周萬青，沈 瀚

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 檢 驗科，江蘇 南 京210008）

不動桿菌是一種重要的條件致病菌，是引起院內(nèi)感染的常見病原菌?？蓪?dǎo)致廣泛的臨床感染，例如敗血癥、泌尿系感染、傷口感染、腦膜炎等，特別是院內(nèi)機(jī)械通氣相關(guān)性肺炎［1］。近年來，隨著廣譜抗生素的大量應(yīng)用，多重耐藥株和泛耐株日益增多，給臨床治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。不動桿菌的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，主要有以下幾種：滅活酶的產(chǎn)生，外膜蛋白的減少、缺失或突變，藥物的主動外排機(jī)制，藥物作用靶位如青霉素結(jié)合蛋白改變等［1］。耐藥菌株一般合并存在幾種耐藥機(jī)制，一些可移動元件如整合子的參與使得其耐藥性具有可傳遞性。其中外膜蛋白（outer membrane proteins，OMP）的改變所介導(dǎo)的抗生素耐藥越發(fā)引起人們的重視。本文就不動桿菌外膜蛋白改變所介導(dǎo)的抗生素耐藥研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)及通透特性

細(xì)菌外膜是環(huán)繞革蘭陰性菌細(xì)胞壁的一種特征性脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，外層是脂多糖，具有非常有效的通透屏障作用；內(nèi)層是磷脂。外膜屏障功能的改變介導(dǎo)的耐藥包括外膜通透性的降低和主動外排兩種機(jī)制。外膜孔蛋白（porins）穿透外膜的內(nèi)外雙層，構(gòu)成跨膜的擴(kuò)散通道。膜孔蛋白通道非常狹窄，對大分子及疏水性化合物的穿透形成有效屏障，只允許親水性小分子通過以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)運輸及交換。如果這些通道發(fā)生缺失或改變，抗生素將不能進(jìn)入細(xì)菌到達(dá)作用靶位，從而使得細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。不動桿菌的外膜通透性極低，僅為大腸埃希菌的1%－3%，這是其對多種抗生素天然耐藥的重要原因之一。與銅綠假單胞菌相比，對于頭孢菌素類藥物的通透系數(shù)要低2－7倍［1］。

抗生素通過兩種外膜通道進(jìn)入細(xì)菌：親水性抗生素的孔蛋白通道和疏水性抗生素的脂質(zhì)介導(dǎo)通道［2］。小的親水性藥物如β－內(nèi)酰胺類、氯霉素通過親水性孔蛋白通道進(jìn)入細(xì)菌；而大環(huán)內(nèi)酯類和其他疏水性藥物（氨基糖苷類、利福霉素類、新生霉素、夫西地酸、陽離子肽類）則通過脂質(zhì)層擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌；四環(huán)素類和喹諾酮類則可通過兩種通道進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，主要取決于藥物的質(zhì)子化程度［2］。

研究發(fā)現(xiàn)，除了莢膜多糖轉(zhuǎn)座子外，所有的外膜蛋白都是β桶狀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［2］。大量的β鏈條折疊構(gòu)象形成一個親水性的中心孔道。革蘭陰性細(xì)菌孔蛋白的典型結(jié)構(gòu)特點：高離子強(qiáng)度，缺乏疏水殘基，低離子選擇性，低的不穩(wěn)定指數(shù)，較高的甘氨酸成分并缺乏半胱氨酸殘基［1］。滲透壓和溫度可影響外膜蛋白的表達(dá)［3］。除了在數(shù)量表達(dá)上或是突變所造成的外膜蛋白改變外，其他一些物化因素或配體的結(jié)合作用亦可通過改變外膜孔道的大小進(jìn)而影響其對藥物的通透性。例如跨膜電位，電壓依賴性滅活是普遍的現(xiàn)象，當(dāng)電位差達(dá)到該孔蛋白的關(guān)閉閾值時，則該孔道關(guān)閉［2］。另外在酸性環(huán)境和聚胺類物質(zhì)存在時也可調(diào)節(jié)孔蛋白通道的開關(guān)［2］。最新研究表明，一價陽離子分別在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平影響外膜蛋白的表達(dá)，并且增強(qiáng)外膜蛋白的釋放，從而介導(dǎo)菌株的耐藥［4］。

2 不動桿菌外膜孔蛋白

外膜孔蛋白是細(xì)菌進(jìn)行內(nèi)外環(huán)境物質(zhì)交換的通道，也是藥物進(jìn)入菌內(nèi)的通道，當(dāng)外膜蛋白發(fā)生改變時，可影響藥物的內(nèi)滲率。一些革蘭陰性桿菌的外膜孔蛋白已經(jīng)得到了很好的研究，包括大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門菌、奇異變形桿菌等［2］。目前對不動桿菌外膜蛋白的了解不多，對其通透特性的研究更為之寥寥。不動桿菌外膜蛋白種類較少和孔蛋白較小分子量使得其通透性明顯低于其他革蘭陰性細(xì)菌［1］。對于介導(dǎo)β－內(nèi)酰胺類抗生素進(jìn)入細(xì)菌的外膜蛋白知之甚少。但是近年來，在不動桿菌中還是發(fā)現(xiàn)多種孔蛋白，如Car O蛋白［5－8］、熱修飾蛋白（heat－modifiable protein，HMP－AB）［9］、外膜蛋白 W（Omp W）［10］、Opr D 樣 蛋 白［11］、33－36 k Da蛋白［12，13］、外膜蛋白 A（Omp A）［14］等。碳青霉烯類耐藥不動桿菌中主要發(fā)現(xiàn)三種外膜蛋白缺失，分別是Car O 蛋白、33－36k Da蛋白和 Opr D樣蛋白［1］。

2.1 CarO蛋白

Limansky［5］通過SDS－PAGE 電泳分析亞胺培南（IPM）敏感和耐藥的鮑曼不動桿菌外膜蛋白的差異，發(fā)現(xiàn)IPM耐藥株存在29 k Da OMP缺失。由于在敏感株和耐藥株均未檢測到碳青霉烯酶，推測IPM抗性歸于該外膜蛋白的缺失。由于水楊酸鈉具有抑制特定OMP表達(dá)的功能，研究者隨后用16 m M水楊酸鈉處理IPM敏感株，發(fā)現(xiàn)IPM敏感株29 k Da OMP表達(dá)下降，而IPM的 MIC卻從0.5 μg／ml上升到16μg／ml。通過體外誘導(dǎo)，Limansky從敏感菌中成功選擇出了29 k Da OMP的缺失耐藥突變體。

對該蛋白進(jìn)一步研究表明其具有熱修飾性，并命名為Car O蛋白［6］。從臨床分離株中克隆到包含Car O基因的染色體位點后研究發(fā)現(xiàn)，該基因為單拷貝，編碼247個氨基酸殘基的多肽，該多肽具有典型的氨基末端信號序列，拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)為跨膜β－桶形。雖然Car O與銅綠假單胞菌中的Opr D無同源性，但二者均參與細(xì)菌對堿性氨基酸和亞胺培南的攝入［7］。37℃培養(yǎng)條件下Car O蛋白占總外膜蛋白的20%［6］，然而降低培養(yǎng)溫度將降低這一含量水平［7］。另有研究發(fā)現(xiàn)NaCl或KCl亦可影響該蛋白的表達(dá)［4］。

當(dāng)Car O編碼基因中有插入序列時，會發(fā)生插入失活導(dǎo)致Car O基因不表達(dá)［6，15］。通過二維差異電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)Car O亞型的高表達(dá)使得外膜通透性減低而介導(dǎo)耐藥［16］。由此推測其參與碳青霉烯類藥物的流入過程。然而通過質(zhì)譜研究發(fā)現(xiàn)，與Car O同時存在的另一25k Da蛋白，命名為Omp25［8］。這兩種蛋白都具有典型的β－桶狀構(gòu)象，然而只有Car O具有孔形成特性。但是Car O中并未發(fā)現(xiàn)亞胺培南的結(jié)合位點，表明這是種非特異性的單體通道。該通道對陽離子的低選擇性與銅綠假單胞菌中的Opr F和大腸埃希菌中的Omp A所形成的非特異孔蛋白特性相似［2］。

2.2 HMP－AB

鮑曼不動桿菌熱修飾蛋白（HMP－AB）基因編碼一個346氨基酸殘基、分子量為35.6 k Da的蛋白，其以單體孔蛋白的形式組裝在細(xì)菌外膜上。隨著溫度的變化，熱修飾蛋白在SDS－PAGE電泳后呈現(xiàn)出不同的遷移特性［9］。序列比對研究發(fā)現(xiàn)，HMP－AB與腸桿菌科細(xì)菌外膜蛋白A（Omp A）以及銅綠假單胞菌外膜蛋白F（Opr F）具有同源性。雖然與不解糖卟啉單胞菌熱修飾蛋白（HMP－PA）在分子活動度上相似，但二者具有不同的抗原性［1］。二級結(jié)構(gòu)分析表明，HMP－AB氨基端由172個氨基酸殘基組成，并形成8個兩性的β鏈而貫穿外膜，C端作為錨定蛋白結(jié)合在肽聚糖層，屬于Omp A樣家族。這類孔蛋白以緩慢孔蛋白著稱，其對β－內(nèi)酰胺類和糖肽類藥物的通透性依賴于藥物的大小，最大允許800Da分子量的藥物通過［9］。

2.3 Omp W

大腸埃希菌Omp W由8鏈β折疊單體組成，在脂質(zhì)層平面上形成一個狹小的離子通道。研究發(fā)現(xiàn)該通道具有轉(zhuǎn)運小分子疏水性物質(zhì)的功能［10］。不動桿菌Omp W與大腸埃希菌和銅綠假單胞菌中的Omp W具有高度同源性。其在不動桿菌中的功能尚不清楚。然而，最新研究發(fā)現(xiàn)多粘菌素耐藥突變株中該外膜蛋白呈低表達(dá)［1］。在耐頭孢曲松鼠傷寒沙門菌中Omp W 亦呈明顯低表達(dá)［10］，由此推測Omp W可能參與藥物的攝取并介導(dǎo)耐藥。

2.4 Opr D樣蛋白

OprD是銅綠假單胞菌中的一種外膜孔蛋白，由18鏈β折疊單體組成。對銅綠假單胞菌碳青霉烯類耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，Opr D具有攝取堿性氨基酸、小分子短肽、亞胺培南和美羅培南功能［1］。Dupont等［11］在耐藥鮑曼不動桿菌中同樣發(fā)現(xiàn)了一43 k Da的外膜蛋白的丟失，隨后的質(zhì)譜分析表明這一43 k Da外膜蛋白與銅綠假單胞菌Opr D具有同源性，故又稱 Opr D－like蛋白。因此，對于不動桿菌，Opr D樣蛋白可能發(fā)揮碳青霉烯類特異性通道，而Car O則只是一種非特異性的孔道作用［11］。

2.5 33－36kDa蛋白

Clark［12］在1996年發(fā)現(xiàn)33－36 k Da外膜蛋白介導(dǎo)了鮑曼不動桿菌亞胺培南耐藥。Tomás等［13］隨后對該類蛋白氨基酸序列進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其具有革蘭陰性細(xì)菌外膜孔蛋白的典型特征。通過攜帶該基因的穿梭質(zhì)粒進(jìn)行補(bǔ)償研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白的補(bǔ)償表達(dá)可恢復(fù)耐藥株對碳青霉烯類藥物的敏感性。

2.6 Omp A

38 k Da的外膜蛋白A（Omp A）在鮑曼、瓊氏、耐放射性不動桿菌中具有較高的同源性［1］。但是作者并未對上述蛋白與 HMP－AB進(jìn)行比較分析。Vashist等［17］研究發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌Omp A是具有轉(zhuǎn)運小分子物質(zhì)的跨膜孔蛋白。在對耐放射不動桿菌中Omp A蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，其包裹在分泌囊泡中，在細(xì)菌的致病性、生物膜形成以及調(diào)節(jié)表面粘附中發(fā)揮作用［1］。同樣在鮑曼不動桿菌中，Omp A作為毒力因子通過外膜囊泡的分泌誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的死亡［14］。

2.7 其他蛋白

Quale等［18］發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌中37－、44－、47－k Da外膜蛋白的低表達(dá)與 AmpC 酶的存在共同介導(dǎo)了耐藥的發(fā)生。Bou等［19］發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)OXA－24酶的耐藥鮑曼不動桿菌存在22 k Da和33 k Da兩種外膜蛋白的低表達(dá)。Felipe等［20］發(fā)現(xiàn)一22.5 k Da外膜蛋白缺失參與碳青霉烯類耐藥。由此可見，外膜通透性降低合并β－內(nèi)酰胺酶的存在可共同介導(dǎo)了高水平耐藥。Luo等［21］研究發(fā)現(xiàn)Car O和Opr D樣蛋白的下調(diào)合并34 k Da外排泵的上調(diào)表達(dá)可造成碳青霉烯類耐藥。生理濃度水平的NaCl或KCl可造成鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類、碳青霉烯類、喹諾酮類以及粘菌素類藥物的耐受性。其主要通過減少Car O和33－36 k Da蛋白的表達(dá)并促進(jìn)以上兩種外膜蛋白的釋放，以及上調(diào)外排泵水平實現(xiàn)［4］。Yun等［22］對一株多重耐藥鮑曼不動桿菌進(jìn)行亞最小抑菌濃度的四環(huán)素作用后發(fā)現(xiàn)，該菌株出現(xiàn)Omp A38、Omp A32、Car O以及Omp W蛋白的表達(dá)下調(diào)。

3 結(jié)語

不動桿菌可造成院內(nèi)免疫低下患者的大范圍流行，其可通過接觸污染物或暴露的環(huán)境在患者之間進(jìn)行傳播。近年來，β－內(nèi)酰胺類藥物特別是碳青霉烯類藥物的大量及不合理應(yīng)用，造成多重耐藥鮑曼不動桿菌的檢出率逐年提高［23］。耐藥性的產(chǎn)生可由一種或幾種機(jī)制共同導(dǎo)致。外膜蛋白的減少、缺失或突變在不動桿菌碳青霉烯類耐藥過程中發(fā)揮重要作用。對于外膜蛋白參與其他藥物耐藥的機(jī)制還不清楚，是否存在對特定藥物的特異通道蛋白尚待研究。隨著研究的不斷深入，有更多的外膜蛋白被發(fā)現(xiàn)［24］，其在介導(dǎo)耐藥中的具體機(jī)制也將被逐個探明。最新研究發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌外膜蛋白具有免疫診斷價值［25，26］。由此可見，對不動桿菌外膜蛋白的深入研究，將會為臨床多重耐藥不動桿菌感染的早期免疫診斷和新型抗外膜蛋白藥物的研制提供依據(jù)。

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