劉 蕓，姚文清，耿英芝，孫英偉，陳靜乙，王 博，韓仰歡，孫海波，雷 露，李建東，于丹梅，宮潤妍

遼寧省首次發(fā)現(xiàn)的新布尼亞病毒其培養(yǎng)特性的研究＊

劉 蕓1，姚文清1，耿英芝1，孫英偉1，陳靜乙2，王 博1，韓仰歡1，孫海波1，雷 露1，李建東3，于丹梅4，宮潤妍4

目的探討發(fā)熱伴粒細胞血小板減少綜合征布尼亞病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV）在細胞分離培養(yǎng)時表現(xiàn)的特異性。方法收集發(fā)病一周以內發(fā)熱伴粒細胞血小板減少綜合征患者的血液，首先做血清學檢測排除漢坦病毒（Hantavirus，HV），然后將樣本采用多種細胞培養(yǎng)的方法進行病毒分離。最后采用逆轉錄（RT－PCR）方法對病毒進行鑒定。結果從我省發(fā)熱伴出血征候群血液樣本分離出病毒12株，經(jīng)鑒定均為新布尼亞病毒。結論我省東部山區(qū)及丘陵地帶有新布尼亞病毒流行，其臨床癥狀及體征與腎綜合征出血熱極為相似。但體外細胞培養(yǎng)及核苷酸序列卻存在著明顯的差別。

新布尼亞病毒；RT－PCR；細胞培養(yǎng)

R373

A

自2003年SARS疫情后，我國對突發(fā)新發(fā)傳染 病的研究取得重大進展，蟲媒病毒性疾病新的布尼亞病毒不斷被發(fā)現(xiàn)。目前布尼亞病毒科被分為5個屬，包括約350種病毒，其中至少有60種病毒可引起人類或動物的疾?。?］。其中發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒（SFTSV）簡稱“新布尼亞病毒”［2］就是“蜱咬病”元兇。我省在2009－2010年在國家科技重大專項“傳染病檢測技術平臺—發(fā)熱伴出血征候群”項目病例監(jiān)測中采集了發(fā)熱伴血小板減少綜合征患者急性期血液做病原培養(yǎng)及核酸檢測。本文共選擇了我省5個監(jiān)測點的120份樣本，經(jīng)檢測陽性病毒12株。病例主要分布在我省東北部的山區(qū)及丘陵地帶。

1 材料與方法

1．1 材料 收集我省發(fā)熱伴出血監(jiān)測哨點急性期患者血，采用間接免疫熒光、Ig M抗體、熒光定量PCR、細胞培養(yǎng)等方法進行測定。其中間接免疫熒光血清抗體由北京索萊寶科技有限公司提供；細胞培養(yǎng)所用試劑為GIBCO產(chǎn)品；VERO－E6、VERO、BHK、C6／36、HEP2等細胞均由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所（以下簡稱病毒所）提供；用于漢坦病毒檢測的試劑盒來源于Promega公司，新型病毒檢測的試劑盒來源于中山大學達安基因公司；用于新型病毒和漢坦病毒檢測的引物和序列及兩種病毒患者血清Ig M檢測試劑盒均由病毒所提供。

1．2 方法 取血清或全血上清液各200μL，一份用于提取病毒核酸，另一份用于感染已長成單層VERO或VERO－E6細胞。用于細胞培養(yǎng)的樣本，無論是否有細胞病變（CPE）均盲傳3代，每個代次都刮取少量的細胞液滴在凹孔玻片上，吹干后冷丙酮固定制成抗原片備用。然后將核酸檢測陽性的患者恢復期血清混合后取適量用p H7．2 PBS做1∶20倍稀釋，做間接免疫熒光（IFAT）檢測［3］。同時將每一代收獲的細胞病毒液凍融后取200μL提取病毒核酸，采用Real－Time熒光定量PCR或RTPCR凝膠成像的方法［4］觀察病毒對細胞的感染情況。

2 結 果

自2009－2010年起共選擇血液樣本120人份，分離出病毒株13株，其中漢坦病毒1株，新型病毒12株。按樣本采集的地區(qū)－采樣年代－收樣編號，將每一個細胞分離株進行編號。

2．1 選擇2009年全部的病毒株、2010年的部分病毒株與漢坦病毒的毒株做比較觀察其血清學和生物學變化。選擇 LFC－09－16，LFC－09－18，LFS－09－23 3株傳代超過7代細胞病變明顯而且穩(wěn)定的病毒株分別感染幾種不同的細胞，37℃5%CO2培養(yǎng)觀察其生長變化，全部試驗見表1、2。

2．2 新病毒感染VERO－E6第12 d時細胞出現(xiàn)的病變見圖1，2。

2．3 新病毒感染VERO－E6第15 d后刮取細胞制成混懸液滴在凹孔玻片上做免疫熒光染色見圖片3。

表1 新病毒與漢坦病毒血清學及生物學檢測結果比較Tab．1 The comparison of serologic test results about SFTSV and Hantaan viruse

表2 新病毒株培養(yǎng)第12 d時在各種細胞上的生長變化Tab．2 SFTSV cultures changes of cell growth on twelve days

2．4 新布尼亞病毒抗原性檢測 選擇三株病毒傳代超過5代的病毒株用Hank’s液從10－1起做系列稀釋并接種VERO－E6細胞，每天刮取細胞做IFAT染色并與漢坦病毒作比較。漢坦病毒感染細胞24 h后就有微弱的熒光顆?？梢姡罡呦♂尪瓤蛇_10－6［5］，而新布尼亞病毒最早出現(xiàn)熒光顆粒是第9天，最高滴度10－3。

2．5 將6株新病毒株提取的RNA采用新型病毒M片段通用外套引物逆轉錄擴增后的產(chǎn)物用1．5%瓊脂糖凝膠檢測，使用凝膠成像儀觀察條帶，結果顯示：6株病毒株條帶位置均在700 bp左右，無陽性對照，僅做陰性對照，見圖4。

2．6 根據(jù)不同年代、不同地域選擇2009年細胞分離株2株，2010年細胞分離株3株采用23對引物對該病毒L、M、S全部核苷酸序列進行檢測，結果證明遼寧分離株確為新布尼亞病毒。與漢坦病毒不同的是新布尼亞病毒沒有明顯的地域聚集性［6］。不同地區(qū)核苷酸排列差別不大即同源性強，此項試驗均由病毒所出血熱實驗室老師指導下完成，后續(xù)工作仍在進行中。

3 討 論

3．1 鑒于新布尼亞病毒有很多的血清學、生物學及流行病學特點目前尚未完全清楚，有些研究工作仍在繼續(xù)。所以在實際工作中有些試驗結論是參照HTN病毒的特征比對而得出的。新布尼亞病毒與漢坦病毒體外培養(yǎng)相比較：培養(yǎng)時間短，一般初代培養(yǎng)需要13～15 d，大多數(shù)病毒在初代培養(yǎng)時就有明顯的CPE改變，不同的細胞有不同的表現(xiàn)形式；而HTN病毒初代培養(yǎng)需20～30 d，視細胞狀態(tài)而定。無論使用哪種細胞，病毒培養(yǎng)多少代，全過程均無CPE改變。

圖4 為6株細胞分離株M片段擴增產(chǎn)物圖注：使用的 DNA Marker為 DL2000；1－6：為 DNA 條帶為特異性目的片段（分子量為700 bp）；7：為陰性對照PCR擴增反應條件為：95℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，擴增40個循環(huán)；延伸72℃10 min。Fig．4 The M segment amplification product of six cell separation plants

3．2 新布尼亞病毒同HTN病毒一樣能感染VERO、VERO－E6﹑BHK﹑C6／36等細胞而不感染HEP2，具有相似的蟲媒病毒培養(yǎng)特性，但用VERO、C6／36細胞培養(yǎng)時無明顯的CPE改變，只是細胞比正常對照細胞略顯腫脹而已；BHK細胞易衰老脫落在形態(tài)學上不易區(qū)分CPE變化；VERO細胞敏感性好，病毒易感染，因細胞無病變產(chǎn)生不直觀，建議做疫苗株篩選時使用該細胞。做常規(guī)監(jiān)測工作時最好采用VERO－E6細胞做病毒分離，對于病毒含量高的樣本在初代培養(yǎng)時就能觀察到明顯的細胞病變，采用Reat－Time熒光定量PCR檢測細胞培養(yǎng)液可見陽性曲線。對于初代培養(yǎng)陰性的樣本至少需要盲傳3代取上清液做熒光定量PCR檢測陰性后方可棄之。

3．3 將感染新布尼亞病毒的細胞刮取少量制成懸液滴在凹孔玻片上，吹干后冷丙酮固定并用20倍稀釋的患者恢復期血清做IFAT檢測。第一、二代時熒光清晰可見，隨著病毒傳代次數(shù)的增高，細胞CPE出現(xiàn)的時間越早，一般由最初的12～15 d縮短至6～10 d，而此時將細胞懸液滴片做免疫熒光染色時熒光顆粒消失，繼續(xù)傳代時有可能再次出現(xiàn)，經(jīng)常出現(xiàn)時隱時現(xiàn)的現(xiàn)象，這可能是因為病毒在細胞內增殖時間短或病毒傳代次數(shù)少還不夠穩(wěn)定所致。

3．4 除LFC－09－16株在做漢坦病毒項目檢測時出現(xiàn)陽性，其它株均為陰性。可能是該患者同時感染兩種病毒，我們只分離出其中一種，或者使用的檢測試劑還缺乏唯一性。

3．5 新布尼亞病毒致VERO－E6等細胞病變特點是：（1）細胞形態(tài)發(fā)生改變，能使VERO－E6由原來的多邊形變成柳葉形；（2）細胞病變變化較緩慢且本底細胞逐漸脫落減少，從細胞出現(xiàn)腫脹變形開始達到90%CPE時全程需要2 w左右。

3．6 新布尼亞病毒抗原性檢測結果證明：新布尼亞病毒感染細胞后病毒顆粒復制出現(xiàn)時間比HTNV長且毒力也較弱。這可能與我們所選擇的病毒株傳代還不夠穩(wěn)定，或者選擇的檢測方法不適合新型病毒有關，有待于今后工作中進一步證實。

3．7 鑒于新布尼亞病毒對于IFAT檢測法有“時隱時現(xiàn)”即不穩(wěn)定的特點，樣本在做抗原檢測時最好不要采用該方法。試驗證明采用Reat－time熒光定量PCR的方法檢測待測樣本中是否含有新病毒是一種既快速方便又直觀的好方法。

4 結 語

血清學可將白蛉病毒屬分為兩組，白蛉熱病毒組（Sandfly fever）和烏庫尼米病毒組（Uukuniemi）。其中白蛉熱病毒組已發(fā)現(xiàn)55個不同血清型，而烏庫尼米病毒組已包含13個血清型。白蛉熱組病毒通常由感染節(jié)肢動物（白蛉、蚊、蠓等）叮咬傳播人類。烏庫尼米病毒經(jīng)由蜱傳播。蜱是媒介生物，常通過叮咬吸血傳播病原體（病毒、細菌、寄生蟲 ）使人患病。蜱可傳播多種疾病。已知蜱可攜帶83種病毒、31種細菌、32種原蟲，其中大多數(shù)是重要的自然疫源性疾病和人獸共患病，如森林腦炎、蜱傳出血熱、Q熱、蜱傳斑疹傷寒、野兔熱、萊姆病、人粒細胞無形體病、巴爾通體感染等，給人類健康及畜牧業(yè)帶來很大危害。

由于全球氣候的變化，人類的活動及世界動物經(jīng)貿(mào)的流動，一些布尼亞病毒在本地區(qū)擴大流行，甚至跨地區(qū)、跨洲流行越來越受到人們的重視［7－8］。新發(fā)現(xiàn)的病毒同其它布尼亞科病毒一樣具有其相似的生物學特性：如病毒顆粒呈球形，直徑80～100 nm，包膜，表面有棘突?；蚪M包含3個單股負鏈RNA片段（L、M和S），L片段全長為6 368個核苷酸，包含單一讀碼框架編碼RNA依賴的RNA聚合酶；M片段全長為3 378個核苷酸，含有單一的讀碼框架，編碼1 073個氨基酸的糖蛋白前體；S片段是一個雙義RNA，基因組以雙向的方式編碼病毒核蛋白和非結構蛋白。病毒基因組末端序列高度保守，與白蛉病毒屬其他病毒成員相同，可形成鍋柄狀結構［9］。目前我省所分離的新布尼亞病毒經(jīng)鑒定已具備了布尼亞科病毒的特征，其地理流行病學特點主要在我省的丹東、撫順、鐵嶺地區(qū)的山地、丘陵地帶，沈陽市內五區(qū)及新民市區(qū)患者血液樣本并未分離到新布尼亞病毒。因本病多發(fā)于夏秋季山區(qū)農(nóng)村且人群普遍易感等特點，下一步我們將側重于蜱、蚊等傳播媒介的研究。鑒于新布尼亞病毒入侵人體后血液中含量高不排除有人傳人的可能性，很可能造成局部地區(qū)人間流行，這一點區(qū)別與漢坦病毒。另外，應當做好個人防護，盡量避免在蜱類主要棲息地如草地、樹林等長時間坐臥，穿緊袖長衣褲，裸露的皮膚涂驅避劑。盡快將該病毒對人類可能造成的危害納入常規(guī)監(jiān)測中。新布尼亞病毒成功的分離不僅對我省今后疫源地的確定、劃分、演變等流行病學研究起到積極地作用同時對臨床的診治也提供了有力的幫助。

（承蒙中國疾病預防控制中心病毒預防控制所出血熱室李建東老師在核酸鑒定及病毒序列分析方面給予的幫助，張全福老師在病毒分離方面給予大力支持，特此一并致謝?。?/p>

［1］章域震，張海林，梁國棟．與人類疾病相關的布尼安病毒研究進展［J］．中國人獸共患病學報，2009，25（6）：589－593．

［2］李德新．發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒概述［J］．中華實驗和臨床病毒學雜志，2011，25（2）：81－84．

［3］黃禎祥，洪濤．醫(yī)學病毒學基礎及實驗技術［M］．1990：197－198．

［4］劉東瀛，肖紅，郭廣松，等．RT－PCR方法擴增白蛉熱病毒M片段的研究［J］．中國病毒學，2003，18（5）：437－440．

［5］劉蕓，秦彩明，姚文清，等．遼寧省嚙齒類動物腎綜合征出血熱病毒株的分離及鑒定［J］．中國衛(wèi)生檢驗，2009，19（7）：1625－1627．

［6］王世文，杭長壽，王華，等．我國漢坦病毒基因型和基因亞型的分布研究［J］．病毒學報，2002，18（3）：211－216．

［7］Buchen－Osmond C．ICTVd B－The Universal Virus Database，Version 4［M／OI］．Columbia University，New York，USA．http：／／www．ncbi．nlm．gov／Ictv／fs index．htm．

［8］The American Committee on Arthropod－Borne Viruses．2000 annual report on the catalogue of arthropod－Borne and selected vertebrate viruses of the world［C］．2002，January 31．

［9］Karabatsos N．International catalogue of arboviruses including certain othre of vertebrates［M］．3rd ed，American Society of Tropical Medicine and Hygiene，San Antonio，Texas，1985：71．

Cultivating characteristics and biological characteristics of the new virus of Bunyaviridae isolated from the patient serum in Liaoning province

LIU Yun1，YAO Wen－qing1，GENG Ying－zhi1，SUN Ying－wei1，CHEN Jing－yi2，WANG Bo1，HAN Yang－h(huán)uan1，SUN Hai－bo1，LEI Lu1，LI Jian－dong3，YU Dan－mei4，GONG Run－Yan4

（1．Liaoning Centerfor Disease Control and Prevention，Shenyang 110005；2．China Medical University，Shengyang 110005；3．China Center for Disease Control and Prevention ，Beijing 100052；4．Dandong Center for Disease Control and Prevention，Dandong 118000，China）

To explore the specificity of Severe fever with granulocyte thrombocytopenia syndrome virus in many cells．Blood samples of patients with fever and leukothrombopenia for no more than one week was collected and had a serologic test for Hantavirus，then isolated the virus by using different kinds of cells．RT－PCR was adopted to identify virus in our research．Twelve virus strains were separated from samples of fever and bleeding blood symptoms in Liaoning province．The virus was identified SFTSV．It has had an epidemic of bunyaviridae virus in mountain district and hills in east of Liaoning Province．It is similar with hemorrhagic fever with renal syndrome at clinical symptoms and signs，but there is obvious distinction between them when culturing in cells．

Bunyaviridae；RT－PCR；cell culturing

1．遼寧省疾病預防控制中心，沈陽 110005；2．中國醫(yī)科大學，沈陽 110005；3．中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，北京100052；4．丹東市疾病預防控制中心，丹東 118000；Email：LY．169＠163．com

1002－2694（2012）03－0237－04

＊艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治項目遼寧及周邊?。ㄊ校﹤魅静〔≡V流行規(guī)律研究（2009ZX10004－209）和遼寧省科技廳衛(wèi)生安全重點實驗室項目（2007403016）聯(lián)合資助

姚文清，Email：yaowenqing＠lncdc．com

2011－04－21；

2012－01－17