林 杰，劉 梅，吳學(xué)宏，韓成貴

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，北京100193）

甜菜是世界兩大糖料作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位[1]。目前我國(guó)甜菜種植主要集中在東北、華北和西北三大產(chǎn)區(qū)[2]。由甜菜尾孢菌（Cercospora beticola）引起的甜菜褐斑病是甜菜生產(chǎn)上最重要的葉部真菌病害[3－4]，致使葉片大量壞死及新葉的再生而消耗了甜菜塊根中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成產(chǎn)量和含糖的下降[5]，病害嚴(yán)重時(shí)甚至亦可危害塊根[6]。一般年份可使甜菜塊根減產(chǎn)10%～20%，含糖率降低1～2度，嚴(yán)重時(shí)甚至造成整個(gè)田塊絕收[7]。

目前生產(chǎn)主要采用抗病品種、輪作和化學(xué)防治控制甜菜褐斑病[8-9]，但由于生產(chǎn)中不合理地使用農(nóng)藥，導(dǎo)致甜菜尾孢菌對(duì)多種殺菌劑的敏感性下降，對(duì)部分殺菌劑產(chǎn)生了較高的抗藥性，成為生產(chǎn)上亟待解決的難題[9]。

1 甜菜褐斑病化學(xué)防治的主要藥劑及作用機(jī)制

防治甜菜褐斑病的殺菌劑有保護(hù)類殺菌劑和內(nèi)吸性殺菌劑，其中保護(hù)性殺菌劑主要有二硫代氨基甲酸鹽類、有機(jī)錫類；內(nèi)吸性殺菌劑主要有苯并咪唑類、甾醇脫甲基化酶抑制劑和甲氧基丙烯酸類等[9]。

1.1 二硫代氨基甲酸鹽類殺菌劑

二硫代氨基甲酸鹽類殺菌劑為多作用位點(diǎn)的保護(hù)性殺菌劑，包括代森錳鋅（Mancozeb）和代森鋅（Zineb）等。藥劑在水中降解釋放出活性物質(zhì)Ethylene bisisothiocyanate sulfide（EBIS），該活性物質(zhì)在紫外線作用下可轉(zhuǎn)化為Ethylene bisisothiocyanate（EBI），EBIS和EBI均能破壞部分含巰基的酶的活性，干擾或抑制病原菌細(xì)胞質(zhì)和線粒體中6種不同生物化學(xué)途徑，從而有效地防治病害[10－11]。

1.2 有機(jī)錫類殺菌劑

有機(jī)錫類殺菌劑包括毒菌錫（Fentin-hydroxide）和薯瘟錫（Fentin-caetate）等,為線粒體呼吸抑制劑，干擾線粒體膜上電子氫氧根離子交換，抑制ATP酶活性，破壞病原菌的呼吸作用，影響孢子萌發(fā)或菌絲生長(zhǎng)[12]。

1.3 苯并咪唑類殺菌劑

苯并咪唑類殺菌劑為第一大類內(nèi)吸性殺菌劑，包括苯菌靈（Benomyl）、多菌靈（Carbendazim）和甲基托布津（Thiophanate-methyl）等。與植物次生代謝產(chǎn)物秋水仙堿極為相似，活性基團(tuán)苯并咪唑能特異地與病原菌細(xì)胞中紡錘絲的β-微管蛋白結(jié)合，阻礙微管蛋白形成，破壞紡錘絲形成，從而干擾細(xì)胞的有絲分裂，抑制芽管分隔、延長(zhǎng)、分生孢子的萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，達(dá)到抑菌效果[13-14]。在我國(guó)，此類藥劑用于防治甜菜褐斑病已有較長(zhǎng)的歷史，并且有些地區(qū)目前仍然在使用。

1.4 甾醇脫甲基化酶抑制類殺菌劑

甾醇脫甲基化酶抑制類殺菌劑（C14-demethylation inhibitors of sterol biosynthesis，DMI）為甾醇-14α去甲基化酶抑制劑，即，包括氟硅唑（Flutriafol）、苯醚甲環(huán)唑（Difenconazole）、氟醚唑（Tetraconazole）和丙環(huán)唑（Propiconazole）等。甾醇類化合物如麥角甾醇、菜子甾醇等是真菌細(xì)胞膜的主要組成成分，藥劑靶標(biāo)基因?yàn)殓薮?14α去甲基化酶基因（C-14α-demethylase gene,CYP51）通過(guò)抑制麥角甾醇合成過(guò)程中2,4-二氫羊毛甾醇的脫甲基化反應(yīng)，破壞病原菌的甾醇生物合成途徑，引起真菌生長(zhǎng)紊亂[15-18]。我國(guó)近幾年來(lái)開(kāi)始大面積推廣使用氟硅唑和苯醚甲環(huán)唑等殺菌劑防治甜菜褐斑病。

1.5 甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑為線粒體呼吸抑制劑，包括肟菌酯 （Trifloxystrobin）和吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin）等，其研發(fā)源于擔(dān)子菌如 Oudemansiella mucida （Schrad ex Fr）Hoehn和 Strobilurus tenacellus （Pers ex Fr）Singer及細(xì)菌Myxococcus fulvus等中一類天然活性產(chǎn)物β-丙烯酸酯類化合物的發(fā)現(xiàn)。1996年，先正達(dá)（Syngenta）推出了第一個(gè)商品化的丙烯酸酯類殺菌劑阿米西達(dá)（Azoxystrobin）?；钚曰鶊F(tuán)甲氧基丙烯酸（酯/酰胺）主要作用于真菌線粒體呼吸過(guò)程，與線粒體內(nèi)膜上的細(xì)胞色素復(fù)合體bc1中的細(xì)胞色素b上的Qo位點(diǎn)結(jié)合，阻斷了細(xì)胞色素b和細(xì)胞色素c1間的電子傳遞，破壞能量循環(huán)，抑制真菌孢子萌發(fā)或菌絲生長(zhǎng)[19-21]。但此類藥劑在我國(guó)尚未登記用于甜菜褐斑病的防治。

2 甜菜尾孢菌抗藥性發(fā)生現(xiàn)狀

2.1 二硫代氨基甲酸鹽類殺菌劑

二硫代氨基甲酸鹽類殺菌劑作用位點(diǎn)多，病原菌對(duì)其不易產(chǎn)生抗藥性，是最早用于防治甜菜褐斑病的殺菌劑之一，其與有機(jī)錫殺菌劑混用防治甜菜褐斑病，能顯著地提高產(chǎn)量和含糖率[22]。1995年，Bugbee建立了用于監(jiān)測(cè)甜菜尾孢菌對(duì)代森錳鋅抗藥性的藥劑濃度5和10 μg/mL[23]。1997年美國(guó)明尼蘇達(dá)州和北達(dá)科他州田間調(diào)查沒(méi)發(fā)現(xiàn)甜菜尾孢菌對(duì)代森錳鋅的耐藥性[24]，而2000年發(fā)現(xiàn)明尼蘇達(dá)州和北達(dá)科他州大部分地區(qū)甜菜尾孢菌對(duì)5 μg/mL代森錳鋅產(chǎn)生了耐藥性[25]。隨后，土耳其亦發(fā)現(xiàn)了甜菜尾孢菌對(duì)代森錳鋅的耐藥性[26]。而我國(guó)目前沒(méi)有甜菜尾孢菌對(duì)代森錳鋅耐藥性情況的相關(guān)報(bào)道，但仍需加強(qiáng)抗性監(jiān)測(cè)。

2.2 對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性

苯菌靈是第一個(gè)用于甜菜褐斑病防治的內(nèi)吸性殺菌劑[9]，至今已有40多年的歷史。20世紀(jì)70年代，歐洲、北美洲等地就開(kāi)始施用苯菌靈防治甜菜褐斑病并取得很好的防效，如希臘、美國(guó)北達(dá)科他和明尼蘇達(dá)分別始于1969年、1979年[27,9,3]。但由于苯并咪唑類殺菌劑作用位點(diǎn)單一和大面積的施用，C.beticola很快就對(duì)其產(chǎn)生了抗藥性，導(dǎo)致防治效果降低甚至完全喪失[27,9]。1973年，希臘首先報(bào)道了C.beticola對(duì)苯并咪唑類的抗藥性[27]。隨后美國(guó)、意大利、日本、印度和中國(guó)等甜菜主要種植地區(qū)均有報(bào)道[14,28-37]。C.beticola對(duì)苯并咪唑類殺菌劑抗藥性可穩(wěn)定遺傳[38,9]，如希臘自抗藥性發(fā)現(xiàn)后就沒(méi)有持續(xù)施用苯并咪唑類殺菌劑，但20多年后對(duì)多菌靈抗性頻率沒(méi)有降低反而極大地增加[9]。當(dāng)然也不能排除在其他C.beticola侵染作物或雜草上應(yīng)用所致?？剐院兔舾芯暝跓o(wú)苯菌靈情況下，離體菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和活體毒力及孢子萌發(fā)等生物學(xué)特性上均沒(méi)有差異[28]，雖然苯菌靈濃度增加，如1000 μg/mL，能降低田間病害嚴(yán)重度、孢子形成及孢子活力，但大劑量施用形成極大的選擇壓力，增大田間抗性菌株的抗藥水平和抗性頻率，不利于病害的管理[39]。

β-微管蛋白基因突變是對(duì)苯并咪唑類殺菌劑抗藥性產(chǎn)生的主要原因。Davidson通過(guò)苯菌靈系列梯度抑菌試驗(yàn)得到了能有效地區(qū)分抗、感菌株的苯菌靈濃度，該濃度為5 μg/mL。并通過(guò)分析C.beticola抗、感菌株的β-微管蛋白基因，發(fā)現(xiàn)β-微管蛋白基因198位密碼子GAG突變?yōu)镚CG，編碼的氨基酸由谷氨酸突變?yōu)楸彼?，?dǎo)致了C.beticola對(duì)并本咪唑類殺菌劑的高抗藥性或耐藥性的產(chǎn)生，同時(shí)發(fā)現(xiàn)C.beticola對(duì)多菌靈和乙霉威存在負(fù)交互抗藥性[40]，我們的初步結(jié)果與此一致[35]?；诳垢芯晷蛄胁町?，Obuya等設(shè)計(jì)了PCRRFLP分子檢測(cè)方法，利用限制性內(nèi)切酶Bsa I可區(qū)分C.beticola抗感菌株[41]，而我們則建立了Allele specific primers-PCR快速檢測(cè)區(qū)分C.beticola抗感菌株的方法（未發(fā)表），為檢測(cè)田間抗性菌株提供了可靠的工具。

2.3 對(duì)有機(jī)錫類殺菌劑的抗藥性

繼C.beticola對(duì)苯并咪唑類殺菌劑抗藥性產(chǎn)生后，生產(chǎn)上采用有機(jī)錫類殺菌劑如毒菌錫防治甜菜褐斑病并取得了較好的防治效果[42-43,3]，但隨后不久，希臘田間生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)C.beticola對(duì)毒菌錫產(chǎn)生了耐藥性，導(dǎo)致防效下降[44]，同時(shí)世界主要甜菜產(chǎn)區(qū)美國(guó)、意大利、土耳其等都相繼發(fā)現(xiàn)C.beticola對(duì)有機(jī)錫殺菌劑的抗藥性[23,26,42,45-46]。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)毒菌錫抗性的C.beticola菌株在離體情況下與野生型菌絲生長(zhǎng)速率和菌落特征均沒(méi)有差異，但毒力存在差異，抗性菌株生存競(jìng)爭(zhēng)力較弱，因此合理施用有機(jī)錫殺菌劑可降低抗性菌株的頻率[47]。

2.4 對(duì)甾醇脫甲基化酶抑制類殺菌劑的抗藥性

鑒于C.beticola對(duì)苯并咪唑類殺菌劑和有機(jī)錫殺菌劑的抗藥性，DMI因其對(duì)甜菜褐斑病具有良好的保護(hù)性和治療性而應(yīng)用到甜菜褐斑病的防治中[48]，如希臘于1979年開(kāi)始利用DMI類殺菌劑防治甜菜褐斑病[9,49]，而美國(guó)環(huán)保局（Environmental Protection Agency，EPA）于1999年至2004年間實(shí)施了利用非登記的DMI類殺菌劑氟醚唑防治甜菜褐斑病的緊急方案，2005年氟醚唑登記防治甜菜褐斑病。隨后，腈苯唑和丙環(huán)唑于2006年登記，苯醚甲環(huán)唑和丙硫菌唑于2008年登記[3]，但由于DMI殺菌劑作用位點(diǎn)特異性極強(qiáng)，致使病原菌較易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性[50]，希臘首先發(fā)現(xiàn)田間C.beticola種群對(duì)DMI類殺菌劑敏感性下降[48,51]，敏感性水平呈持續(xù)分布狀[52]，隨后在希臘發(fā)現(xiàn)C.beticola對(duì)DMI殺菌劑抗藥性菌株[43,51]，Karaoglanidis等根據(jù)菌絲生長(zhǎng)抑制率的結(jié)果，建立1 μg/mL氟硅唑和0.05 μg/mL苯醚甲環(huán)唑的單濃度藥劑監(jiān)測(cè)田間抗感菌株頻率的方法[53]。

生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DMI抗性菌株的毒力和產(chǎn)孢量弱于敏感菌株，但菌絲生長(zhǎng)速度、孢子萌發(fā)和芽管長(zhǎng)度等沒(méi)有差異[54-55]。Karaoglanidis等發(fā)現(xiàn)當(dāng)無(wú)氟硅唑處理時(shí)，DMI抗性和敏感菌株細(xì)胞膜中甾醇組成相同；氟硅唑處理后，C.beticola 脫甲基甾醇（desmethyl sterols）含量降低而齒孔醇（eburicol）、鈍葉醇（obtusifoliol）等含量增加，表明C.beticola抗感菌株的14α-脫甲基化酶活性均受到抑制。而抗性菌株在高濃度的氟硅唑處理時(shí)，雖然C-14甲基化甾醇含量增加，但仍能合成C14-甲基化甾醇從而否定了甾醇C-14脫甲基酶缺乏導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生的原因。同時(shí)氟硅唑處理C.beticola菌株時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)14α-methylfecosterol而排除了14αmethylfecosterol積累導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生的機(jī)制。根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)，其推測(cè)C.beticola對(duì)甾醇脫甲基化酶抑制劑抗性機(jī)制可能是14α-脫甲基化酶過(guò)量或細(xì)胞色素P450與藥劑親和性降低[56]。Nikou等首次報(bào)道了C.beticola CYP51基因序列，實(shí)時(shí)熒光定量分析發(fā)現(xiàn)CYP51基因過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致了C.beticola對(duì)DMI類殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生，同時(shí)發(fā)現(xiàn)高抗菌株的第169位密碼子均發(fā)生了沉默突變，由GAA突變?yōu)镚AC，根據(jù)該沉默突變?cè)O(shè)計(jì)了PCR-RFLP分子檢測(cè)方法，利用限制性內(nèi)切酶BsmAI可區(qū)分C.beticola高抗菌株[57]。

2.5 對(duì)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的抗藥性

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑如吡唑醚菌酯和肟菌酯具有極佳的保護(hù)和治療活性，能有效地抑制C.beticola孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)和孢子產(chǎn)生，離體情況下0.01 μg/mL吡唑醚菌酯和0.1 μg/mL肟菌酯能完全抑制孢子萌發(fā)[58]。研究發(fā)現(xiàn)，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑防治甜菜褐斑病的效果，肟菌酯>吡唑嘧菌酯>阿米西達(dá)，尤其阿米西達(dá)防治效果僅為中等或較差，但阿米西達(dá)與代森錳鋅、苯醚甲環(huán)唑或氟硅唑等混用效果明顯好于阿米西達(dá)單獨(dú)使用，而肟菌酯與代森錳鋅、苯醚甲環(huán)唑或氟硅唑等混用效果與肟菌酯單獨(dú)使用沒(méi)有明顯差異，但肟菌酯最佳施用期為病害發(fā)生早期[59]。

目前，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑作為甜菜褐斑病主要防治藥劑之一，在世界各甜菜產(chǎn)國(guó)相繼獲得登記，如美國(guó)于2002、2003年分別登記批準(zhǔn)肟菌酯和吡唑醚菌酯用于甜菜褐斑病的防治[3]。據(jù)報(bào)道，黃瓜白粉菌和霜霉菌［Blumeria(Erysiphe）graminis and Plasmopara viticola］等對(duì)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性[60-62]。同時(shí)由于C.beticola基因變異大，極易對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，因此必須加強(qiáng)對(duì)C.beticola對(duì)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑抗藥性的研究和檢測(cè)[63]，通過(guò)室內(nèi)紫外線誘導(dǎo)獲得了對(duì)吡唑醚菌酯具有抗藥性的甜菜尾孢菌突變菌株，抗性菌株較野生菌株產(chǎn)孢量和致病性下降，但抗藥性可穩(wěn)定遺傳，分析細(xì)胞色素b的cDNA序列發(fā)現(xiàn)，第129位密碼子由TTC突變?yōu)镚TC，編碼的氨基酸由苯丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，導(dǎo)致C.beticola菌株對(duì)吡唑醚菌酯產(chǎn)生中等抗藥性，而第143密碼子由GGT突變?yōu)锳GT，編碼的氨基酸由甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，導(dǎo)致了高抗藥性的產(chǎn)生[63]。基于第143位密碼子的突變而設(shè)計(jì)了allele specific primers-PCR分子檢測(cè)抗藥性菌株的方法，為了進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測(cè)低頻率高抗菌株的方法，但通過(guò)對(duì)田間樣品的檢測(cè)，沒(méi)有檢測(cè)到高抗性菌株，表明7年前希臘引入甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑防治甜菜褐斑病后，田間至今還沒(méi)發(fā)現(xiàn)抗性菌株，說(shuō)明甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑可持續(xù)用于甜菜褐斑病的防治[64]。但仍需在世界范圍內(nèi)對(duì)C.beticola對(duì)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑抗藥性進(jìn)行深入研究和監(jiān)測(cè)，避免和有效地延緩抗藥性的產(chǎn)生，同時(shí)為治理可能出現(xiàn)的抗藥性建立基礎(chǔ)的理論支持。

3 抗藥性治理

延緩和避免植物病原菌對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性是生產(chǎn)中亟待解決的問(wèn)題，合理有效地施藥及結(jié)合其他病害防治方法，建立科學(xué)的病害管理方案，有利于延緩和避免抗藥性產(chǎn)生，提高病害防治效率，從而保障甜菜生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。作用機(jī)制不同的殺菌劑混用或交替使用，限制作用機(jī)制類似或相同的殺菌劑在同一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)的施藥次數(shù)，按藥劑推薦使用濃度，適時(shí)施藥和減少用藥次數(shù)可有效地治理病原菌的抗藥性。甜菜褐斑病是一種多循環(huán)病害，C.beticola在一個(gè)生長(zhǎng)季可發(fā)生多次侵染，田間條件下，孢子形成周期為12d[4]，因此甜菜褐斑病的防治最佳時(shí)期為病害發(fā)生初期，當(dāng)田間初現(xiàn)癥狀，病害日侵染率≥7%和相對(duì)濕度≥87%或90%時(shí)為最佳施藥防治時(shí)期[65]，利用甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑如肟菌酯和吡唑醚菌酯能有效地治理C.beticola對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性，降低抗性菌株的頻率[9]，同時(shí)結(jié)合抗病品種、輪作和農(nóng)業(yè)措施等措施能減少初侵染源和初侵染，降低殺菌劑使用次數(shù)，可有效地延緩和避免抗藥性的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus subtilis菌株BacB[66]和甜菜褐斑病菌內(nèi)生細(xì)菌多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）、彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）、寡養(yǎng)單孢菌（Stenotrophomonas sp.）[67]對(duì)甜菜尾孢菌具有一定的防治效果，因此加大生物防治的研究，獲得較好的生防菌株對(duì)治理甜菜尾孢菌對(duì)殺菌劑的抗藥性具有重要的作用。

4 問(wèn)題與展望

國(guó)內(nèi)關(guān)于C.beticola對(duì)殺菌劑抗藥性的研究極少，僅有早期關(guān)于甜菜褐斑病菌對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性頻率、抗性水平、交互抗性和抗性遺傳等報(bào)道[32]，對(duì)當(dāng)前生產(chǎn)上主要使用新型殺菌劑如DMI類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的抗藥性情況的研究處于起步階段。而國(guó)外早在2000年就發(fā)現(xiàn)了甜菜褐斑病菌對(duì)DMI類殺菌劑的抗藥性[51]，及室內(nèi)得到了對(duì)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑具有抗藥性的菌株[63-64]，因此盡快評(píng)估我國(guó)不同地區(qū)甜菜褐斑病菌對(duì)新型殺菌劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)，建立其對(duì)新型殺菌劑的敏感基線，監(jiān)測(cè)抗藥性，探索甜菜褐斑病菌對(duì)新型殺菌劑的抗性機(jī)理，并制定合理延緩和避免抗藥性產(chǎn)生的病害管理方案，延長(zhǎng)殺菌劑使用壽命，為甜菜生產(chǎn)提供技術(shù)保障。

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