郭邦成，劉 翔，郝 瓊，閆立群，謝明英，景懷琦，王 鑫，梁俊容

寧夏志賀菌病原學(xué)特征分析＊

郭邦成1，劉 翔1，郝 瓊1，閆立群1，謝明英1，景懷琦2，王 鑫2，梁俊容2

目的探討寧夏地區(qū)志賀菌菌群分布、藥物敏感性情況，并通過同源性分析研究其分子流行病學(xué)特征，為菌痢防控提供依據(jù)。方法通過系統(tǒng)生化條（API20E）鑒別菌株，用血清玻片凝集鑒定菌型，采用K－B法檢測(cè)分離菌株對(duì)10種常用抗生素的敏感性，并應(yīng)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)（PFGE）進(jìn)行分子分型，所得結(jié)果用Bio Numerics V4·0軟件UPGMA方法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果176株志賀菌中，福氏志賀菌112株，占63．64%，其中福氏2b型52株，占29．55%；宋內(nèi)志賀氏菌64株，占36．36%。藥敏試驗(yàn)顯示耐藥率最高的藥物為氨芐西林、萘啶酸、四環(huán)素、利福平；其次為阿莫西林、復(fù)方新諾明；而敏感性最高藥物依次為環(huán)丙沙星（CIP）、頭孢噻肟和頭孢噻吩，其中福氏志賀菌和宋內(nèi)志賀菌對(duì)10種抗生素的耐藥譜略顯不同；112株福氏志賀菌共分為36個(gè)帶型，其中，JZXN11．NX06、JZXN11．NX07、JZXN11．NX021、JZXN11．NX0025占所有分型菌株的57．14%，為我省主要的暴發(fā)型。64株宋內(nèi)志賀菌分為21個(gè)帶型，J16X01．NX0011和J16X01．NX0012為兩個(gè)主要流行帶型，分別占分型菌株的31．25%和15．63%。結(jié)論本省志賀菌流行以福氏為主，其中F2b為優(yōu)勢(shì)菌型，F(xiàn)4c和宋內(nèi)氏菌檢出率顯著增高；志賀菌對(duì)氨芐西林（AMP）、四環(huán)素（Te）、阿莫西林（AML）和萘啶酸耐藥率最高，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重；PFGE型別呈現(xiàn)多元化流行特點(diǎn)，流行的優(yōu)勢(shì)帶型減弱、多種型別并存的復(fù)雜形態(tài)。

脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）；志賀氏菌；藥敏分析

志賀菌是引起夏秋季急性腹瀉的主要病原菌之一，它在自然界中分布廣泛，對(duì)人的感染劑量甚小，致病性高，危害大且菌型復(fù)雜。據(jù)研究報(bào)道，志賀菌近年來的流行菌型不斷變遷，隨著臨床上抗生素的廣泛使用，其耐藥性也日益嚴(yán)重［1］。因此，研究志賀菌菌群的分布趨勢(shì)及耐藥性，對(duì)探索其流行規(guī)律、控制發(fā)病具有重要的意義。我們對(duì)寧夏地區(qū)近年來從腹瀉病人中分離到的志賀菌菌株進(jìn)行血清凝集、耐藥性分析和脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）分型研究，以了解本省志賀菌的菌群分布、耐藥性現(xiàn)狀及分子分型特征和遺傳變異關(guān)系，為痢疾的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 菌株來源 收集2002－2010年銀川、中衛(wèi)、海原等地食物中毒病例及腹瀉病例糞便中分離的176株志賀菌。

1．2 試劑和儀器 分離用的SS、MaC、克氏雙糖購(gòu)自路橋生物有限技術(shù)公司；API20E鑒定條購(gòu)自梅里埃生物公司；志賀氏菌診斷血清購(gòu)自上海天潤(rùn)有限公司；藥敏紙片購(gòu)自BD公司；質(zhì)控菌株選用金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922由國(guó)家疾控中心提供。

限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、NotⅠ購(gòu)自大連寶生物工程有限公司Ta KaRa產(chǎn)品；瓊脂糖SeaKem Gold Agarose購(gòu)自Cambrex Bio Science Rockland；蛋白酶K（MERCK公司產(chǎn)品）；脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀為Bio－Rad CHEF－DRⅢ系統(tǒng)和 Bio－Rad CHEF－Mapper系統(tǒng)；凝膠成像儀Bio－Rad Gel Doc 2000系統(tǒng)；細(xì)菌濁度儀bio Mérieux Vitek colorimeter；其他儀器包括恒溫水浴箱、離心機(jī)等。

1．3 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn) 細(xì)菌培養(yǎng)根據(jù)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程，按常規(guī)方法進(jìn)行，純培養(yǎng)后再進(jìn)行生化及血清學(xué)鑒定。藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法（K－B法），按美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）2001操作及判斷結(jié)果，并以標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控。

1．4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）分析 參照美國(guó)CDCPulseNet USA 的統(tǒng)一方法［6］。

2 結(jié) 果

2．1 菌型分布結(jié)果 分離的176株菌經(jīng)API20E生化條鑒定為志賀氏菌，再用4種志賀氏菌診斷血清進(jìn)一步確證，最后用群、型血清進(jìn)行分型。經(jīng)鑒定B群福氏志賀氏菌112株（63．64%），D群宋內(nèi)氏志賀氏菌64株（36．36%），而志賀氏菌中的A、C群未查見（表1）。

表1 76株志賀氏菌菌群和亞型分布情況Tab．1 The distribution on flora and subtypes of 176 Shigella

2．2 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 176株分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，福氏志賀菌對(duì)氨芐西林（AMP）、四環(huán)素（Te）、阿莫西林（AML）、復(fù)方新諾明（SXT）耐藥率較高，分別為100%、100%、100%、85．38%，對(duì)頭孢噻吩（KF）、環(huán)丙沙星（CIP）、慶大霉素（CN）和頭孢噻肟（CTX）較為敏感；宋內(nèi)志賀菌對(duì)四環(huán)素（Te）、奈啶酸（NA）、復(fù)方新諾明（SXT）、利福平（RD）耐藥性均為100%，對(duì)頭孢噻吩（KF）、環(huán)丙沙星（CIP）和頭孢噻肟（CTX）最為敏感（表2）；所有菌株都具有較高的多重耐藥現(xiàn)象，均出現(xiàn)4種及4種以上的耐藥（表3）。

2．3 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）結(jié)果

2．3．1 福氏志賀菌PFGE結(jié)果 分離的112株福氏志賀菌及H9812經(jīng)Not I內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行PFGE分型，并將PFGE條帶采用Bio Numerics4．0軟件進(jìn)行聚類分析，見圖1。結(jié)果顯示，所有試驗(yàn)菌株P(guān)FGE帶型相似系數(shù)在60．19%～96．18%之間，帶型之間存在任何差異的分為不同型別，共分成36種帶型，JZXN11．NX06、JZXN11．NX07、JZXN11．NX021、JZXN11．NX0025為主要型別，占所有分型菌株的（64／112）57．14%，這4個(gè)克隆系遺傳距離親緣關(guān)系較近，帶型的聚類相似性為80%，除這4個(gè)克隆系的菌株以外，其他帶型的菌株分布比較散在，而且數(shù)量較少。

表2 不同菌型志賀菌的耐藥率Tab．2 Resistance rates of different types of Shigella

表3 福氏與宋內(nèi)志賀菌多重耐藥性的比較Tab．3 Comparison on multi－drug resistance of Shigella flexneri and Shigella sonnei

圖1 福氏志賀菌PFGE分型圖譜Fig．1 Cluster analysis map of the Shigella’s PFGE pattern

2．3．2 宋內(nèi)志賀菌PFGE分型結(jié)果 64株宋內(nèi)志賀菌經(jīng)XBa I內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行PFGE分型，并將PFGE條帶采用BioNumerics 4．0軟件進(jìn)行聚類分析，見圖2。結(jié)果顯示，所有試驗(yàn)菌株P(guān)FGE帶型相似系數(shù)在64%～99%之間，帶型之間存在任何差異的分為不同型別，共分成21種帶型，J16X01．NX0011和J16X01．NX0012聚類相似性為94%，屬于同一個(gè)克隆系，涵蓋菌株占實(shí)驗(yàn)菌株的46．88%，為兩個(gè)主要流行帶型。

圖2 宋內(nèi)氏志賀菌PFGE分型圖譜Fig．2 Cluster analysis map of the Shigella sonnei PFGE pattern

3 討 論

據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，志賀菌流行趨勢(shì)在發(fā)達(dá)國(guó)家主要以宋內(nèi)志賀菌為主，發(fā)展中國(guó)家以福氏志賀菌為主［2］。2005年全國(guó)志賀菌監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)各省市分離到的志賀菌大部分屬于B群，即福氏志賀菌，但宋內(nèi)氏志賀菌的分離率呈現(xiàn)迅速上升態(tài)勢(shì)［3］。我們對(duì)本省2002—2010年176株志賀氏菌的菌型分布情況進(jìn)行分析，菌型以福氏志賀菌為主，占63．64%，其次為宋內(nèi)志賀氏菌，占36．36%，B群福氏志賀菌以F2b和F4c亞型血清型為主，分別占29．55%和18．18%，這與我國(guó)菌痢的優(yōu)勢(shì)菌型為福氏志賀氏菌2a不相符［4］，A群和C群未檢出。上世紀(jì)80年代，該省志賀菌主要以F2b為主，F(xiàn)4c和宋內(nèi)志賀菌未查見。本次研究表明，目前我省菌群比例正在發(fā)生顯著的變化，菌痢呈現(xiàn)多元化流行特點(diǎn)，流行菌型優(yōu)勢(shì)減弱、多種亞型并存的復(fù)雜形態(tài)。因此，及時(shí)分析志賀菌菌型分布，掌握流行菌型變遷，可為更好的有針對(duì)性的對(duì)志賀菌采取防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

據(jù)報(bào)道，由于臨床上常用的氨芐西林、復(fù)方新諾明、四環(huán)素等抗生素抗性增長(zhǎng)較快，多重耐藥情況普遍存在［5］。本研究顯示：寧夏主要流行菌型（F2b、F4c、宋內(nèi)志賀菌）之間的耐藥譜存在較大的差異，福氏F2b和F4c對(duì)氨芐西林（AMP）、四環(huán)素（Te）、阿莫西林（AML）產(chǎn)生100%的耐藥性，其中F2b一直做為該地區(qū)的主要流行菌型，對(duì)十種抗生素均具有較高的耐藥性，僅對(duì)慶大霉素（CN）較為敏感（3．85%），F(xiàn)4c為近年來的新發(fā)菌型，對(duì)多數(shù)抗生素還較為敏感；宋內(nèi)志賀菌對(duì)四環(huán)素（Te）、奈啶酸（NA）、復(fù)方新諾明（SXT）耐藥性最為嚴(yán)重，均達(dá)到100%，對(duì)頭孢噻吩（KF）、環(huán)丙沙星（CIP）、頭孢噻肟（CTX）最為敏感，分別為3．70%、0、0；所有分離菌株均存在4種或4種以上的多重耐藥現(xiàn)象。因此，寧夏分離菌株不同血清型的耐藥譜具有一定的差異，同一血清型不同亞型之間的耐藥性亦存在著較大的差異，而且志賀菌多重耐藥現(xiàn)象已較為嚴(yán)重，應(yīng)當(dāng)引起我們的高度重視。對(duì)于痢疾患者的治療，首先應(yīng)進(jìn)行分離培養(yǎng)、血清分型和藥物敏感性試驗(yàn)，從而具有針對(duì)性的使用抗生素，不能單憑臨床經(jīng)驗(yàn)用藥。

PFGE分型技術(shù)被認(rèn)為是分子生物分型的金標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)菌全基因組DNA應(yīng)用稀有酶切位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶切割后，經(jīng)PFGE進(jìn)行分型，建立細(xì)菌菌株P(guān)FGE指紋資料庫(kù)，通過Internet網(wǎng)絡(luò)在各實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行DNA圖譜的快速傳遞及比對(duì)、分析，以及時(shí)確定不同地區(qū)、不同來源的菌株的遺傳關(guān)系，進(jìn)而確定傳染源、流行范圍等［6－7］。本文對(duì)分離鑒定的176株志賀菌用Bio Numerics V4．0軟件進(jìn)行聚類分析，按照80%的相似度將福氏志賀菌株分為36個(gè)型，其中JZXN11．NX06、JZXN11．NX07、JZXN11．NX021、JZXN11．NX0025為4個(gè)主要的帶型，占分型菌株的57．14%，各型之間的同源性在60．19%～96．18%之間，因此，PFGE分型結(jié)果表明，眾多基因型的出現(xiàn)，在一定程度上說明寧夏志賀菌的變異度比較大且呈現(xiàn)多樣性。盡管福氏志賀菌具有共同的血清群，但同一群內(nèi)不同亞型之間的同源性較低，不同地區(qū)分離菌株的同一血清亞型之間存在較高的同源性；所有宋內(nèi)氏志賀菌分為21個(gè)PFGE基因型，雖然菌株不是太多，但帶型較多，大部分屬于來源高度相似的克隆系。

通過對(duì)寧夏志賀菌的耐藥性分析及PFGE分型，初步了解該省志賀菌的耐藥狀況及PFGE分型的優(yōu)勢(shì)菌型，對(duì)寧夏痢疾的防控具有指導(dǎo)性作用?？傊緦?shí)驗(yàn)首次利用分子分型技術(shù)對(duì)寧夏志賀菌進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，發(fā)現(xiàn)寧夏省志賀菌株具有多樣性和聚集性的特點(diǎn)，首次建立了寧夏志賀菌PFGE數(shù)據(jù)庫(kù)，為本省志賀菌的日常監(jiān)測(cè)和相關(guān)疫情的處理建立了良好的基礎(chǔ)。

［1］錢慧敏，莊菱，董晨，等．江蘇省2008－2009年志賀菌菌型分布及耐藥性分析［J］．江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，21（4）：16－17．

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［3］馬宏，王建麗，黃麗莉，等．傷寒沙門菌PFGE基因分型研究［J］．醫(yī)藥論壇雜志，2006，10（27）：22－23．

［4］黃長(zhǎng)敏，徐文杰，李艷，等．志賀菌菌型調(diào)查及耐藥譜R質(zhì)粒檢測(cè)［J］．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，7（7）：28－33．

［5］陳小麗．183株志賀菌的菌群分布及藥敏分析［J］．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2006，18（4）：45－48．

［6］易旭，夏勝利，張錦，等．2007年中國(guó)四省福氏志賀菌分離菌株的毒力基因檢測(cè)和PFGE分析［J］．中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2010，26（8）：77－79．

［7］蘇文莉，王勇，張玲，等．弗氏志賀菌4c和2a型菌株的脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型特征［J］．生物技術(shù)通訊，2009，20（2）：155－157．

Pathogenic characterization of Shigella isolated from Ningxia

GUO Bang－cheng1，LIU Xiang1，HAO Qiong1，YAN Li－qun1，XIE Ming－ying1JING Huai－qi2，WANG Xin2，LIANG Jun－rong2

（1．Ningxia Center for Disease Control and Prevention，Yinchuan 750004，China；2．China Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China）

The objective of the present study was to investigate the distribution and drug susceptibility of Shigella bacteria in Ningxia，and provide the basis for prevention and control of bacillary dysentery through homology analysis of molecular epidemiology．Biochemistry of API20E system was used to identify strains，and the bacteria categories were tested by slide agglutination with a serum．The sensitivity of strain to 10 commonly used antibiotics was detected with Kirby－Bauer assay，and pulsed－field gel electrophoresis（PFGE）was used for molecular typing．The results were analysed by Bio Numerics V4．0 and UPGMA method．Among the 176 Shigella，there were 64 Shigella sonnet（36．36%）and 112 Shigella flexneri（63．64%）which containing 52 Shigella flexneri 2b（29．55%）．Results showed that drugs with higher resistance rate were ampicillin，nalidixic acid，tetracycline and rifampin，following by amoxicillin and cotrimoxazole．The most sensitive drugs were ciprofloxacin（CIP），cefotaxime and cephalothin；the test also showed that Shigella flexneri and Shigella sonnet had slight difference in resistance spectrum to 10 antibiotics．The 112 Shigella flexneri were divided into 36 banding patterns，in which JZXN11．NX06，JZXN11．NX07，JZXN11．NX021，JZXN11 and NX0025，accounting for 57．14%，were the main outbreak types in Ningxia．The 64 Shigella sonnet were divided into 21 banding patterns，in which J16X01．NX0011 and J16X01．NX0012 were the 2 epidemic banding patterns，accounting for 31．25%and 15．63%respectively．It indicates that in Ningxia，the most popular Shigella bacteria is Shigella flexneri，and F2b is the dominant serotype．The detection rate of F4c and Shigella sonnet have decreased significantly．The drug resistance rate of Shigella to ampicillin （AMP），tetracycline（Te）and amoxicillin（AML）are the highest，and the situation of multi－drug resistance is serious．The PFGE have type presented a diverse epidemic pattern．The advantaged bands are less popular than before and there is coexistence for various types．

pulsed－field gel electrophoresis（PFGE）；Shigella；sensitivity analysis

2．中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京102206

R378．2

A

1002－2694（2012）03－0252－04

＊國(guó)家“十一五”傳染病科技重大專項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)技術(shù)平臺(tái)項(xiàng)目（2009zx10004203）

景懷琦，Email：jinghuaiqi＠icdc．cn

1．寧夏疾病預(yù)防控制中心，銀川 750004；

2011－11－11；

2012－01－11