于禮，梁米芳

·綜述·

基因工程抗體親和力成熟研究進(jìn)展

于禮，梁米芳

自 1975 年，Kohler 創(chuàng)建雜交瘤技術(shù)并成功制備單克隆抗體以來，人們已研制出數(shù)以千計(jì)的單克隆抗體。單克隆抗體因其高度的靶向特異性已經(jīng)成為科學(xué)研究，疾病診斷，藥物靶向治療等不可或缺的工具。由于雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體為鼠源性，在人體應(yīng)用時(shí)易發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，難以有效激發(fā)人體免疫效應(yīng)，而人源的基因工程抗體很好地解決了這一問題。借助 DNA 重組和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，人們可以獲得人源單克隆抗體，并可在基因水平對(duì)抗體進(jìn)行拼接、修飾、重新組裝成為一種新型抗體。目前美國(guó) FDA 已批準(zhǔn)22 種單克隆抗體藥物，主要用于腫瘤、病毒和炎癥性疾病的治療，并且現(xiàn)有超過 200 種單克隆抗體正進(jìn)行臨床試驗(yàn)?？贵w作為藥物蛋白極具市場(chǎng)價(jià)值，2007 年抗體產(chǎn)業(yè)市值超過 270 億美元[1]，2010 年市值已超過 480 億美元，已經(jīng)成為生物治療行業(yè)的新興產(chǎn)業(yè)和重要支柱。自基因工程抗體問世以來，人們發(fā)現(xiàn)某些抗體雖具有良好的結(jié)合特異性，但缺乏親和力，尤其由天然噬菌體抗體庫(kù)制備的抗體沒有經(jīng)過抗原誘導(dǎo)的免疫進(jìn)化，親和力低，極大限制了抗體的臨床應(yīng)用，因此，抗體體外親和力成熟研究就成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，本文對(duì)基因工程抗體親和力成熟的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 抗體體內(nèi)親和力成熟

在機(jī)體體液免疫系統(tǒng)中，B 淋巴細(xì)胞應(yīng)對(duì)抗原刺激誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，并在反復(fù)暴露于抗原的過程中，產(chǎn)生高親和力的抗體，這涉及兩個(gè)相互關(guān)聯(lián)的過程：首先在骨髓內(nèi)編碼抗體輕重鏈的胚系基因片段經(jīng) V-(D)-J 隨機(jī)重排產(chǎn)生超過106的組合，這是抗體特異性免疫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)；其次，機(jī)體接受抗原刺激后，在二級(jí)淋巴器官的生發(fā)中心，抗體基因尤其是互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity determining region，CDR）發(fā)生高頻突變，突變導(dǎo)致抗體結(jié)合特性改變。經(jīng)過濾泡樹突狀細(xì)胞提呈抗原，只有與抗原親和力最高的 B 細(xì)胞將選擇生存進(jìn)一步分化為漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞。近期研究表明，活化的胞嘧啶核苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AID）將胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，突變后的尿嘧啶引發(fā)錯(cuò)配和堿基剪切并引發(fā) DNA 修復(fù)，而不正確修復(fù)進(jìn)一步加劇突變產(chǎn)生，導(dǎo)致抗體基因高頻突變誘發(fā)高親和力抗體產(chǎn)生[2-5]。目前以 AID 誘發(fā)高頻突變?yōu)榛A(chǔ)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于抗體體外親和力成熟。

2 基因工程抗體體外親和力成熟

抗體體外親和力成熟主要是模擬體內(nèi)親和力成熟過程，采取各種策略對(duì)抗體基因進(jìn)行相應(yīng)突變，構(gòu)建突變抗體庫(kù)，通過親和篩選獲得高親和力抗體。在基因工程抗體體外親和力成熟的過程中，選擇突變區(qū)域以及如何引入突變是一個(gè)關(guān)鍵問題，目前突變策略可分為三大類，隨機(jī)突變、置換和定向突變。近期研究中抗體體外親和力成熟的策略仍以隨機(jī)突變、置換和熱點(diǎn)區(qū)突變?yōu)橹?，但基于結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)抗體親和力提升的報(bào)道也越來越多。

2.1 易錯(cuò) PCR

易錯(cuò) PCR 指在采用聚合酶對(duì)目的基因擴(kuò)增時(shí)，通過應(yīng)用錯(cuò)配率高的聚合酶或調(diào)整反應(yīng)條件等，以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，并通過多輪 PCR 反復(fù)進(jìn)行隨機(jī)誘變，累計(jì)突變效應(yīng)，最終獲得目的蛋白的隨機(jī)突變體。Groves 等[6]采用易錯(cuò) PCR 結(jié)合核糖體展示技術(shù)，成功將來源于噬菌體抗體庫(kù)的抗牛胰島素抗體親和力由 5.8 nmol/L 提升至21 pmol/L。Pavoni 等[7]針對(duì)一株腫瘤相關(guān)抗原 CEA 單克隆抗體采用易錯(cuò) PCR 誘導(dǎo)抗體輕重鏈基因突變，構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)，成功將抗體親和力提升 10倍，達(dá)到 nmol/L 水平。Wang 等[8]對(duì) HCV E2 糖蛋白中和抗體 HC-1 采用易錯(cuò) PCR 對(duì)抗體輕重鏈基因隨機(jī)突變，通過酵母文庫(kù)使抗體親和力提升 92 倍，其抗病毒中和活性相應(yīng)提升 30 倍。

2.2 鏈置換

鏈置換通過固定抗體兩條鏈中的一條鏈，對(duì)另一條鏈構(gòu)建具有足夠多樣性的置換文庫(kù)，隨機(jī)組合有可能產(chǎn)生最佳鏈組合，經(jīng)過噬菌體抗體庫(kù)篩選可獲得高親和力的新抗體。因抗體重鏈在抗結(jié)合活性和結(jié)構(gòu)方面的重要性，鏈置換策略常采用輕鏈替換，盡量避免鏈替換后抗體結(jié)合特異性發(fā)生變化。Lou 等[9]分別在肉毒桿菌毒素 A、B 型特異性抗體的基礎(chǔ)上，采用酵母展示技術(shù)構(gòu)建輕鏈置換庫(kù)，成功將抗體親和力提升 9倍和 77 倍，其親和力提升歸因于抗原抗體復(fù)合物解離速率的降低。Hur 等[10]為便于構(gòu)建鏈置換庫(kù)，采用雙質(zhì)粒系統(tǒng)分別對(duì)抗體輕重鏈構(gòu)建噬菌體文庫(kù)，在初篩抗體的基礎(chǔ)上構(gòu)建人源大容量非免疫輕鏈庫(kù)，成功將一株抗IL-15 抗體親和力提升 36 倍。Brockmann 等[11]在合成抗體庫(kù)初篩選抗溶菌酶抗體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建庫(kù)容為 7 × 108的輕鏈置換庫(kù)，將抗體親和力提升近 20 倍，達(dá)到 0.8 nmol/L。鏈置換策略的關(guān)鍵是置換文庫(kù)庫(kù)容大小，只有置換鏈基因有足夠的多樣性，才能為抗體提供適宜的、高親和力的配伍鏈。

2.3 CDR 區(qū)定向突變

體細(xì)胞高頻突變并非完全隨機(jī)，而傾向于發(fā)生在與抗原接觸的互補(bǔ)決定區(qū)，尤其是CDR3 作為抗原結(jié)合的核心部位是抗體突變最頻發(fā)的區(qū)段。Steidl 等[12]對(duì)一株粒細(xì)胞集落刺激因子抗體的重鏈 CDR2 區(qū)和輕鏈 CDR3 區(qū)依次隨機(jī)替換，經(jīng)噬菌體抗體庫(kù)篩選獲得親和力成熟抗體，通過合理組合有效突變將抗體親和力提升 5000 倍，達(dá)到 7 pmol/L。Lowe 等[13]對(duì) IL-15 細(xì)胞因子抗體通過輕重鏈 CDR3 區(qū)定向誘導(dǎo)突變，經(jīng)過噬菌體抗體庫(kù)親和篩選，獲得抗體DISC0280 使親和力提升 228 倍，細(xì)胞功能活性提升 4000倍，晶體結(jié)構(gòu)顯示突變后重鏈 CDR3 區(qū) 6 個(gè)氨基酸在結(jié)合位點(diǎn)形成一個(gè) α 螺旋。Yoon 等[14]對(duì)腫瘤相關(guān)糖蛋白TAG-72 人源化抗體 AKA 重鏈 CDR3 區(qū)域引入隨機(jī)突變，采用噬菌體抗體庫(kù)親和篩選，獲得抗體 3E8 的親和力提升 22 倍，并保持原有結(jié)合特異性，為腫瘤診斷和治療提供有效手段。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在編碼可變區(qū)的基因中存在一些位點(diǎn)頻繁突變，而在突變后高親和力抗體中，這些位點(diǎn)數(shù)目往往會(huì)下降，稱之為熱點(diǎn)（hotspot）[15]。Muller 等[16]對(duì)一株前列腺特異抗原的 scFv 抗體采用 CDR 熱點(diǎn)區(qū)突變的方法，對(duì)抗體輕鏈 CDR1 和重鏈 CDR1-3 區(qū)域內(nèi)熱點(diǎn)區(qū)隨機(jī)突變，然后通過有效突變合理組合，最終使抗體親和力提升 8.5 倍。

2.4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞高頻突變

哺乳動(dòng)物展示技術(shù)受限于庫(kù)容，難以產(chǎn)生足夠的多樣性用于篩選目的抗體。Seo 等[17]將哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)與體外細(xì)胞高頻突變相結(jié)合，開發(fā)出一種新基因工程抗體制備方法，并成功應(yīng)用于人源抗體的親和力成熟。在人體內(nèi)體細(xì)胞高頻突變依賴于胞嘧啶核苷脫氨酶，它作用于 B 細(xì)胞抗體可變區(qū)的 DNA 序列，介導(dǎo)熱點(diǎn)區(qū)胞嘧啶脫氨反應(yīng)進(jìn)而誘發(fā)高頻突變。研究表明高頻突變效應(yīng)可以通過在體外淋巴細(xì)胞和非 B 淋巴細(xì)胞中引入重組的 AID 實(shí)現(xiàn)，Bower 等[18]在 HEK293T 細(xì)胞中同時(shí)引入抗體基因和 AID，通過 AID介導(dǎo)的脫氨作用實(shí)現(xiàn)抗體基因高頻突變，模擬體內(nèi)親和力成熟過程，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分選，成功將一株抗神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗體親和力提升至 pmol/L 級(jí)。Cumbers 等[19]采用雞B 淋巴細(xì)胞系 DT40 在體外培養(yǎng)過程中通過 AID 效應(yīng)誘導(dǎo)高頻突變，突變累計(jì)形成一個(gè)抗體庫(kù)，通過親和篩選可獲得親和力成熟的抗體。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建 DT40-SW 細(xì)胞系優(yōu)化系統(tǒng)，通過引入外源性雌激素衍生物 4-OHT 可選擇性啟動(dòng)和終止 AID 依賴的突變效應(yīng)，并通過部分破壞細(xì)胞XRCC3 基因的 DNA 損傷修復(fù)作用，增強(qiáng)有益于抗體親和力成熟的點(diǎn)突變頻率[20]。Kajita 等[21]采用 DT40-SW 系統(tǒng)成功將一株抗硝基苯胺單克隆抗體的親和力提升 600 倍。哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外高頻突變技術(shù)的出現(xiàn)克服了哺乳動(dòng)物展示技術(shù)的很多限制，在最大程度上接近體內(nèi)抗體親和力成熟過程，實(shí)現(xiàn)了在全人源、分泌型 IgG 抗體的直接篩選和功能改進(jìn)，在基因工程抗體研發(fā)中具有極大的應(yīng)用前景。

2.5 基于三維結(jié)構(gòu)的抗體親和力成熟

隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)是目前新藥研發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。但由于蛋白結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，基于結(jié)構(gòu)的功能改進(jìn)一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著大量抗原抗體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的解析，人們對(duì)抗原抗體間相互作用的理解不斷加深，基于結(jié)構(gòu)提升抗體親和力的成功報(bào)道也日益增多。從形態(tài)學(xué)上來說，當(dāng)抗體結(jié)合不同抗原時(shí)，抗體 CDR 結(jié)構(gòu)上也各有特點(diǎn)。當(dāng)抗原為大分子蛋白時(shí)，抗體 CDR 區(qū)呈扁平狀，與抗原接觸區(qū)域較大；與半抗原結(jié)合時(shí)，抗體 CDR區(qū)呈現(xiàn)特異性較深的凹陷區(qū)；與多肽結(jié)合時(shí)，抗體 CDR 區(qū)呈特異性凹陷的小溝狀。Clark 等[22]在一株已具有高親和力抗整合素 VLA1 抗體晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，從抗體氨基酸骨架微調(diào)、側(cè)鏈重新裝配、靜電作用優(yōu)化三個(gè)方面選擇突變位點(diǎn)，結(jié)果從 80 個(gè)抗體突變克隆中發(fā)現(xiàn) 10 個(gè)突變位點(diǎn)提升抗體親和力，然后通過突變位點(diǎn)組合獲得一株融合 4 個(gè)突變位點(diǎn)的抗體，其親和力達(dá)到 850 pmol/L。結(jié)構(gòu)顯示突變使抗體骨架發(fā)生微調(diào)，增強(qiáng)結(jié)構(gòu)靈活性，與抗原互補(bǔ)性更趨完善，同時(shí)突變引入的氫鍵作用也參與提升親和力。

理想狀態(tài)下，高精度的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)能夠直觀顯示抗原抗體間相互作用，從而選擇突變方法和突變位點(diǎn)進(jìn)行親和力改造。因受限于高精度抗原抗體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)成為人們研究的熱點(diǎn)。Barderas 等[23]采用 CDR 步移法對(duì)一株人源抗胃泌素 scFv 抗體 TA4 初步優(yōu)化后，使抗體親和力提升 15 ～ 35 倍，然后通過計(jì)算機(jī)模擬抗原抗體結(jié)合構(gòu)象，分析結(jié)合位點(diǎn)的相互作用以選擇氨基酸定點(diǎn)突變，最終將抗體親和力提升 454倍。結(jié)構(gòu)顯示輕鏈 CDR3 區(qū) 96 位脯氨酸突變?cè)诳贵w親和力成熟中尤為重要，其突變可能增加抗體 CDR 區(qū)與抗原的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性。

抗原抗體間相互作用為基于三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行抗體親和力改造提供線索，同時(shí)，親和力成熟成功案例也加深人們對(duì)抗原抗體相互作用的認(rèn)識(shí)。經(jīng)過親和力成熟的抗體與祖系抗體在三維結(jié)構(gòu)上的差異可以很好地解釋親和力提升的分子機(jī)制。Cauerhff 等[24]在解析鼠單克隆抗體 D44.1 及突變體F10.6.6 與溶菌酶復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)抗體親和力提升并不是通過形成額外的氫鍵和范德華力，也不是抗原抗體結(jié)合面積的增加，而是通過抗原結(jié)合區(qū)域發(fā)生結(jié)構(gòu)微調(diào)，使之在結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性方面更適應(yīng)抗原表位，縮短了抗原抗體相互作用間的距離而增強(qiáng)非極性作用。另外，突變體晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)抗原抗體接觸區(qū)域互補(bǔ)性的提升同樣允許水分子位于接觸區(qū)域，而水分子的存在為抗原抗體間的氫鍵搭建了橋梁。近期一項(xiàng)高精度抗原抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)表明少量水分子存在于抗原抗體接觸界面，與抗原抗體形成氫鍵。水分子填充了抗原抗體接觸表面的空隙，增強(qiáng)結(jié)合能量 1 ～ 2 kcal （1 kcal = 4.1868 kJ）。Zahnd 等[25]報(bào)道晶體結(jié)構(gòu)也顯示改進(jìn)抗體的點(diǎn)突變均未與配體形成直接相互作用，表明抗體骨架結(jié)構(gòu)的微小改變或者側(cè)鏈分子間相互作用可提升抗原抗體結(jié)合能力。因此，基于晶體結(jié)構(gòu)的分子改進(jìn)和分子間相互作用分析，兩者相輔相成，互相促進(jìn)發(fā)展，已成為基因工程抗體親和力成熟的重要手段。

2.6 組合策略

為使抗體親和力成熟達(dá)到最好效果，人們可根據(jù)抗體特性采用多種突變策略組合，各種基于不同原理的突變策略組合可對(duì)基因工程抗體的親和力成熟產(chǎn)生協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)。Luginbühl 等[26]通過對(duì)一朊病毒線性多肽抗體采用易錯(cuò)PCR 和 DNA 重組相結(jié)合的突變策略，采用核糖體展示技術(shù)成功將親和力提升至 1 pmol/L，晶體結(jié)構(gòu)顯示抗體的輕鏈 Asn39Asp和重鏈 Gly107Ala 突變?yōu)橛H和力提升提供了新的離子鍵和疏水作用。Kobayashi 等[27]在一株針對(duì)雌二醇E2 的 scFv-E4 基礎(chǔ)上，先在抗體重鏈 CDR2-3 和輕鏈CDR1-3 區(qū)采用 CDR 重組使抗體親和力提升 5 倍；繼而在抗體輕重鏈區(qū)采用易錯(cuò) PCR 使抗體親和力提升近3 倍。Barderas 等[23]采用 CDR 步移法和基于計(jì)算機(jī)模擬的分子設(shè)計(jì)對(duì)一株人源抗胃泌素 scFv 抗體 TA4 優(yōu)化，使抗體親和力提升 454 倍。

3 抗體庫(kù)展示技術(shù)

各種突變策略需依賴適當(dāng)?shù)目贵w展示技術(shù)才可實(shí)現(xiàn)抗體的體外親和力成熟，目前應(yīng)用成熟的基因工程抗體展示技術(shù)包括噬菌體展示、酵母菌展示、核糖體展示以及哺乳動(dòng)物展示。噬菌體展示技術(shù)作為最經(jīng)典的展示技術(shù)，在易錯(cuò)PCR、置換和定向突變策略中成功使大量基因工程抗體實(shí)現(xiàn)了親和力的提升。核糖體展示技術(shù)是一種細(xì)胞外展示系統(tǒng)，無細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程，克服轉(zhuǎn)染效率和蛋白表達(dá)因素的限制，因此容易構(gòu)建大庫(kù)容量的抗體庫(kù)（＞ 1012）。酵母展示技術(shù)中酵母系統(tǒng)作為真核生物，具有翻譯后修飾所需的細(xì)胞器和酶，可正確折疊表達(dá)抗體，且蛋白表達(dá)水平偏差小，克服了菌體展示技術(shù)中蛋白表達(dá)及修飾存在偏差的問題。各種抗體庫(kù)展示技術(shù)各有優(yōu)劣，均可以應(yīng)用于抗體體外親和力成熟的研究，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)需根據(jù)抗體特性和突變策略選擇不同的展示技術(shù)。

4 治療性抗體親和力成熟的應(yīng)用

治療性抗體藥物因其廣闊的市場(chǎng)前景使得此類藥物研發(fā)和改進(jìn)成為人們研究的熱點(diǎn)，CDR 區(qū)定點(diǎn)突變、易錯(cuò)PCR 和基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)等多種策略均成功用于治療性抗體的親和力改進(jìn)。palivizumab 作為 FDA 批準(zhǔn)的呼吸道合胞病毒治療抗體，在少數(shù)人群中難以產(chǎn)生保護(hù)作用，并難以有效抑制病毒在上呼吸道復(fù)制，通過在抗體輕重鏈 6 個(gè) CDR區(qū)定向引入突變，組合有效突變使抗體親和力提升 1000 倍以上，抗病毒中和活性提升 44 倍，但突變抗體產(chǎn)生的非特異性結(jié)合也導(dǎo)致其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)保護(hù)活性僅提高 2 倍，在去除導(dǎo)致非特異性結(jié)合的氨基酸突變的基礎(chǔ)上獲得的單克隆抗體motavizumab 親和力提升 70 倍，中和活性提升20 倍，在體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中抑制病毒活性增強(qiáng) 100 倍[28-29]。Chen 等[30]在基于針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的治療性單克隆抗體bevacizumab 的基礎(chǔ)上，采用 CDR 區(qū)突變策略引入6 個(gè)氨基酸突變，開發(fā)出親和力成熟的單克隆抗體藥物ranibizumab，使抗體與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的結(jié)合活性提升100 倍以上。FDA 批準(zhǔn)的治療性抗體cetuximab 通過結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體阻斷配體結(jié)合發(fā)揮效應(yīng)，Lippow 等[31]基于計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)結(jié)合體外定點(diǎn)突變使抗體親和力提升10 倍，達(dá)到 52 pmol/L。

5 結(jié)語

隨著基因工程抗體親和力成熟研究的不斷深入，人們對(duì)抗原抗體相互作用的認(rèn)識(shí)也更加深入。X 射線晶體衍射技術(shù)研究抗體親和力成熟的過程提示抗體親和力成熟過程中并沒有抗原抗體結(jié)合面積的增加，而可能通過氨基酸調(diào)整使得抗原和抗體的結(jié)合互補(bǔ)性更趨完善；熱動(dòng)力學(xué)研究認(rèn)為體外抗體親和力成熟多歸于抗原抗體復(fù)合物解離速率的降低[9]，這些認(rèn)識(shí)為抗體親和力成熟策略提供理論支持和選擇依據(jù)。抗體作為藥物蛋白已經(jīng)成為生物行業(yè)的新興產(chǎn)業(yè)和重要支柱，基因工程抗體在基因和蛋白水平上進(jìn)行功能改進(jìn)，除提升抗體親和力較關(guān)鍵外，抗體的結(jié)合特異性、穩(wěn)定性和體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)特性也需統(tǒng)籌兼顧，綜合提高抗體在診斷和治療應(yīng)用中的效能?？傊?，隨著體外抗體親和力成熟突變策略不斷完善，尤其是基于結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示結(jié)合高頻突變技術(shù)研究不斷發(fā)展，將更加廣泛地應(yīng)用并促進(jìn)抗體產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.007

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

梁米芳，Email：mifangl@vip.sina.com

2012-04-28