王國富，高 峰，吳利先

幽門螺桿菌重組Bb－h(huán)paA－vacA疫苗的構(gòu)建＊

王國富，高 峰，吳利先

目的構(gòu)建幽門螺桿菌（Hp）重組雙歧桿菌（Bb）Bb－h(huán)pa A－vac A疫苗。方法通過PCR分別擴增hpa A和vac A抗原編碼基因，然后采用基因拼接法（gene SOEing）剪接hpa A和vac A，得到hpa A－vac A融合基因；將該融合基因定向克隆到大腸埃希菌－雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX－1λT，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX－h(huán)paA－vac A，電穿孔法將該質(zhì)粒導入Bb，構(gòu)建幽門螺桿菌重組hpa A－vac A疫苗，然后用SDS－PAGE和Western blotting鑒定表達的重組蛋白。結(jié)果PCR成功擴增出分子量約為1 500 bp的hpaA－vac A融合基因，雙酶切證實hpa A－vac A融合基因成功插入pGEX－1λT中，并成功轉(zhuǎn)化入雙歧桿菌，而且重組蛋白能在雙岐桿菌中得到正確表達，Western blotting顯示重組蛋白具有免疫原性。結(jié)論成功構(gòu)建螺桿菌rBbhpa A－vac A疫苗，為該疫苗的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

幽門螺桿菌；雙歧桿菌；重組hpaA－vac A疫苗；構(gòu)建

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）能夠引起慢性、活動性胃炎和消化性潰瘍，同時它也是胃腫瘤的危險因素，并已被世界衛(wèi)生組織列為胃癌等腫瘤發(fā)生的相關(guān)致病菌［1－2］。Hp在我國普通人群的感染率約為50%～80%，并仍以每年1%～2%速度增加［3］。如何根治Hp的感染一直是微生物學和消化疾病領(lǐng)域研究的熱點。Hp在胃內(nèi)定植的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是粘附，是感染的先決條件和致病的關(guān)鍵。Hp粘附素基因hpa A（Helicobacter pylori adhesin A，hpa A）較保守，為Hp所特有，其編碼蛋白Hpa A具有粘膜結(jié)合特性，并有良好的抗原性和免疫原性［4］?？张荻舅兀╒acuolating cytotoxin A，Vac A）可誘導胃上皮細胞發(fā)生凋亡，凋亡在Hp致病過程中起著重要作用。而且Vac A在菌株中的表達率與臨床發(fā)病率非常相符［5］，因此Vac A預防措施顯得尤為重要。

雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum，Bb）是一種常見的益生菌，近年來除對雙歧菌的益生功能進一步深入研究外，利用該菌作為基因工程受體菌的研究也越來越受重視。與大腸桿菌等宿主相比，雙岐桿菌等益生菌作為基因工程受體菌具有特殊的意義，其除能發(fā)揮原有的益生功能外，還能發(fā)揮佐劑功能。因此構(gòu)建重組Bb－vac A－h(huán)pa A融合基因疫苗具有相當可觀的前景。

1 材料與方法

1．1 菌種與質(zhì)粒 兩歧雙歧桿菌Bb購自武漢大學菌種保存中心，大腸桿菌－雙歧桿菌穿梭表達載體p GEX－1λT由李文桂教授惠贈，質(zhì)粒p QE－h(huán)pa A［6］、p QE－vac A［7］、大腸桿菌BL21由本室保存。

1．2 主要試劑 PCR試劑、高效感受態(tài)細胞制備試劑盒（SK9305）購自上海生物工程公司。內(nèi)切酶、純化試劑盒和DNA連接試劑盒購自大連寶生物工程公司。NC膜及HRP標記羊抗兔IgG購自北京晨綠生物技術(shù)公司。幽門螺桿菌兔抗vac A免疫血清和兔抗hpa A免疫血清由本室制備并保存。

1．3 hpaA－vac A融合基因的擴增 參照 Gene Bank中的hpa A和vac A基因序列設(shè)計引物，vac A的上游引物 P1：5′－GCGGATCCATGCATTATTGGGTCAAAG－3′，下游引物P2：5＇－ATGGTACCTTACTATCTTGTTT－3′；hpa A 上 游 引 物 P3：5′－CGGGTACCATGAGAGC AAATAAT－3′，下游引物 P4：5′－CGGTCGACTTCTTATGCGTTATTTG －3′；分別以p QE－vac A和p QE－h(huán)pa A 為模板擴增vac A和hpaA基因。再設(shè)計引物P5和P6，引入vac A Lingker和hpa A Lingker（IL－3的12個氨基酸的接頭）。分別以PCR擴增出的vac A和hpaA基因為模板，P1、P5和P4、P6為引物分別擴增出帶Lingker的vac A和hpa A基因。最后再以帶Lingker的vac A和hpa A基因的PCR混合物為模板，以P1和P4為引物擴增出hpa A－vac A融合基因（在hpa A與vac A的融合基因之間有IL－3的12個氨基酸的36個堿基接頭CAGGAGCAGGACGGGCAGGCGGCTCATGTTTGGATC進行連接）。1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1．4 重組質(zhì)粒p GEX－h(huán)pa A－vac A的構(gòu)建和鑒定

質(zhì)粒p GEX－1λT和hpa A－vac A融合基因的PCR產(chǎn)物分別用BHam HI和Eco RI進行雙酶切后純化，將各自純化后的產(chǎn)物用T4連接試劑盒16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細胞。LA培養(yǎng)基篩選后，挑取陽性克隆進行培養(yǎng)，質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提重組質(zhì)粒進行PCR和限制性酶切鑒定。鑒定正確后送上海生物工程公司進行測序。

1．5 幽門螺桿菌重組Bb－vac A－h(huán)pa A疫苗的構(gòu)建和鑒定

1．5．1 Bb電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備［8］取生長良好的Bb 1 m L加至100 m L含0．5 mol／L蔗糖的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24～72 h，冰浴2．5 h，期間搖晃懸浮菌體。4℃5 000 r／min離心10 min，棄上清，依次用預冷的10%甘油50 m L、25 m L、10 m L 4℃離心進行洗滌，最后棄上清，加入預冷的10%甘油1．5 m L，充分懸浮菌體，取50μL準備電擊轉(zhuǎn)化，剩余感受態(tài)細胞－70℃保存。

1．5．2 重組質(zhì)粒p GEX－h(huán)paA－vac A的電轉(zhuǎn)化 取50μL Bb感受態(tài)細菌加至含20μL重組質(zhì)粒p GEX－h(huán)pa A－vac A的Ep管，混勻，冰浴1 min后轉(zhuǎn)移至電穿孔杯中進行電轉(zhuǎn)化。參數(shù)設(shè)置為：電壓為1．5 k V、轉(zhuǎn)化時間為5 ms、轉(zhuǎn)化次數(shù)為3次，轉(zhuǎn)化完畢后立刻加入1 m L含0．5 mol／L蔗糖的MRS液體培養(yǎng)基，輕輕移入10 m L培養(yǎng)管中，37℃100 r／min厭氧培養(yǎng)2 h。將培養(yǎng)管中細菌培養(yǎng)液吸至1．5 m L Ep管，3 000 r／min離心5 min，棄大部分上清，將剩余的100μL培養(yǎng)液懸浮，涂于含50μg／m L氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，待吸收后置37℃倒置厭氧培養(yǎng)24～72 h。

1．5．3 重組Bb疫苗的鑒定 挑取上述篩選培養(yǎng)基上單個菌落至100 m L含0．5 mol／L 蔗糖的MRS液體培養(yǎng)基中，加入10μg／μL氨芐青霉素500μL，37℃厭氧培養(yǎng)24～72 h，提取質(zhì)粒后，PCR擴增hpa A－vac A融合基因及對重組質(zhì)粒限制性酶切分析鑒定。

1．5．4 p GEX－h(huán)pa A－vac A 在雙歧桿菌中的表達及Western blot分析 挑取陽性轉(zhuǎn)化菌單菌落接種于100 m L MRS液體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)48h后收獲菌體，菌體破壁后進行SDS－PAGE電泳分析表達產(chǎn)物。觀察表達條帶并用Western blot分析鑒定重組蛋白。具體為將上述SDS－PAGE電泳的凝膠移至硝酸纖維膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2h，PBST震洗3次，分別加入一抗兔抗Vca A血清和兔抗Hpa A抗血清作用2 h，震洗3次，再加入二抗羊抗兔IgG作用2h，震洗后顯色。步驟同大腸桿菌。

2 結(jié) 果

2．1 hpa A和vac A抗原編碼基因以及hpa A－vac A融合基因的擴增 以p QE－vac A和p QE－h(huán)pa A為模板，分別以P1、P2和P3、P4為引物擴增vac A（723 bp）和hpa A（783 bp）基因，均在750 bp附近出現(xiàn)了明顯條帶，大小與預計相符，見圖1。通過基因拼接，并以P1和P4為引物擴增出中間帶有Lingker的hpaA－vac A融合基因，在1 500 bp左右出現(xiàn)了條帶，結(jié)果也與預計相符，見圖2。

2．2 重組質(zhì)粒pGEX－h(huán)pa A－vac A的鑒定和融合基因的測序 將轉(zhuǎn)化后在LA平板上生長的BL21陽性克隆接種于液體培養(yǎng)基過夜后，提取質(zhì)粒進行限制性酶切和PCR鑒定，均得到了與預計相符的條帶，見圖3。鑒定正確后的陽性克隆測序結(jié)果與GeneBank中序列相符。說明重組質(zhì)粒p GEX－vac A－h(huán)pa A構(gòu)建成功。

2．3 rBb－vac A－h(huán)pa A疫苗的鑒定 通過電轉(zhuǎn)化Bb后，以從具有AMP抗性的r Bb中提取質(zhì)粒進行限制性酶切和PCR鑒定。結(jié)果與上述圖3一致，PCR擴增出了1 500 bp大小的條帶，限制性酶切后得到了與PCR大小相符的片段，說明r Bb－vac A－h(huán)pa A疫苗構(gòu)建成功。

2．4 pGEX－h(huán)pa A－vac A 在雙歧桿菌中的表達和Western blotting分析 重組質(zhì)粒在雙岐桿菌能得到正確表達，但產(chǎn)量不高，約占細菌總蛋白的8．5%見圖4。經(jīng) Western blotting分析，能分別與兔抗Vca A血清和兔抗HpaA抗血清作用而免疫著色見圖5，說明重組融合蛋白兼具有兩種單獨蛋白的免疫活性。

3 討 論

Hp與多種胃腸道炎癥相關(guān)，而且在我國感染率非常高。隨著對Hp致病機理及其基因組結(jié)構(gòu)與功能認識的逐步深入，免疫療法被認為是防治Hp感染最有效最有前景的方法之一。由于雙價Hp基因工程疫苗免疫保護效果優(yōu)于單價疫苗，因此研究多價疫苗及其抗原組合將是Hp疫苗研制的主要方向。

圖5 重組蛋白Vac A－HpaA的Western blotting鑒定1，4：蛋白分子量標準；2，5：陰性對照；3：所表達蛋白與兔抗Vac A血清反應的結(jié)果；6：所表達蛋白與兔抗Hpa A血清反應的結(jié)果Fig．5 Recombinant protein VacA－HpaA identified by Western blot 1，4：Protein marker；2，5：Control；3：Recombinant protein responsed with the anti－Vac A serum；6：Recombinant protein responsed with the anti－Hpa A serum

病原體的特異性粘附由粘附素－受體系統(tǒng)介導，依賴于粘附分子上某些特定的氨基酸位點與受體的結(jié)合。有研究證實，Hp粘附素基因hpa A（Helicobacter pylori adhesin A，hpa A）較保守，為Hp所特有，其編碼蛋白Hpa A具有粘膜結(jié)合特性，并有良好的抗原性和免疫原性［4］。Elisabet等［9］通過構(gòu)建了Hp的hpa A基因敲除突變株，進一步在小鼠感染模型中證實了Hpa A在Hp定植中的必要性。

1988年，Leunk發(fā)現(xiàn)了Hp能使真核細胞空泡變性的毒素，并命名為空泡毒素（Vacuolating cytotoxin A，Vac A）。國內(nèi)外大量研究證明，Vac A加入多種哺乳動物細胞培養(yǎng)基中，數(shù)小時后能夠引起細胞空泡樣變，3～4d后，細胞變性與死亡。已有研究顯示天然的Vac A和重組Vac A均可誘導胃上皮細胞發(fā)生凋亡，凋亡在 Hp致病過程中起著重要作用［5］。此外，相較于Hp其他的毒力因子，Vac A在菌株中的表達率與臨床發(fā)病率非常相符，因此Vac A預防措施顯得尤為重要。其中編碼蛋白質(zhì)37k D亞單位的基因片段又相對保守，這就為針對Vac A疫苗的研制提供了有力條件。

雙歧桿菌是人和哺乳動物回腸末端及大腸內(nèi)最主要的生理性菌群，是一種益生菌。重組雙歧桿菌疫苗具有下述優(yōu)點：所表達的靶基因不需純化，可直接用于免疫接種，免去了蛋白質(zhì)后處理的復雜工序；單次接種即可誘導機體產(chǎn)生針對靶抗原的免疫反應，而且具有粘膜佐劑的作用；運用分子生物學手段，通過對不同靶抗原的剪切和拼接，可使新型疫苗理想化；雙歧桿菌本身作為一種益生菌，對胃粘膜有保護作用，還可提高宿主的免疫力；它價格低廉，適于大量生產(chǎn)，更容易被接受和認可。因此構(gòu)建vac A－h(huán)pa A融合基因疫苗，用雙歧桿菌作為載體口服導入機體表達目的基因，誘導機體產(chǎn)生相應抗體，既可阻止Hp的粘附，又可刺激機體產(chǎn)生抗體發(fā)揮全身免疫應答。

為了將外源性DNA有效引入雙歧桿菌，需要構(gòu)建大腸桿菌－雙歧桿菌穿梭表達載體。本研究所采用的大腸桿菌－雙歧桿菌穿梭表達載體p GEX－1λT含有雙歧桿菌復制起點、大腸桿菌復制起點、一個多克隆位點和一個氨芐青霉素抗性基因。上游有一個啟動子Ptac（trp操縱子啟動子與lac操縱子啟動子的融合啟動子），在IPTG誘導下表達。這種穿梭載體可允許外源性DNA在大腸桿菌中操作，鑒定正確后再轉(zhuǎn)化入雙歧桿菌，通過自動復制或同源整合與基因組進行基因交換，從而在雙歧桿菌中穩(wěn)定表達外源性基因［8］。本研究構(gòu)建大腸桿菌重組質(zhì)粒p GEX－h(huán)pa A－vac A在雙歧桿菌中也得到了正確表達，但表達量只有全菌蛋白的8．5%。雖然表達量低，但也表明了雙岐桿菌是能夠同時發(fā)揮其益生菌和表達外源基因的雙重作用的。今后研究的重點是對雙歧桿菌分子生物學的深入探討，提高載體的表達能力。

［1］Hocking D，Webb E，Redcliff F，et al．Isolation of recombinant protective Helicobacter pylori antigen［J］．Infect Immun，1999，67（9）：4713－4719．

［2］M?ller H，Heseltine E，Vainio H．Working group report on schistosomes，liver flukes and Helicobacter pylori［J］．Int J Cancer，1995，60（5）：587－589．

［3］Pounder RE，Ng D．The prevalence of Helicobacter pylori infection in different countries［J］．Aliment Pharmacol Ther，1995，9（Suppl2）：33－39．

［4］Evans DG，Evans DJ Jr，Lampert HC，et al．Restriction fragment length polymorphism in the adhesin gene hpa A of Helicobacter pylori［J］．Am J Gastroenterol，1995，90（8）：1282－1288．

［5］Dirk K，Bernhard K，Chrisitf L K，et al．Vacuo1ating Cytotoxin of Helicobacter pylori Induced Apoptosis in the Human Gastric Epithelial cell line AGS［J］．Infect Immun，2001，69（8）：5080－5087．

［6］吳利先，楊致邦，林珊珊，等．幽門螺桿菌臨床株粘附素HpaA基因的克隆表達及在診斷中的價值［J］．中國人獸共患病雜志，2004，20（4）：275－278．

［7］劉淼，楊致邦，林珊珊，等．幽門螺桿菌細胞空泡毒素基因毒性片段的克隆與表達［J］．重慶醫(yī)科大學學報，2003，28（6）：720－723．

［8］楊梅，李文桂，朱佑明．多房棘球絳蟲重組Bb－EmⅡ／3－Em14－3－3疫苗的構(gòu)建及鑒定［J］．中國人獸共患病學報，2007，23（10）：1026－1028．

［9］Carlsohn E，Nystr?m J，B?lin I，et al．HpaA Is Essential for Helicobacter pylori Colonization in Mice［J］．Infect Immun，2006，74（2）：920－926．

Construction of recombinant Bb－h(huán)paA－vacA vaccine of Helicobacter pylori

WANG Guo－fu，GAO Feng，WU Li－xian
（Department Microbiology，Basic Medical School，Dali College，Dali 671000，China）

To construct the recombinant Bb－h(huán)pa A－vac A vaccine of Helicobacter pylori，hpa A and vac A antigen genes were amplified by PCR and the fusion gene hpa A－vac A was obtained with gene SOEing．Then the fusion gene was cloned into Escherichia coli－Bifidobacteria shuttle plasmid p GEX－1λT to construct p GEX－h(huán)pa A－vac A．The recombinant plasmid was electroporated into Bifidobacteria bifidum （Bb）to construct rBb hpa A－vac A vaccine．The recombinant protein was analyzed by SDS－PAGE．Its immunogenicity was identified by Western blotting．A 1500bp fusion gene of hpa A－vac A was successfully amplified by PCR and cloned into pGEX－1λT by restriction analysis，and the rBb hpa A－vac A vaccine was successfully constructed by PCR and restriction analysis．The recombinant protein could be expressed in B．bifidium and it has immunogenicity．In this way，the r Bb hpa A－vac A vaccine of Helicobacter pylori is successfully constructed，which lays the experimental foundation of exploitation and utilization of this vaccine．

Helicobacter pylori；Bifidobacterium bifidum；recombinant hpa A－vac A vaccine；construction

R378

A

1002－2694（2012）02－0131－04

＊云南省自然科學基金（2007C147 M）資助

吳利先，Email：w＿lixian＠163．com；

云南省大理學院基礎(chǔ)醫(yī)學院微生物學教研室，大理671000

2011－06－02；

2011－09－15