徐艷峰，孫麗華，潘菊華，盧耀增

(1.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京100021;2.中國中醫(yī)科學院，廣安門醫(yī)院，北京100053)

恒河猴艾滋病模型中樞神經(jīng)系統(tǒng)及淋巴結(jié)病變的電鏡觀察

徐艷峰1，孫麗華1，潘菊華2，盧耀增1

(1.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京100021;2.中國中醫(yī)科學院，廣安門醫(yī)院，北京100053)

目的觀察恒河猴艾滋病模型不同感染階段中樞神經(jīng)系統(tǒng)及淋巴結(jié)的超微結(jié)構(gòu)改變，探討艾滋病的發(fā)病機制和病理改變的發(fā)展過程。方法15只恒河猴，1只為正常對照，其余14只靜脈注射感染SIVmac239猴艾滋病病毒，分別于感染后1周，2周，1個月，2個月，12個月，18個月取腹股溝淋巴結(jié)及下丘腦組織進行透射電鏡檢查。結(jié)果感染后1周即可出現(xiàn)淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細胞病變，表現(xiàn)為線粒體腫脹，嵴溶解，出現(xiàn)自噬體等。感染后2周及1個月時淋巴細胞病變主要表現(xiàn)為線粒體腫脹，嵴溶解;感染2個月時淋巴細胞細胞核形態(tài)出現(xiàn)明顯改變。感染后12個月淋巴結(jié)內(nèi)多數(shù)淋巴細胞出現(xiàn)病變，細胞腫脹，細胞器正常形態(tài)大部分消失;部分細胞出現(xiàn)溶解性壞死的特征。至感染后期(18個月時)，淋巴結(jié)內(nèi)局部淋巴細胞稀疏，細胞核腫脹或形態(tài)不規(guī)則。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變在感染后1周出現(xiàn)，表現(xiàn)為神經(jīng)纖維腫脹，感染后2周出現(xiàn)神經(jīng)元的病變，表現(xiàn)為神經(jīng)元線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，尼氏體消失;神經(jīng)纖維內(nèi)出現(xiàn)空泡。感染后12個月及18個月時，神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的病變加重。結(jié)論在SIV感染早期，淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)即可出現(xiàn)病變，維持一段相對穩(wěn)定的時間后，至疾病后期，病變加重。中樞神經(jīng)系統(tǒng)與淋巴結(jié)的超微結(jié)構(gòu)病變發(fā)展規(guī)律有一定的相似性。

SIV;艾滋病動物模型;電鏡;恒河猴;中樞神經(jīng)系統(tǒng);淋巴結(jié)

在HIV感染的早期，HIV病毒即在淋巴結(jié)的CD4+T淋巴細胞內(nèi)復制，導致病毒血癥和CD4+T淋巴細胞減少，引起細胞免疫缺陷。隨著病情進展，淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)逐漸破壞，并出現(xiàn)其他一系列病變，包括神經(jīng)系統(tǒng)的病變。HIV感染的患者中，25%會發(fā)生HIV腦病。HIV感染也與多種神經(jīng)病相關(guān)，包括遠端感覺性神經(jīng)病、多發(fā)性單神經(jīng)炎、炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病以及進行性多發(fā)性神經(jīng)根病變［1，2］。HIV腦病及神經(jīng)病變的發(fā)病機制尚不明確。

SIVmac病毒能在恒河猴引發(fā)與人類AIDS類似免疫缺陷綜合癥，出現(xiàn)CD4淋巴細胞下降、機會性感染、病毒性腦炎，因此常以此病毒感染恒河猴作為研究人類AIDS的重要動物模型［3－6］。本文以SIVmac239靜脈感染恒河猴，在感染各時期采取動物下丘腦組織和淋巴結(jié)進行電鏡檢查，在亞細胞水平觀察SIV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和淋巴結(jié)引起的病變及其發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，并為艾滋病治療時機的選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

中國恒河猴，成年(7～11歲)，雌雄各半，共15只，體重4.76～8.76 kg。購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所(InstituteofBeijingXIEERXINBiology Resource)，SCXK(京)2005－0005。試驗前經(jīng)檢查無SIV、逆轉(zhuǎn)錄病毒D型(SRV)和猴T淋巴細胞病毒1型(STLV－1)抗體，飼養(yǎng)在生物安全環(huán)境下，用于實驗。實驗在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所ABSL－3實驗室內(nèi)進行(資格證號:衛(wèi)BSL3－006)。

1.2 病毒來源和標本采集

SIVmac239猴艾滋病病毒，美國Aaron Diamond艾滋病研究所P.A.Marx教授贈送，經(jīng)用中國恒河猴PBMC體外擴增的病毒液，滴度1×108TCID50/L，用1:50稀釋1mL(2000TCID50)靜脈注射上述14只中國恒河猴，1只留作正常對照。采集EDTA抗凝血，分離血漿，采用Real－time PCR TaqMan探針法測定病毒載量。各動物的病毒載量均在感染后10～14 d達到高峰(﹥106拷貝/mL)。感染動物分不同時間點安樂死，采取腹股溝淋巴結(jié)及下丘腦組織在北京大學第一醫(yī)院電鏡室用透射電鏡(型號:JEM－1230)檢查。采樣時間為:感染后1周，2周，1月，2月各2只動物，感染后12周4只動物，感染后18周2只動物。

2 結(jié)果

2.1 對照組淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細胞的超微結(jié)構(gòu)

對照組動物淋巴結(jié)內(nèi)可見小淋巴細胞及大淋巴細胞，小淋巴細胞呈較規(guī)則圓形，核漿比例大，異染色質(zhì)明顯，團塊狀，沿核膜內(nèi)側(cè)分布，可見少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體，結(jié)構(gòu)清晰，無異常改變。大淋巴細胞圓形或橢圓形，偶見微絨毛狀突起，核漿比例稍小，異染色質(zhì)少，呈小塊狀。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體多見，結(jié)構(gòu)清晰，無異常改變。

2.2 實驗組淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細胞的超微結(jié)構(gòu)改變

感染后1周大淋巴細胞出現(xiàn)線粒體自噬，少數(shù)線粒體腫脹，嵴溶解，核基質(zhì)灶性稀疏。感染后2周淋巴細胞線粒體腫脹，可見自噬體。感染后1個月淋巴細胞多數(shù)線粒體腫脹，嵴溶解，核膜雙層間隙加大;可見臨近死亡的淋巴細胞，表現(xiàn)為細胞核結(jié)構(gòu)消失，有多量溶酶體。感染后2個月淋巴細胞胞漿內(nèi)線粒體腫脹，高爾基體擴張，溶酶體增多;細胞核形態(tài)明顯不規(guī)則，可見染色質(zhì)周圍顆粒。感染后12個月淋巴結(jié)內(nèi)多數(shù)淋巴細胞出現(xiàn)病變。部分表現(xiàn)為淋巴細胞內(nèi)的細胞器溶解消失，胞漿基質(zhì)灶性空化;核腫脹變圓，染色質(zhì)稀疏，異染色質(zhì)幾近消失;部分細胞出現(xiàn)溶解性壞死;部分細胞內(nèi)的線粒體腫脹，嵴溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。感染18個月后，淋巴結(jié)內(nèi)局部淋巴細胞稀疏，細胞核腫脹或形態(tài)不規(guī)則(彩插1圖1)。

2.3 對照組下丘腦組織的超微結(jié)構(gòu)

對照組動物下丘腦組織神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)清晰，髓鞘完整，無增厚及裂隙。神經(jīng)元內(nèi)細胞器及細胞核無異常改變。

2.4 實驗組下丘腦組織的超微結(jié)構(gòu)改變

感染后1周下丘腦神經(jīng)纖維腫脹。感染后2周神經(jīng)元線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，尼氏體消失。下丘腦神經(jīng)纖維內(nèi)出現(xiàn)空泡。感染后1個月下丘腦神經(jīng)纖維髓鞘增粗，分層，神經(jīng)纖維腫脹。感染后2個月神經(jīng)髓鞘增粗，神經(jīng)纖維腫脹。感染后12個月神經(jīng)元細胞核腫脹變圓，基質(zhì)幾近消失，殘存細胞器明顯腫脹，線粒體腫脹發(fā)空，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，可見大量次級溶酶體。神經(jīng)膠質(zhì)細胞核核膜不完整;胞漿基質(zhì)高度疏松空亮，只有少數(shù)細胞器，線粒體高度腫脹空化，嵴溶解消失。神經(jīng)髓鞘不規(guī)則分裂，部分神經(jīng)纖維髓鞘脫失，神經(jīng)束疏松，可見空泡。感染后18個月下丘腦神經(jīng)元胞漿內(nèi)可見較多溶酶體，線粒體腫脹，嵴溶解，尼氏體消失。核膜不清晰，常染色質(zhì)減少，有少量異染色質(zhì);部分神經(jīng)髓鞘內(nèi)神經(jīng)纖維消失(彩插2圖2)。

3 討論

HIV感染的病人常在HIV感染后第1周出現(xiàn)淋巴細胞和血小板減少。淋巴結(jié)是HIV復制的重要部位，感染初期，在引流區(qū)淋巴結(jié)均能檢測到病毒DNA和RNA。經(jīng)過急性期后，患者進入長短不一的相對穩(wěn)定期。隨著免疫系統(tǒng)的衰竭，患者進入艾滋病期，出現(xiàn)繼發(fā)性感染和腫瘤等多系統(tǒng)病變［7］。本項研究中淋巴結(jié)病變的發(fā)展規(guī)律與HIV患者的病變過程類似。SIV感染恒河猴后1周即可出現(xiàn)淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細胞的細胞器病變。在感染后較長時間內(nèi)，淋巴細胞病變的表現(xiàn)維持相對穩(wěn)定。至感染后期(感染12個月～18個月時)，淋巴結(jié)病變明顯惡化。淋巴細胞病變明顯，細胞器結(jié)構(gòu)破壞，細胞核亦出現(xiàn)明顯病變，腫脹變圓，染色質(zhì)溶解。本研究報道了恒河猴艾滋病模型淋巴結(jié)的超微結(jié)構(gòu)改變從1周到18個月的發(fā)展過程，結(jié)果提示，淋巴結(jié)病變在感染早期即可出現(xiàn)，且此時病變發(fā)展最快，而淋巴結(jié)中的CD4+T淋巴細胞是病毒復制的主要部位，如果在感染早期即以藥物治療阻斷病毒的復制，將更為有效地抑制病變的發(fā)展。疾病發(fā)展至后期，淋巴細胞出現(xiàn)死亡，細胞數(shù)量減少。死亡的細胞主要表現(xiàn)為細胞器的腫脹，可能與病毒蛋白或細胞因子導致膜結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)。

HIV急性感染也可以表現(xiàn)為HIV腦病，感染早期即可從中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離到病毒。SIV感染恒河猴后，也可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變。感染的細胞主要是巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞，其他被感染的腦細胞包括星型膠質(zhì)細胞、少突細胞、毛細血管上皮細胞，也可能還有神經(jīng)元。艾滋病腦炎的組織學表現(xiàn)為小膠質(zhì)細胞結(jié)節(jié)，多核巨細胞，白質(zhì)變性，膠質(zhì)細胞增生［8］。本研究中通過對下丘腦組織的電鏡檢查發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)的病變可在感染后1周出現(xiàn)，表現(xiàn)為神經(jīng)纖維腫脹，感染后2周出現(xiàn)神經(jīng)元的病變，表現(xiàn)為神經(jīng)元線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，尼氏體消失;神經(jīng)纖維內(nèi)出現(xiàn)空泡。感染后12個月及18個月時，神經(jīng)細胞和神經(jīng)纖維、髓鞘的病變明顯加重。與艾滋病腦病變有關(guān)的機制包括多種因素，如免疫抑制，單核細胞/巨噬細胞聚集和激活，可溶性細胞因子的毒性，毒性細胞產(chǎn)物的聚集等，自身免疫也參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的過程［9，10］。在HIV感染者中發(fā)現(xiàn)有周圍神經(jīng)自身抗體，這些抗體似是導致周圍神經(jīng)病理反應的原因。SIV感染導致的恒河猴中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，可能也是類似的機制所引起。本研究發(fā)現(xiàn)在疾病發(fā)展各階段出現(xiàn)神經(jīng)和髓鞘的病變。髓鞘的改變可能與SIV感染導致少突膠質(zhì)細胞功能異常有關(guān)，尚需進一步研究證明。神經(jīng)的變性可能與自身免疫、細胞代謝障礙多種因素有關(guān)。本實驗中觀察到在感染2周時出現(xiàn)神經(jīng)元的病變，感染12個月及18個月時神經(jīng)元病變明顯加重。目前HIV在神經(jīng)元內(nèi)復制的證據(jù)尚不充分，本實驗中也未在神經(jīng)元內(nèi)檢測到明確的病毒顆粒，推測神經(jīng)元的損傷可能與前述多種機制有關(guān)。本實驗中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)與淋巴結(jié)的超微結(jié)構(gòu)病變發(fā)展規(guī)律有一定的相似性。

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TEM Evaluation of Central Nervous System and Lymph Node Lesions in SIU-infected Rhesus Monkey

XU Yan-feng1，SUN Li-hua1，PAN Ju-hua2，LU Yao-zeng1
(1．Institute of Laboratory Animal Sciences;Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health; Key Laboratory of Human Diseases Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine Beijing 100021，China; 2．Guang’anmen Hospital，Academy of Chinese medical sciences，Beijing 100053，China)

ObjectiveTo observe ultrastructural changes of central nerve system and lymph nodes at different stages of SIV infection in rhesus monkeys，explore the pathogenesis of simian AIDS．Methods15 rhesus monkeys，1 was used as normal control，the other 14 monkeys were infected with SIVmac239 intravenously．Inguinal lymph nodes and hypothalamic tissues were inspected by transmission electron microscopy at 1 week，2 weeks，1 month，2 months，12 months and 18 months after infection．Results1 week after infection，lymphocytes in lymph node showed pathological changes，manifested as mitochondria swelling with cristae dissolution and autophagies．At time points of 2 weeks and 1month after infection，lymphocytes showed mitochondria swelling with cristae dissolution．2 months after infection，the nuclei of the lymphocytes were obviously deformed．At 12 months after infection，a high proportion of lymphocytes had obvious lesions，manifested as cell swelling，most organelles lost their normal appearance;some cells showed features of solubilized necrosis．At 18 months after infection，the lymphocytes were sparse in some areas of the lymph node，the nuclei of the lymphocytes were swelling or had irregular shapes．Central nervous system lesions appeared at 1 week after infection，manifested as nerve fiber swelling．At 2 weeks after infection，the neuron showed mitochondria swelling，rough endoplasmic reticulum degranulation，Nissl bodies disappearing;there were vacuoles in the nerve fibers．At 12 months and 18 months after infection，the lesions of neurons and nerve fibers were increased．ConclusionsIn the early stage of SIV infection，the lesions can be found in lymph node and central nervous system．After maintaining a relatively stable stage，the disease deteriorated，the lesions were increased．The lesions in the central nervous system and lymph node showed some similarity in the development．

SIV;AIDS animal model;Electron microscopy;Rhesus monkey;Central nervous system; Lymph node

R332

A

1671-7856(2012)06-0005-03

10．3969/j．issn．1671．7856．2012．06．002

2012-03-05

國家科技重大專項(2008ZX10005－004)。

徐艷峰，助理研究員，研究方向:毒性病理學。

徐艷峰，Email:xuyanf2009@163．com。