黃小波，袁 磊，王偉杰，賈 靜，文心田，3，曹三杰

流行性乙型腦炎是由黃病毒科乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis viruses．JEV）引起的蚊媒性人獸共患病，能夠引起人類嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變［1］。乙型腦炎主要流行于亞洲及太平洋地區(qū)，有明顯季節(jié)性，一般蚊蟲孳生的7－9月是其發(fā)病高峰期。目前已有24個國家和地區(qū)有乙腦流行的報道，我國除新疆和青海省外，其他各省均有局部暴發(fā)或流行的報道［2］。四川省為全國乙腦高發(fā)地區(qū)，近年來發(fā)病率在2／10萬－10／10萬之間，疫情在全國排名靠前。四川省乙腦高發(fā)區(qū)主要分布在成都平原及川東地區(qū)，如巴中、達州、廣安、南充、遂寧以及內(nèi)江等地［3］。1957年四川首次分離出基因Ⅲ型乙腦病毒（CH－13株），2002年湯德元等在四川內(nèi)江地區(qū)分離得到1株基因Ⅲ型乙腦病毒［4］，隨后在2004年，王環(huán)宇等從四川巴中地區(qū)采集的蚊蟲標本中首次分離得到6株基因Ⅰ型乙腦病毒［5］。

“5．12”地震后，降雨量的增多，導使蚊蟲的大量滋生，增加了乙腦傳染的幾率，再加上環(huán)境的劇烈變化可能會導致病毒的變異，因此做好乙腦的防控工作顯得尤為重要。本次研究對2009年分離自四川地區(qū)的2株JEV的E基因核酸序列、E基因推導氨基酸序列、E蛋白結(jié)構(gòu)域突變情況與基因型進行分析研究，了解分離株的部分分子生物學特征，為四川地區(qū)流行性乙型腦炎病毒的分子生物學研究與DNA疫苗的研制提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 病毒株 JEV－CZ1株與JEV－NJ1株分別為本實驗室從采集自四川崇州地區(qū)豬場庫蚊樣品與四川內(nèi)江地區(qū)豬流產(chǎn)死胎腦組織中分離獲得，由本實驗室鑒定并保存。

1．2 菌種及主要試劑 大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19－T Simple Vector載體購自大連寶生物工程有限公司；TRNzol總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒；Taq DNA聚合酶；DNA MarkerⅢ購自北京天根生化科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Bio Basic公司。

1．3 標本來源與病毒分離 2009年7月28日在四川省崇州市的3個豬場采集的蚊蟲標本，按體態(tài)特征分類為庫蚊、按蚊和伊蚊，每類蚊蟲按100只／管分裝于凍存管，浸入液氮中保存。同年8月5日在四川內(nèi)江市的1個豬場采集的流產(chǎn)死胎腦脊液與腦組織，裝袋后用錫箔紙包裹，浸入液氮中保存。將采集的樣品研磨稀釋過濾后接種于金黃色地鼠腎細胞（BHK－21細胞）進行傳代培養(yǎng)，獲得2株乙型腦炎病毒，分別命名為JEV－CZ1株與JEV－NJ1株。

1．4 病毒E基因的RT－PCR擴增

1．4．1 引物的設(shè)計與合成 參考GenBank收錄的SA14－14－2、SA14、SC04－12等10株乙型腦炎病毒的E基因序列，利用DNAMAN軟件對這10株毒株的E基因進行相似性分析，以SA14－14－2為參照確定其基因組252－2509區(qū)段為擴增靶序列。利用Primer 5軟件合成了一對引物，下劃線為酶切位點：上 游：5’－CCGCTCGAGTTCTTCAAGTTTACAGCATTAGC－3’； 下 游： 5’－CCGGAATTCTTTCTTGTGATGTCAATGGCA－3’。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，預計擴增片段為2258bp。

1．4．2 病毒RNA的提取 采用TRNzol總RNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書操作提取分離株病毒液的總RNA，于－70℃保存。

1．4．3 病毒cDNA的合成 用PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒說明書操作，采用10μL體系，將病毒液總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1．4．4 E基因的擴增 以上述cDNA為模板，采用25μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 13μL，10×PCR Buffer 2．5μL，MgCl2（25mmol／L）2μL，dNTPs（2．5mmol／L）3μL，上游與下游引物（10pmol／L）各1μL，cDNA 模板2μL，Taq DNA 聚合酶（2．5 U／μL）0．5μL。反應(yīng)條件：94 ℃預變性5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min（30個循環(huán)）；72℃補充延伸10min。取5μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條件：80V，20min。

1．5 病毒E基因的克隆及測序 電泳檢測出現(xiàn)預計條帶后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收E基因，將回收產(chǎn)物與pMD19－T Simple Vector載體連接，再將連接產(chǎn)物傳化入感受態(tài)大腸桿菌細胞DH5α。利用PMD19－T載體的氨芐青霉素抗性篩選出陽性菌落，擴大培養(yǎng)后作菌液PCR鑒定，小提質(zhì)粒，用XhoⅠ與EcoRⅠ進行雙酶切鑒定后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1．6 病毒E基因的序列分析

1．6．1 E基因核苷酸序列同源性分析 運用DNAMAN軟件將JEV－CZ1株與JEV－NJ1株的E基因核酸序列與GenBank收錄的JEV參考毒株的相應(yīng)序列進行同源性比對。

1．6．2 E基因推導氨基酸序列分析 運用DNAMAN軟件推導出分離株E基因編碼的氨基酸序列并與GenBank收錄的JEV參考毒株的相應(yīng)序列進行同源性分析。并對分離株E蛋白活性區(qū)（E1－E411位）3個結(jié)構(gòu)域的氨基酸差異情況進行了統(tǒng)計分析。

1．6．3 系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建 采用乙腦病毒E基因分型方法，選擇乙腦病毒E基因（基因組977－2476區(qū)段），從GenBank中選取各個國家和地區(qū)包括各個基因型的34株參考毒株，另選1株墨累谷腦炎病毒（MVE）作為外群，用ClustalX軟件進行堿基配對，種系分析運用MEGA4．1軟件的Neighbor（鄰系接合法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，以確定分離株的基因型別。

2 結(jié) 果

2．1 RT－PCR擴增結(jié)果 利用RT－PCR方法擴增出病毒E基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，與DNA MarkerⅢ比較，大小在2 000bp和3 000bp之間，與預期片段大小相符。

2．2 E基因的克隆與鑒定結(jié)果 將分離株E基因重組質(zhì)粒用XhoⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，分別得到大小約為2 200bp與2 700bp 2條片段，與目的基因和載體片段大小相符，證明對分離株E基因的克隆成功。

2．3 E基因的同源性分析結(jié)果 將JEV－CZ1株與JEV－NJ1株的E基因核酸序列同GenBank上發(fā)表的JEV參考毒株的相應(yīng)序列進行同源性比對，結(jié)果表明：JEV－CZ1株核酸序列與SA14－14－2（減毒活疫苗株）、SA－14（中國山西）、SC04－12（中國四川）、SC04－16（中國四川）、HN04－11（中國河南）、HN04－40（中國河南）、VN22（越南）株相應(yīng)序列的同源性分別為87．6%，87．7%，98．5%，98．9%，98．4%，97．9%，98．9%，JEV－NJ1株核酸序列與上述7株病毒相應(yīng)序列的同源性分別為99．6%，99．7%，91．1%，91．2%，91．0%，90．8%，91．1%（表1）。

表1 不同毒株E基因核酸同源性比對結(jié)果Tab．1 Homology comparison of E gene nucleotide sequences among different strains

2．4 E基因推導氨基酸序列分析結(jié)果

2．4．1 氨基酸序列同源性分析結(jié)果 JEV－CZ1株E基 因 推 導 的 氨 基 酸 序 列 與 SA14－14－2、SA－14、SC04－12、SC04－16、HN04－11、HN04－40、VN22株相應(yīng)序列的同源性分別為97．2%，97．3%，99．2%，99．2%，99．1%，98．1%，99．2%。JEV－NJ1株 E基因推導的氨基酸序列與上述7株病毒相應(yīng)序列的同源 性 分 別 為 99．2%，99．4%，97．5%，97．5%，97．3%，96．4%，97．5%（表2）。

2．4．2 E蛋白活性區(qū)氨基酸差異分析 JEV－CZ1株與疫苗株SA14－14－2株在E蛋白3個結(jié)構(gòu)域中（DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ）有15個氨基酸的差異；JEVNJ1株有3處差異（表3）。

2．5 系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建結(jié)果 乙型腦炎病毒E基因分型結(jié)果顯示，所有乙腦病毒分布于5個拓撲結(jié)構(gòu)群，本次研究的JEV－CZ1株屬于基因Ⅰ型，并與2004年分離自四川的毒株與越南分離的毒株遺傳關(guān)系較近，JEV－NJ1屬于基因Ⅲ型，與疫苗株SA14－14－2株以及以往四川與上海分離的毒株遺傳關(guān)系較近（圖1）。

3 討 論

E蛋白是病毒的包膜蛋白，為主要蛋白，有病毒的抗原決定簇。其分子量為53kD，由500個氨基酸殘基組成。由E蛋白形成的表面抗原決定簇具有血凝活性和中和活性，能和血凝抑制抗體結(jié)合，刺激機體產(chǎn)生中和抗體，保護機體免受病毒攻擊，與誘導宿主機體的免疫應(yīng)答密切相關(guān)［6］。JEV－CZ1株與疫苗株SA14－14－2的E基因核酸序列同源性為87．6%，氨基酸序列同源性為97．2%，核酸同源性較低，但該區(qū)段的核酸差異一般發(fā)生于氨基酸密碼子的第3位，即突變的位點多以沉默突變的形式存在；而JEV－NJ1株與疫苗株核酸與氨基酸同源性為均在99%以上。SA14－14－2株與JEV－CZ1株屬于不同基因型，因此關(guān)于SA14－14－2株減毒疫苗對Ⅰ型乙腦病毒的保護力如何應(yīng)進一步研究。

表2 不同毒株E基因推導氨基酸序列同源性比對結(jié)果Tab．2 Homology comparison of E protein amino acid sequences among different strains

圖1 E基因序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig．1 Phylogenetic tree analysis on E gene nucleotide sequence

通過對E蛋白結(jié)構(gòu)域的分析，發(fā)現(xiàn)JEV－CZ1株與疫苗株SA14－14－2在3個結(jié)構(gòu)域中有15個氨基酸差異；而JEV－NJ1株只有3處差異；有學者的研究表明E304和E335兩個Cys所形成的二硫鍵是抗原抗體結(jié)合的必要結(jié)構(gòu)［7］，該兩分離株在這兩個位點的Cys都沒有發(fā)生變異。研究表明E60～E68的氨基酸序列 Cys－Tyr－His－Ala－Ser－Val－Thr－Asp－Thr對病毒引起細胞免疫至關(guān)重要［8］，JEV－CZ1株在E67位的Asp被替換成Glu，而JEV－NJ1株在這一區(qū)段非常保守。有學者在對乙腦減毒機理進行研究時認為E138位的Glu替換為Lys后毒力會有較明顯降低［9］。本次研究發(fā)現(xiàn)JEV－NJ1株與疫苗株SA14－14－2的E138位氨基酸均為Lys，而JEV－CZ1株則為Glu。有學者研究證明針對結(jié)構(gòu)域Ⅲ的抗體在對JEV中和反應(yīng)中起著重要作用，尤其是在E337－345、E377－382、E397－403 3個區(qū)域內(nèi)發(fā)生變異會導致抗原性的改變，甚至影響抗原與中和抗體的結(jié)合反應(yīng)［10］，本次研究通過序列分析，發(fā)現(xiàn)新分離的兩株JEV與疫苗株在這3個區(qū)域上完全一致。

表3 E蛋白活性區(qū)不同結(jié)構(gòu)域的氨基酸差異Tab．3 Amino acid substitutions in different domains of E protein

1992年 WR Chen等［11］首先依據(jù)乙腦病毒PrM／C基因區(qū)段（456～695）的核酸序列將乙腦病毒劃分為4個基因型。英國Solomon等研究認為乙腦病毒可能起源于印尼－馬來群島，該地區(qū)包括乙腦病毒所有基因型［12］，乙腦病毒在向其他地區(qū)傳播過程中受多因素協(xié)同作用，有較強的地域性。我國自1949年在北京首次分離到乙腦病毒，此后在其它中國地區(qū)也相繼分離到毒株，累計已有60余年歷史，Wang［13］等對中國自1949－2005年以來分離的乙腦毒株的研究顯示中國分離的乙腦病毒以基因Ⅲ型為主，偶有基因Ⅰ型。2001年在上海我國首次分離得到基因Ⅰ型乙腦病毒，隨后在遼寧、廣西、甘肅、河南和四川等省份也分離得到了基因Ⅰ型乙腦病毒［14－15］。本次研究為了避免用較短的核苷酸序列進行分析可能導致的結(jié)果不準確，而采用E基因（1 500bp）進行分型，結(jié)果顯示2009年從四川崇州市與內(nèi)江市的豬場蚊子與流產(chǎn)死胎腦組織中分離到的JEV－CZ1株和JEV－NJ1株分別屬于基因Ⅰ型和基因Ⅲ型。研究還發(fā)現(xiàn)JEV－CZ1株與2004年分離自 四 川 的 毒 株 SC04－16、SC04－12 和 越 南 分 離 株VN22遺傳關(guān)系較近，JEV－NJ1株與疫苗株SA14－14－2以及以往四川與上海分離的毒株遺傳關(guān)系較近，基本符合乙腦病毒具有較強地域性的特征。本次研究結(jié)果對深入研究四川乙腦病毒的分子生物學特征、DNA疫苗的研制以及建立乙型腦炎基因數(shù)據(jù)庫具有重要意義。

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