics of adhesion of selected fish-pathogenic Vibrio strains to skin mucus of Gilt-Head Sea Bream(Sparus aurata L.)[J].Applied and Environmental Microbiology,1996,62:3 650-3 654.

[43]SAKAMOTO K,MAGARIYANMA Y,ISOBE S.A Function of Polar Flagellum and Anisotropic Growth in Vibrio alginolyticus Early-Phase Colonies[J].Current Microbiology,2006,52(6):449-454.

[44]陳昌福,曾妍雄,楠田理一.培養(yǎng)時(shí)間對(duì)柱狀嗜纖維菌脂多糖蛋白質(zhì)成分和免疫原性的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,19(2):159-162.

[45]陳曉燕,胡超群.溶藻弧菌脂多糖在兩種魚類體內(nèi)的組織分布[J].熱帶海洋學(xué)報(bào),2002,21(4):30-35.

[46]HISATSUNE K,KIUYE A,KONDO S.A comparative study of the sugar composition of O-antigenic lipopo-lysaccharides isolated from Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus[J].Microbiol Immunol,1981,25:127-136.

[47]陳曉燕,胡超群,任春華,等.溶藻弧菌脂多糖單克隆抗體的制備、鑒定及初步應(yīng)用[J].高技術(shù)通訊，2002(11):90-95.

[48]鄢慶枇,蘇永全,王 軍,等.溶藻弧菌脂多糖對(duì)大黃魚的毒性與免疫保護(hù)性試驗(yàn)[J].臺(tái)灣海峽,2003,22(2):163-167.

[49]王蓬勃,馬 悅,劉 琴,等.溶藻弧菌鐵載體合成及外膜蛋白表達(dá)的研究[J].微生物學(xué)報(bào),2006,33(2):48-53.

[50]BALEBONA M C,ANDREU M J,BORDAS M A,et al.Pathogenieity of Vibrio alginolyticus for Cultured Gilt-Head Sea Bream(Sparus aurata L.)[J].APPlied and Environment Mierobiology,1998,64:4 269-4 275.

[51]LEE K K,YU S R,YANG T I,et al.Isolation and characterization of Vibrio alginolyticus isolated from diseased kuruma prawn,Pemaeus japonicus[J].Letters in Applied Microbiology,1996,22(2):111-114.

[52]BRIEKNELL I R,KING J A,BOWDEN T J,et al.Duration of Protective antibodies,and the correlation with Protection in Atlantic salmon(Salmo salar L.)following vaccination with an Aeromonas salmonicida vaccine containing iron-regulated outer membrane Proteins and secretory polysaccharide[J].Fish&Shellfish Immunology,1999,9:139-151.

[53]LITWIN C M,BYRNE B L.Cloning and charaeterization of an outer membrane Prote of Vibrio vulnificus required for heme utilization:regulation of expressiona determination of the genes sequence[J].Infect Immun,1998,66:3 134-3 141.

[54]SIMON M,MATHES A,BLANCH A,et al.Charaeterization of aporin from the outer membrane of Vibrio anguillarum[J].Bacteriol,1996,178:4 182-4 188.

[55]林業(yè)杰,董新平,歐劍鳴,等.溶藻弧菌的致病性研究[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,1998,4(4):1-2.

[56]BALEBLONA M C,MORINIGO M A,BORREGO J J.Roleof extracellular products in the pathogenicity of Vibrio strains on cultured gilt-head seabream(Sparus aurata)[J].Microbiologia,1995,11:439-446.

[57]LEE K K,CHEN F R,YU S R,et al.Effeets of extracellular products of Vibrio alginolyticus on penaeid prawn plasma components[J].Lett Appl Microbiol,1997,25(2):98-100.

[58]左鳳琴,簡(jiǎn)紀(jì)常,吳灶和.魚源溶藻弧菌胞外產(chǎn)物的特性研究[J].水生生物學(xué)報(bào),2006,30(5):553-558.

[59]TORANZO A E,BARJA J L,POTTER S A,et al.Hemagglutinating,haemolytic and cytotoxic activities of Vibrio anguillarum and related vibrioses issolated from striped bass on the Atlantic Coast[J].FEMS Microbiol Lett,1983,18:257-262.

[60]BAFFONE W,CITTERIO B,VIITTORIA E,et al.Determination of several potential virulence factors in Vibrio spp.isolated from seawater[J].Food Microbiology,2001,18:479-488.

[61]權(quán)太淑,李 攝,楊喜玲.腹瀉患者中分離溶藻弧菌及其病原性的探討[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,1985,4(5):15-28.

[62]LONG S,MOTHIBELI M A,ROBB F T.Regulation of extracellular alkaline Protease activity by histidine in a collagenolytic Vibrio alginolyticus strain[J].Gen Mierobiol,1981,127(1):193-199.

[63]CHEN F R,LIU P C,LEE K K.Purification and partial characterization of a toxic serine protease produced by pathogenic Vibrio alginolyticus[J].Microbios,1999,98:95-111.

[64]CHEN F R,LIU P C,LEE K K.Lethal attribute of serine protease secreted by Vibrio alginolyticus strains in kuruma prawn Penaeus japonieus[J].Z Naturforsch,2000,55(1/2):94-99.

[65]HARE P,LONG S,ROBB F T,et al.Regulation of exoprotease production by temperature and oxygen in Vibrio alginolyticus[J].Arch Microbiol,1981,130:276-280.

[66]HARE P,SEOTT-BURDEN T,WOODS D R.Characterization of extracellular alkaline proteases and collagenase induction in Vibrio alginolyticus[J].Gen Microbiol,1983,129:1 141-1 147.

[67]DEANE S M,ROBB F T,WOODS D R.Isolation and characterization of a Vibrio alginolyticus mutant that overproduces extracellular proteases[J].Gen Microbio,1986,132:893-898.

[68]DEANE S M,ROBB F T,WOODS D R.Production and activation of an SDS-resistant alkaline serine exoprotease of Vibrio alginolyticus[J].Gen Microbiol,1987,133:391-398.

[69]DEANE S M,ROBB F T,ROBB S M.Nucleotide sequenee of the Vibrio alginolyticus calcium-dependent,detergent-resistant alkaline serine exoprotease A[J].Gene,1989,76:281-288.

[70]LEE K K,YU S R,YANG T I,et al.Alkaline serine protease is an exotoxin of Vibrio alginolyticus in kuruma prawn,Penaeus japonicus[J].Current Microbiology,1997,34(2):110-117.

[71]蔡雙虎,魯義善,吳灶和,等.溶藻弧菌asp基因在大腸桿菌中表達(dá)活性研究及條件優(yōu)化[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(3):45-49.

[72]SEIFTER S,HARPER E.Collagenase[J].Methods Enzymol,1970,19:613.

[73]LWEBUGA-MUKASA J S,HARPER E,TAYLOR P.Collagenase enzymes from Clostridium:characterization of individual Enzymes[J].Biochemistry,1976,15:4 736-4 741.

[74]PETERKOFSKY B.Bacterial collagenases[J].Methods Enzymol,1982,82:453-481.

[75]管正玉,程洪偉,孫廣慈,等.人體正常皮膚及增生性瘢痕組織膠原酶活性檢測(cè)的觀察[J].中華整形燒傷外科雜志,1997,13(2):121-123.

[76]王海芳,孫際佳,趙典惠,等.溶藻弧菌疫苗對(duì)黑鯛的免疫效果研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(1):97-104.

[77]曹劍香,簡(jiǎn)紀(jì)常,吳灶和.溶藻弧菌疫苗對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫功能的影響[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2004,24(6):11-17.

[78]劉振興.魚類弧菌疫苗的開發(fā)與利用現(xiàn)狀(上)[J].漁業(yè)致富指南,2009,(21):63-64.

[79]DING X Z,SMALLRIDGE R C,GALLOWAY R J,et al.Rapid assay of HSF1 and HSF2 gene expression by RT-PCR[J].Mol Cell Biochem,1996,158:189-192.

[80]PIZZA M,SCARLATO V,MASIGNANI V,et al.Identification of vaccine candidates against serogroup B meningococcus by whole-genome sequencing[J].Seience,2000,287:1 816-1 820.

[81]FANG H M,LING K C,GE R,et al.Enhancement of protective immunity in blue gourami,Trichogaster trichopterus(Pallas),against Aeromonas hydrophila and Vibrio anguillarum by A.hydrophila major adhesion[J].Fish Dis,2000,23:137-45.

[82]HLADY W G,KLONTZ K C.The epidemiology of Vibrio infections in Florida,1981-1993[J].Infect Dis,1996,173:1 176-1 183.

[83]WENTWORTH,B B.Diagnostic Procedures for baeterial infections[J].American Public Health Association,1987,1:599-611.

[84]MORRIS J G,BLAEK R E.Cholera and other Vibrioses in the United States[J].N Engl Med,1985,312:343-350.

[85]王斌福,林能鋒,俞伏松,等.大黃魚溶藻弧菌外膜蛋白ISCOMs的免疫效果初步研究 [J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,23(3):244-246.

[86]黃志堅(jiān),何建國(guó).溶藻弧菌外膜蛋白(Va-OMP)的免疫原性及免疫保護(hù)性[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2006,30(4):538-542.

[87]楊智慧,李寧求,白俊杰,等.19株海水魚致病性弧菌OmpK基因序列及其抗原性分析 [J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2006,13(5):807-813.