李意堅(jiān)，閆淑珍，蔣利春，朱 慧，孫 莉，韓雪梅，黃科力，徐 堅(jiān)，陸云明，陸宏偉，洪根泉

(1.張家港市農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，江蘇張家港215616;2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210046;3.蘇州市吳中區(qū)農(nóng)林局，江蘇蘇州215128;4.江蘇華昌化工股份有限公司，江蘇張家港215634;5.蘇州市甪直鎮(zhèn)農(nóng)林服務(wù)中心，江蘇蘇州215127)

傳統(tǒng)保護(hù)地作物栽培中由于連作普遍存在，而連作使根系代謝產(chǎn)物不斷積累，為真菌類病害提供了生長繁殖環(huán)境，使保護(hù)地農(nóng)田中土傳病害日益加劇。在保護(hù)地蔬菜栽培中土傳病害的病原主要為鐮刀菌(Fusarium)、疫霉菌(Phytophora)、腐霉菌(Pythium)和假單胞桿菌(Pseuodomonos)以及線蟲(Nematodes)等，蔬菜被侵染致病表現(xiàn)的癥狀一般為疫病型、枯萎型和黃萎型，表現(xiàn)為植株凋萎或萎蔫，根和莖維管束阻塞、變褐［1］。其中鐮刀菌引起的枯萎病和疫霉菌引起疫霉病就是保護(hù)地栽培的西瓜、甜瓜和辣椒等最常見的兩種病害。在西瓜的保護(hù)地栽培中為避免連作病害發(fā)生，近年西瓜種植戶開始年年易地重建大棚，土地?fù)p毀嚴(yán)重，人、財(cái)、物成本增加。為解決這一生產(chǎn)實(shí)際問題，為設(shè)施栽培的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐，江蘇省張家港農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站與南京師范大學(xué)合作研究，從常年種植蔬菜和西瓜的保護(hù)地土壤中篩選和分離了大量的對枯萎病菌、疫霉病菌具有顯著抑制效果的放線菌和植物內(nèi)生細(xì)菌，研究了菌種的提純和擴(kuò)繁及復(fù)合制劑的制備方法，并在張家港市塘橋鎮(zhèn)西瓜主產(chǎn)區(qū)連作大棚、錦豐鎮(zhèn)南岡村千畝設(shè)施栽培蔬菜基地的辣椒連作地塊、蘇州甪直鎮(zhèn)光輝蔬菜基地的甜瓜連作地進(jìn)行了田間試驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

1.1.1 生防菌種 R－1、ME2、XG32和 DP24均為南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。R－1為涇陽鏈霉菌(Streptomyces jingyangensis)，具有分泌植物生長素和拮抗黃瓜枯萎病菌的功能［2］;ME2為小單孢菌(Micromonospora sp.)具有拮抗黃瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的功能［3］;DP24為芽孢桿菌(Bacillus sp.)是植物內(nèi)生細(xì)菌，具有促進(jìn)生長和抑制辣椒疫霉的功能［4］。

1.1.2 病原菌 黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 菌劑的制備方法

1.2.1 放線菌(R－1和ME2)的斜面菌種挖菌塊接種到米飯培養(yǎng)基(將浸1 h的粳米隔水蒸至半熟，晾涼后加入干米重的10%的黃豆粉，拌勻，用1 mol/L的NaOH調(diào)pH值至7.0，裝瓶，多層紗布和報(bào)紙封瓶，121 ℃滅菌40 min)［5］中，31 ℃培養(yǎng)5 ～7 d為擴(kuò)繁菌種。擴(kuò)繁菌種在無菌條件下，用混合方法接種到滅菌的固體發(fā)酵料(細(xì)土、黃豆粉、米糠、過磷酸鈣按體積比77∶10∶10∶3比例混勻過100目篩裝瓶，用紗布和報(bào)紙多層封瓶于121℃滅菌30 min在把滅菌的料倒入方盤中并用多層報(bào)紙覆蓋)中，31℃發(fā)酵培養(yǎng)7～10 d，在發(fā)酵過程中定期攪拌，注意確保不污染雜菌，不同的放線菌株分別發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后菌料倒入方盤中，置40℃干燥箱干燥至恒重，包裝為放線菌單菌劑。

1.2.2 細(xì)菌(DP24)斜面菌種接種到一瓶牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中31℃搖瓶發(fā)酵48 h為種子液，再接種到1L以上大的發(fā)酵瓶中發(fā)酵，發(fā)酵條件為:31℃，48 h。發(fā)酵液按照1∶2的比例倒入草炭中，攪拌均勻后置40℃干燥箱干燥至恒重，包裝，為細(xì)菌單菌劑。

1.2.3 把1.2.1中發(fā)酵的不同的放線菌株發(fā)酵后。未烘干前按1∶1混合后倒入無菌方盤中，再與1.2.2中發(fā)酵的細(xì)菌液體發(fā)酵液按體積比1∶1混拌均勻，置干燥箱干燥，干燥條件為40℃，24 h，再調(diào)高溫度到60℃，發(fā)酵物前期濕潤時(shí)可以鼓風(fēng)，后期干燥時(shí)定期攪拌但不要鼓風(fēng)，發(fā)酵物干燥到恒重為混合菌劑。

1.3 菌劑中含有活體菌數(shù)量的測定

測定方法采用平板菌落計(jì)數(shù)法［6］。測定細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基;測定放線菌采用高氏一號固體培養(yǎng)基?；旌暇鷦┲袃芍攴啪€菌在高氏一號固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)區(qū)分:R－1為淺粉色的菌落;ME2為黃色的菌落，分別計(jì)數(shù)。

1.4 菌劑抑菌活性測定

烘干的混合菌劑稱取5 g，加入50%乙醇15 mL，充分浸泡12 h以上，取上清用0.22 μm的細(xì)菌濾膜過濾，濾液在無菌條件下滴加到PDA平板上的牛津小杯中。PDA平板在放置牛津小杯前已涂抹過黃瓜枯萎病菌和辣椒疫霉的孢子懸液。28℃恒溫箱培養(yǎng)3～5 d，觀察抑菌圈大小。

1.5 菌劑對人工接種辣椒疫霉病和黃瓜枯萎病菌的防治實(shí)驗(yàn)

辣椒種子和黃瓜種子在2%次氯酸鈉溶液浸泡15 min。洗凈后播種于經(jīng)高溫消毒的育苗土中。溫室內(nèi)培育。辣椒苗3～5葉期用傷根法接種辣椒疫霉孢子懸液，接種方法和調(diào)查方法參照文獻(xiàn)［7］;黃瓜小苗真葉展開時(shí)接種黃瓜枯萎病菌，接種方法和調(diào)查方法參照文獻(xiàn)［8］。每盆4株苗，每處理6盆，3次重復(fù)，分別設(shè)清水澆苗后接種病原菌和不接種病原菌的空白為對照。

1.6 混合菌劑的田間實(shí)驗(yàn)

1.6.1 保護(hù)地西瓜和甜瓜實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。西瓜和甜瓜栽培大棚內(nèi)劃出6個(gè)試驗(yàn)區(qū)，其中處理區(qū)3個(gè)，對照區(qū)3個(gè)。處理區(qū)和對照區(qū)間隔排列。小區(qū)面積為12.2 m2，共10棵西瓜，每棵西瓜疏花疏果結(jié)1個(gè)瓜;甜瓜小區(qū)面積是14.84㎡，每個(gè)小區(qū)15株苗。處理區(qū)除按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法接種混合菌劑外，栽培措施與對照區(qū)相同，常規(guī)田間管理。處理區(qū)實(shí)驗(yàn)方法是在西瓜和甜瓜苗移栽時(shí)，按用量20 kg/畝(1畝約為667 m2，下同)將菌劑先與細(xì)土或有機(jī)肥混勻后，根據(jù)移栽密度折算出每棵西瓜和甜瓜苗所用量，用量具如一次性水杯等量取并施入每棵苗穴，栽入西瓜苗，灌透水，在西瓜和甜瓜開花前追施一次，用量為10 kg/畝，距苗根部2～5 cm處挖小坑把菌劑施入后蓋上2～3 cm的浮土。西瓜和甜瓜采收前調(diào)查枯萎病發(fā)病率，采收時(shí)測量西瓜和甜瓜每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理區(qū)的單個(gè)西瓜產(chǎn)量和甜瓜的總產(chǎn)量，用甜度計(jì)測量每個(gè)西瓜和甜瓜的甜度。

1.6.2 保護(hù)地辣椒的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)方法同1.6.1，小區(qū)面積為8 m2。調(diào)查方法是在辣椒盛果期調(diào)查辣椒疫霉病的發(fā)病率。多次采收，多次測產(chǎn)，直到采收結(jié)束，同一處理區(qū)的產(chǎn)量合并計(jì)算。

圖1 兩株放線菌單菌劑和混合菌劑的50%乙醇浸提液抑制黃瓜枯萎病菌的效果

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 菌劑的菌體數(shù)量和抑菌活性測定結(jié)果

每個(gè)單菌劑和混合菌劑在制備完成后，均抽樣檢測菌劑中的菌體數(shù)量和抑菌活性。單菌劑中菌體數(shù)量達(dá)到108以上，并且50%乙醇浸提液存在抑菌活性，這些單菌劑為合格樣品?；旌暇鷦┲忻總€(gè)單菌株菌體數(shù)量達(dá)到105以上，且50%乙醇浸提液存在抑菌活性，這些混合菌劑為合格樣品。不同批次的菌劑樣品檢驗(yàn)合格后均勻混合后再使用。由圖1可見:用菌劑的50%乙醇浸提液0.2 mL滴加到牛津小杯中，抑菌圈直徑達(dá)1.70～1.73 cm，表明功能菌株ME2和R－1制備的固體菌劑和混合菌劑抑制黃瓜枯萎病菌效果顯著。

2.2 菌劑對苗期人工接種辣椒疫霉的防治試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，單菌劑和混合菌劑對辣椒苗期人工接種辣椒疫霉病菌的病情指數(shù)和發(fā)病率明顯降低，防效均達(dá)到了50%以上，其中混合菌劑防效達(dá)到81.91%。

表1 菌劑對人工接種辣椒疫霉的防治效果

2.3 菌劑對苗期人工接種黃瓜枯萎病菌的防治試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，單菌劑和混合菌劑對黃瓜苗期人工接種黃瓜枯萎病菌的病情指數(shù)和發(fā)病率明顯降低，防效均達(dá)到了60%以上，其中R－1單菌劑和混合菌劑防效達(dá)到80%以上。

表2 菌劑對人工接種黃瓜枯萎病菌的防治效果

2.4 混合菌劑在保護(hù)地西瓜的試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)地點(diǎn)在張家港市塘橋鎮(zhèn)鹿苑花園村18組農(nóng)戶西瓜連作地，供試西瓜品種為8424。由表3試驗(yàn)結(jié)果可見，田間施用混合菌劑處理的西瓜產(chǎn)量在32 006.7 ～33 054.3 kg/hm2之間，較常規(guī)對照田西瓜產(chǎn)量平均增加3027.5 kg/hm2，增幅為10.2%。處理差異達(dá)到極顯著。增產(chǎn)因素為單果直徑增加4.41 cm，單果重增10.16%，并均達(dá)到差異極顯著水平。

表3 田間施用混合菌劑對西瓜產(chǎn)量的影響

處理田塊的西瓜心糖糖度為10.9，邊糖糖度為10.1，分別比未處理的西瓜糖度高出 0.8%、0.7%，但差異并不顯著(見表4)?？梢娪没旌暇鷦┙臃N西瓜田，對西瓜產(chǎn)量與單果重及單果直徑有極顯著的增產(chǎn)、增重、增大的作用，對西瓜糖度的作用不顯著。

表4 田間施用混合菌劑對西瓜甜度的影響

混合菌劑對西瓜枯萎病的防治效果見表5。接種混合菌劑的田塊，西瓜枯萎病的發(fā)病率為15%，沒有接種的常規(guī)對照田塊的發(fā)病率為65%，施用混合菌劑對西瓜枯萎病的防治率為77%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 混合菌對西瓜枯萎病防治效果

2.5 混合菌劑在保護(hù)地甜瓜的試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)地點(diǎn)在蘇州甪直鎮(zhèn)澄湖良種基地的甜瓜連作地，供試甜瓜品種為日本甜寶。由表6的試驗(yàn)結(jié)果可見，使用混合菌劑處理的甜瓜產(chǎn)量平均為31 497.3 ～31 925.4 kg/hm2，比未用混合菌劑的常規(guī)對照田增產(chǎn)1729.8 kg/hm2，增幅為5.8%，達(dá)差異顯著水平。產(chǎn)量構(gòu)成因子之一的單果重，處理比對照增加了6.8%，但并未達(dá)到差異顯著水平?；旌暇鷦μ鸸蠁喂鲋睾吞嵌鹊挠绊懖⒉伙@著。

表6 田間施用混合菌劑對保護(hù)地甜瓜產(chǎn)量和甜度的影響

2.6 混合菌劑在保護(hù)地辣椒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)地點(diǎn)在張家港市錦豐鎮(zhèn)南港蔬菜基地連作的辣椒地，辣椒品種為豐椒一號。由表7的試驗(yàn)結(jié)果可見，用混合菌劑處理的辣椒產(chǎn)量在50 771.6～51 496.2 kg/hm2，比未用混合菌劑的常規(guī)對照田增產(chǎn)2 716.2 kg/hm2，增幅5.6%，但差異不顯著。處理單果重平均77.73g，比對照增3.13%，處理間差異顯著。表明混合菌劑對提高辣椒的單果重量有顯著作用，對提高產(chǎn)量雖有一定的作用，但效果并不明顯。

表7 田間施用混合菌劑對辣椒產(chǎn)量的影響

混合菌劑對辣椒疫霉病的防治效果見表8。使用混合菌劑處理的辣椒田塊發(fā)病率為25%，對照田發(fā)病率為100%，混合菌劑對辣椒疫霉病的防治率為75%。

表8 田間施用混合菌劑對辣椒疫霉病的防治效果

3 結(jié)論與討論

已有的研究表明，在植物的根圍土壤中存在很多對植物病原菌具有抑制作用的微生物，通?？衫酶偁?、抗生、寄生和交叉保護(hù)等直接的拮抗機(jī)制抑制植物病害［9］，土壤放線菌的一些種還可以產(chǎn)生抗生素、酶及酶抑制劑，并與土壤中其他微生物形成穩(wěn)定的微生物群落，對蔬菜根際及表層土壤阻擋其他病原微生物入侵起到了一定的屏障作用［10］。植物根分泌物為微生物提供重要的營養(yǎng)和能量物質(zhì)，其成分和含量影響著根際微生物的種類和數(shù)量;根際微生物的代謝作用，反過來可以增加土壤中的氮和某些植物生長素抗生素的含量，或促進(jìn)土壤中一些有效性低的營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，或者兼有刺激植物的生育進(jìn)程及防治病蟲害的作用［11］。放線菌作為豐富的微生物資源，在作物枯、黃萎病防治中具有廣闊的應(yīng)用前景［12］。但是單種生防菌存在諸如菌株作用譜窄、持效性差、環(huán)境依賴性強(qiáng)等弊端，不能達(dá)到理想的促生防病效果［13］。因此利用生防菌組合防治作物病害成為國內(nèi)外研究的新熱點(diǎn)［14，15］。此外，采用具有不同拮抗作用特點(diǎn)的多個(gè)拮抗菌菌株組合的方法防治植物病害被認(rèn)為是一種更為實(shí)際、更有效的生物防治策略［16－18］。隨著人們對環(huán)保和健康意識的逐漸加強(qiáng)，用有益微生物防治植物病害以及生物凈化環(huán)境已成為研究熱點(diǎn)［12，19］。但復(fù)合菌劑的作用機(jī)理不是簡單的累加，而是有一定的協(xié)同作用［20，21］。有些復(fù)合的生物菌劑確實(shí)達(dá)到提高生防效果的目的，但是，有些復(fù)合的生物菌劑并不增效，其中一個(gè)重要原因是使用的生防菌株之間不親和，相互間有拮抗作用，最終導(dǎo)致多個(gè)菌株復(fù)合的生物菌劑防效不佳。理想的生防菌組合應(yīng)克服不同拮抗微生物之間的排斥作用，并非混合的種類越多，效果就越優(yōu)，只有全面考慮各菌株的習(xí)性并進(jìn)行合適的組合，才能充分發(fā)揮其生防效果。利用拮抗微生物防治植物根部病害，就是將培養(yǎng)好的拮抗微生物以一定方式施入土壤中，或是通過在土壤中加入有機(jī)物等措施提高原有的拮抗微生物的活性，從而降低土壤中病原菌的密度，抑制病原菌的活動(dòng)，減輕病害的發(fā)生［22］。在綜合控制系統(tǒng)中，拮抗菌的加入有時(shí)是非常有效的［23］。

本實(shí)驗(yàn)是在研究了每個(gè)單菌劑的生防效果的前提下，再采取放線菌間組合的方法研究了放線菌組合菌的防效［2，3］。采用放線菌單獨(dú)固體發(fā)酵，再混合烘干。以及在固體發(fā)酵的放線菌發(fā)酵料中混拌細(xì)菌發(fā)酵液的方法保證了制備的混合菌劑的各個(gè)菌株的菌體數(shù)量，同時(shí)也保證了混合菌劑的抑菌活性的存在。

本實(shí)驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)混合菌劑在保護(hù)地一定的適宜環(huán)境下，能夠有效地克服因連作而產(chǎn)生的枯萎病、疫霉病等土傳病害;具有提高西瓜、甜瓜和辣椒的的產(chǎn)量、單果重和甜度品質(zhì)的作用。該混合菌劑在保護(hù)地內(nèi)的試驗(yàn)除了針對栽種的西瓜、甜瓜和辣椒進(jìn)行了試驗(yàn)外，還對西葫蘆、草莓和西紅柿等植物上進(jìn)行了試驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果另文發(fā)表)。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這些作物在一些地塊中除發(fā)生枯萎病和疫霉病外，還發(fā)生青枯病、病毒病和線蟲病害，特別是辣椒和西紅柿青枯病的發(fā)生田塊使用該生防菌劑是沒有任何防效的，也導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的無法統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)的栽培基地中各種植物病毒病的發(fā)生也是普遍和嚴(yán)重，同樣影響該試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。這些事實(shí)說明，生防菌劑的研究還應(yīng)不斷的深入，不斷的擴(kuò)大防治目標(biāo);還應(yīng)針對線蟲、青枯病菌以及植物病毒的有效控制菌株進(jìn)行篩選和研究，有效的解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際問題。

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