章如新

·變態(tài)反應(yīng)性疾病·

變應(yīng)性鼻炎基因治療研究與展望

章如新

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR) 是一種多基因遺傳和環(huán)境因素共同影響的鼻變態(tài)反應(yīng)性疾病。流行病學(xué)及遺傳學(xué)證據(jù)表明，該病具有多基因調(diào)控的特征, 某些相關(guān)基因在其發(fā)病中發(fā)揮重要作用。隨著基因組學(xué)研究的進(jìn)展及AR相關(guān)基因的不斷深入研究，AR的基因治療研究已成為學(xué)科的前沿領(lǐng)域。

1 基因治療基本原理

基因治療(gene therapy)是指利用分子生物學(xué)方法將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，使之表達(dá)目的基因產(chǎn)物，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，從而使疾病得到治療。從廣義上而言，基因治療包括從DNA水平所采取的治療措施和技術(shù)?；蛑委煹难芯侩S著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和科研相關(guān)問題的逐步解決，而不斷深入發(fā)展和延伸?；蛑委煹幕驹碛谢蛑脫Q、基因修正、基因修飾、基因失活及免疫調(diào)節(jié)等。

1)基因置換。就是用正常的基因原位替換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)。這種治療方法最為理想，但目前由于技術(shù)原因尚難以直接用于臨床，多數(shù)是用于動物胚胎實(shí)驗(yàn)研究。

2)基因修正。是指將缺陷基因的突變堿基序列糾正，而正常序列予以保留。這種基因治療方式最后也能使缺陷基因得到完全恢復(fù)，操作上要求高，技術(shù)難度大。

3)基因修飾。又稱基因增補(bǔ)或基因補(bǔ)充，即將目的基因?qū)肴毕菁?xì)胞或其他細(xì)胞，使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠修飾缺陷細(xì)胞的功能或使原有的某些功能得到恢復(fù)或加強(qiáng)。在這種治療方法中，缺陷基因仍然存在于細(xì)胞內(nèi)。目前基因治療大多采用這種方式。

4)基因失活。即利用核酶等反義技術(shù)及其RNAi技術(shù)能夠特異性地封閉、阻斷基因異常表達(dá)，抑制一些有害基因的表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。

5)免疫調(diào)節(jié)。將抗體、抗原或細(xì)胞因子基因?qū)霗C(jī)體，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。

2 AR基因治療的策略

2.1 利用芯片技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)AR相關(guān)基因 AR是一種多基因調(diào)控的變應(yīng)性疾病。遺傳學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)，在染色體11q13、12q、10q11.2、1q42-43、6p22-24等存在AR相關(guān)基因[1]?；蚬δ苌婕敖M織相容性抗原復(fù)合體，細(xì)胞因子白細(xì)胞介素4(interleukin 4, IL-4)，IL-13及受體等，趨化因子 RANTES、MCP-1、EOTAXIN及受體等,免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)等[2]。由于涉及不同種族人群，相關(guān)基因存在一定的差異性，如HLA-DRB1、DQA1、DQB1在AR中，等位基因位點(diǎn)存在相關(guān)性及多態(tài)性[3]。隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展，人類已進(jìn)入了這種大規(guī)模、大通量的基因研究時(shí)代。一些傳統(tǒng)的血清學(xué)診斷技術(shù)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)，如以抗體為基礎(chǔ)的一些常規(guī)診斷技術(shù)方法和聚合酶鏈反應(yīng)診斷技術(shù)雖然有一定的實(shí)用性和優(yōu)越性，但在大規(guī)模的遺傳病研究中，其實(shí)際應(yīng)用還存在一定的局限性；而基因芯片由于其巨大的分析能力，極少的樣品用量，簡單、快速、高效的使用方式，能夠?qū)€(gè)體生物信息進(jìn)行高速采集和分析，在遺傳基因的研究中越來越受到重視?；蛐酒夹g(shù)也已應(yīng)用于AR的研究中，利用基因表達(dá)譜芯片篩選差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步研究AR的診斷與治療提供基因水平的線索。我們利用基因表達(dá)譜芯片篩選了AR相關(guān)基因，研究發(fā)現(xiàn)國人AR患者中AR相關(guān)基因有趨化因子CCL-1、CCL-2、CCL-8、CCL-18、RANTES、eotaxin、血小板因子4(platelet factor-4，CXCL4) 基因等及趨化因子受體CCR2、CCR3、CCR4、CCR8、CX3CR1、XCR1等[4]。隨后，國外也利用表達(dá)譜芯片篩選出AR相關(guān)基因細(xì)胞因子有IL-4、IL-13及受體等，趨化因子CCL-2、CCL-3、CCL-8、 RANTES、eotaxin及CCR3、CCR4、MCP-1等，與我們的研究結(jié)果基本相一致[5]。

2.2 AR的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究 遺傳學(xué)研究的不僅是相關(guān)基因，而且包括基因之間的調(diào)控關(guān)系。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(micro RNA,miRNA)在基因表達(dá)中充當(dāng)調(diào)控者的角色，在細(xì)胞分化凋亡、生物發(fā)育、疾病發(fā)生等方面均起重要作用[6]。miRNA是長約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，本身不具有開放閱讀框架，不編碼任何蛋白質(zhì)，但廣泛存在于植物、線蟲甚至人類的細(xì)胞中,在生命活動中發(fā)揮重要調(diào)控作用[7]。它能在RNA代謝的多個(gè)層面對與其同源的底物進(jìn)行調(diào)控，通過形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex,RISC)與靶基因3′端非翻譯區(qū)不完全互補(bǔ)結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA的切割降解、翻譯抑制或者其他形式的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而抑制靶基因的表達(dá)[8]。目前為止，人類基因組內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的miRNA已有3 000個(gè)，它們調(diào)控約50%以上基因的表達(dá)，因此篩選疾病相關(guān)的miRNA分子及分析其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也成為遺傳學(xué)中的研究熱點(diǎn)和前沿。

我們利用miRNA芯片技術(shù)初步篩選了AR相關(guān)miRNAs，研究結(jié)果提示，hsa-miR-874、hsa-miR-143、hsa-miR-498、hsa-miR-187等在AR中存在差異表達(dá)。這些研究表明，差異表達(dá)的miRNA在AR基因調(diào)控中的作用[9]。近年，有研究者對新生兒臍帶血免疫球蛋白E及157種miRNA進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)在miRNA-21減少的新生兒中，其免疫球蛋白E明顯升高，且單核細(xì)胞表面TGFBR2分子表達(dá)升高，這一現(xiàn)象與兒童的AR相一致。這表明，某些miRNA可以作為疾病的預(yù)報(bào)器[10]。miRNA的作用方式是通過對轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控，來實(shí)現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)的。一條miRNA可能控制著成百上千基因的轉(zhuǎn)錄，因此miRNA很可能與疾病的發(fā)病相關(guān)。阻斷其表達(dá)，也許可以治療某些相關(guān)疾病。近些年發(fā)現(xiàn)的miRNA類似物的合成物又稱Antagomirs，可以阻斷miRNA靶基因，誘導(dǎo)miRNA靶基因的長時(shí)間基因沉默[6]。Mattesa等[11]對過敏體質(zhì)BALB/c小鼠鼻內(nèi)應(yīng)用miRNA-126 Antagomirs，室內(nèi)塵螨誘發(fā)小鼠呼吸道過敏反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)小鼠的Th2細(xì)胞相關(guān)反應(yīng)減弱，氣道高反應(yīng)性降低，嗜酸性粒細(xì)胞聚集減少，炎癥得到一定控制,這也進(jìn)一步說明miRNA在疾病中的重要作用，及其基因類似物的治療前景。

2.3 基因調(diào)控的RNA干擾研究 RNA干擾研究是基因干預(yù)研究的重要實(shí)驗(yàn)手段，其中包括miRNA干擾與小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)。miRNA干擾通過將過表達(dá)miRNA載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞或生物體內(nèi)，引起目的miRNA大量過表達(dá)，導(dǎo)致一系列下游相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變。siRNA技術(shù)則因其對目的基因的特異性和高效性，可以使目的基因表達(dá)的抑制率達(dá)到90%，從而在疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[12]。Hosoya等[13]發(fā)現(xiàn)，STAT6 siRNA可以顯著抑制IL-4/TNF-α誘導(dǎo)的真皮成纖維細(xì)胞合成分泌eotaxin，從而抑制AR炎性因子的浸潤。因此，利用RNA干擾技術(shù)研究AR基因調(diào)控機(jī)制，是目前廣泛開展的課題。

2.4 調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞平衡 Th2相關(guān)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)在AR中發(fā)揮重要作用，因此，通過基因水平抑制Th2細(xì)胞功能，減少相應(yīng)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的釋放，是治療AR的希望所在。如轉(zhuǎn)錄因子GATA3的反義寡鏈核苷酸，可以減少小鼠體內(nèi)Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，降低氣道高反應(yīng)性，減少嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤[12]。IL-5的干擾siRNA，可以顯著降低氣道高反應(yīng)性，降低支氣管灌洗液中extonin水平，以及肺組織中IL-5的水平[14]。同時(shí)，加大Th1型相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)也是改變Th細(xì)胞平衡的方法之一，如卵清蛋白致敏小鼠內(nèi)轉(zhuǎn)染重組基因，可以抑制Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)，Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-5、血清特定IgE水平、嗜酸性粒細(xì)胞肺含量均顯著降低，氣道高反應(yīng)性得以抑制[15-16]。

3 AR基因治療研究現(xiàn)狀

傳統(tǒng)AR治療藥物,如抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素等仍是目前治療AR的主要方法，但僅能緩解部分癥狀，沒有從根本上解決AR的治療問題。因此，尋找新的治療方法，已成為科學(xué)工作者思考和努力的方向。近年來所開展的AR遺傳學(xué)研究表明，其發(fā)病與多種基因的異常表達(dá)有密切關(guān)系。利用基因芯片技術(shù)對AR患者基因表達(dá)譜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)存在較多差異表達(dá)基因，其中有參與炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、免疫調(diào)控等的相關(guān)基因[17]。Liu等[18]對AR患者外周血單核細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜的檢測，結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)AR為多基因疾病。隨后又發(fā)現(xiàn)重組激活基因，多種趨化因子CCL8、CCR3、CCR4等基因在AR中高表達(dá)。這些高表達(dá)的細(xì)胞因子在Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)、炎性細(xì)胞的趨化募集及脫顆粒中起著重要作用[19-20]。

作為一類多基因遺傳病，尋找AR關(guān)鍵致病基因并進(jìn)行基因干預(yù)治療是AR治療的重要研究方向之一。目前國內(nèi)外已有不少AR相關(guān)基因的研究，同時(shí)也開展了一些基因干預(yù)性治療研究。He等[21]將腫瘤壞死因子α融合基因的質(zhì)粒注入AR小鼠的鼻黏膜細(xì)胞，可以減少嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞。利用小干擾RNA技術(shù)干預(yù)P物質(zhì)及其受體(NK1R)的基因表達(dá)是治療AR的一個(gè)新方向。我們用自行設(shè)計(jì)構(gòu)建合成的SP-siRNA及NK1R-siRNA在AR動物模型中，通過鼻腔局部干預(yù)處理，研究發(fā)現(xiàn)SP-siRNA及NK1R-siRNA有效地抑制了鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤及多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒及FcεRI介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而減輕鼻黏膜局部炎癥[22-23]。這些研究為AR的基因治療提供了新的思路。

4 AR治療展望

目前認(rèn)為，AR的發(fā)病有多種相關(guān)基因參與，并存在基因調(diào)控機(jī)制。也許存在尚未被發(fā)現(xiàn)的某些AR特定關(guān)鍵基因，這些特定基因可能在某種內(nèi)外環(huán)境的刺激下被激活或表達(dá)?；虻倪z傳易感性、基因與內(nèi)外環(huán)境因素的相互作用等尚有待進(jìn)一步研究。AR基因治療的實(shí)驗(yàn)研究才剛剛開始，尚需我們不斷探索和認(rèn)識，而尋找AR的致病基因及基因調(diào)控機(jī)制的研究是AR基因治療研究的基本思路和方向。

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2012-10-15)

(本文編輯 楊美琴)

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 上海 200040

章如新(Email：zhangruxin@hotmail.com)