黃寧陳松程遠

CD133陰性膠質(zhì)瘤干細胞的研究現(xiàn)狀☆

黃寧*陳松*程遠*

膠質(zhì)瘤 腫瘤干細胞 CD133 膠質(zhì)瘤干細胞

腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）假說認為：腫瘤中存在一組特殊的細胞亞群，雖然它們所占比例極小，但卻是腫瘤無限增殖、高侵襲及多藥耐藥的源泉。CSCs的分離和生物學特征的驗證對腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的觀念產(chǎn)生了重大影響。目前已在白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤中分離并證實了CSCs的存在。在膠質(zhì)瘤中已分離出CD133（＋）腫瘤細胞，它們類似于神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs），具有很強的自我更新能力，能夠形成腫瘤球，并在NOD／SCID鼠的原位種植中成瘤。CD133作為膠質(zhì)瘤干細胞（glioma stem cells，GSCs）標記物的觀點已被接受，但近年來研究證實有一小群CD133（－）膠質(zhì)瘤細胞也具有干細胞特征，動搖了CD133作為檢驗GSCs“標準”的地位。本文將對CD133（－）GSCs存在依據(jù)、與CD133（＋）GSCs相互關(guān)系、CD133（－）GSCs探索的局限性以及CD133（－）GSCs標志物研究進展進行綜述。

1 CD133（－）GSCs存在依據(jù)

“腫瘤球”、多潛能分化、單細胞克隆、致瘤性及干細胞標記物已成為了鑒定CSCs的必備條件，然而近年來發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中存在具有上述特點的CD133（－）細胞亞群。

1.1 形態(tài)學 NSCs或CD133（＋）GSCs的生長方式均為“球形聚集”。在膠質(zhì)瘤中用流式細胞技術(shù)或免疫磁珠分選出CD133（＋）細胞后，剩余的CD133（－）腫瘤細胞仍可形成“腫瘤球”［1］；此外在部分原代膠質(zhì)瘤中無法檢測到CD133（＋）腫瘤細胞，而0.5%～2%的 CD133（－）腫瘤細胞也能聚集成球形生長［2］，但大量的膠質(zhì)瘤細胞卻不具備干細胞的生長特點。

1.2 多潛能分化 聚集成球的CD133（－）膠質(zhì)瘤細胞在自然狀態(tài)下無神經(jīng)系三系標記物的表達，但進行分化誘導后發(fā)現(xiàn)其可獲得表達GaIC、GFAP、MAP2的能力，證明它們較為原始，擁有分化為少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的趨勢［2－3］，且可形成分化較為成熟的膠質(zhì)瘤細胞。

1.3 自我更新 單個孤立的GSCs具有克隆能力并逐漸形成“球形聚集”。把聚集成球的CD133（－）膠質(zhì)瘤細胞稀釋成單個細胞進行培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)：16.9%～53.8%能夠形成克隆并重新形成腫瘤球，與CD133（＋）GSCs比較無顯著差異［3］。這些具有克隆能力的CD133（－）膠質(zhì)瘤細胞在形成“腫瘤球”的過程中還可產(chǎn)生大量貼壁的膠質(zhì)瘤細胞，而再次將貼壁細胞稀釋成單個細胞后卻失去了克隆能力。

1.4 致瘤性 致瘤性是CSCs的一大特點，在動物模型中發(fā)現(xiàn)一部分“聚集成球”、多潛能分化、自我更新的CD133（－）膠質(zhì)瘤細胞也存在極強致瘤性， 只需要105～106該細胞就能在NOD／SCID鼠同位種植中成瘤［2－3］，其表型與原發(fā)腫瘤相似，出現(xiàn)胞核多形性、細胞過度分裂、組織壞死、微血管大量增生等，通過MRI檢測顯示其形態(tài)、大小和成瘤時間都與CD133（＋）GSCs所形成的腫瘤無顯著差異［4－5］，但普通的膠質(zhì)瘤細胞卻不具備致瘤性［6］。

1.5 干細胞標記物 目前鑒定GSCs最常用的方法之一為使用干細胞標記物，而具備上述幾種特征的CD133（－）膠質(zhì)瘤細胞亦表達干細胞標記物Nestin［7］。

1.6 其他 在同一腫瘤組織中的不同區(qū)域往往存在組織或細胞學上的差別［8］，例如：細胞形態(tài)、血管密度、降解周圍基底膜的能力、染色體核型分析、分子表型、信號通路、端粒和端粒酶的分析。同時CD133的表達也出現(xiàn)區(qū)域性差異，這一現(xiàn)象說明整個腫瘤組織可能起源于不同的遺傳背景。Lottaz等［9］的研究證實極少部分CD133（－）膠質(zhì)瘤細胞與NSCs存在相似的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，尤其在抗凋亡中利用了相似通路，但大部分CD133（－）膠質(zhì)瘤細胞卻無類似的分子機制。

綜上所述CD133（－）GSCs已逐漸被證實，它們在保持自我更新的同時能產(chǎn)生大量子代CD133（－）膠質(zhì)瘤細胞，而這些子代膠質(zhì)瘤細胞卻失去了CSCs的特征。

2 CD133（＋）和CD133（－）GSCs的關(guān)系

目前的研究已證實CD133（－）GSCs的存在，但它們和CD133（＋）GSCs之間的相互關(guān)系一直是頗受爭議的話題。有研究表明：①CD133（＋）GSCs的腫瘤和干細胞特征都明顯強于CD133（－）GSCs，且CD133（＋）GSCs能夠產(chǎn)生CD133（－）腫瘤細胞，所以CD133（＋）GSCs才是最為原始的膠質(zhì)瘤起源因素；②CD133（＋）GSCs與CD133（－）GSCs相比端粒酶活性更強，在連續(xù)增殖過程中 CD133（－）GSCs的端?？s短更為顯著［10］。但值得關(guān)注的是由CD133（＋）GSCs產(chǎn)生的大部分CD133（－）腫瘤細胞卻并不具備 CD133（－）GSCs的生物學性質(zhì)［2］，因此這樣的CD133（－）腫瘤細胞本質(zhì)上與CD133（－）GSCs存在顯著差異，同時也對“CD133（＋）腫瘤細胞才是膠質(zhì)瘤唯一起源”這一學說產(chǎn)生質(zhì)疑。

CD133（－）GSCs亦有可能是最為原始的腫瘤細胞：①CD133（＋）GSCs大多處于細胞周期S期、G2期和M期，但CD133（－）GSCs主要處于G0／G1期，即休眠狀態(tài)，而這種靜止狀態(tài)更符合最原始干細胞慢周期的特點［11］；②在多個原代膠質(zhì)瘤細胞中未發(fā)現(xiàn)CD133（＋）表達，但在干細胞培養(yǎng)條件下仍能產(chǎn)生“腫瘤球”，并在同位種植中再次出現(xiàn)與其原代腫瘤病理學特征相似的組織。Wang等［4］發(fā)現(xiàn)在這些起源于CD133（－）腫瘤細胞的新生腫瘤組織中出現(xiàn)了CD133的表達，說明一部分CD133（－）GSCs能夠通過不對稱分裂產(chǎn)生子代 CD133（＋）GSCs或自身轉(zhuǎn)化成了CD133（＋）GSCs；③當腫瘤細胞出現(xiàn)缺氧或線粒體功能障礙時可促進CD133表達［12］，這也極其符合一部分CD133（－）腫瘤細胞能夠在演變中產(chǎn)生CD133（＋）腫瘤細胞的觀點，因此CD133可能只是在微環(huán)境的誘導下出現(xiàn)的一種分子表型，而并不具備純化CSCs的能力。

上述兩種觀點雖然在“兩種表型的GSCs誰產(chǎn)生誰”的爭論中出現(xiàn)了矛盾，但卻得到了“兩類GSCs之間可以相互轉(zhuǎn)化”的共識。但近年來還有證據(jù)支持CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs是兩種獨立、起源不同CSCs類型的觀點：①雖然起源不同的膠質(zhì)瘤其病理學形態(tài)相似，但是不同腫瘤之間的生長和預(yù)后差異性很大。有臨床報道顯示：源于CD133（－）GSCs的膠質(zhì)瘤更容易發(fā)生在腦組織深部，且惡性程度更高［5］。②雖然它們都能形成“腫瘤球”，但其形態(tài)有差別。Beier等［2］發(fā)現(xiàn)CD133（＋）GSCs通常形成一個懸浮、孤立的“球形聚集”，CD133（－）GSCs卻形成一個部分貼壁或完全貼壁的“腫瘤球”。③兩者中與腫瘤性相關(guān)的 117個基因的表達也存在明顯差異［2］。Lottaz［9］還發(fā)現(xiàn)CD133（＋）GSCs與胚胎NSCs轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相似，但CD133（－）GSCs卻與成人 NSCs轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物更為接近，而成年NSCs和胚胎NSC之間在轉(zhuǎn)錄物之間卻具有很大差別，如在成人NSCs中CD44和EGFR明顯高于胚胎NSCs，而CD133較胚胎NSCs明顯下調(diào)。

目前的研究并不能明確CD133（＋） GSCs和CD133（－）GSCs之間的相互關(guān)系。更深層的探索發(fā)現(xiàn)［13］，可以把目前所認識的兩類GSCs再次細分為三類：Ⅰ型為CD133（－）GSCs，它可以分裂成CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs；Ⅱ型為CD133（＋）GSCs，它也能產(chǎn)生CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs；Ⅲ型為CD133（－）GSCs，但它只能產(chǎn)生CD133（－）的子代腫瘤細胞，并且子代腫瘤細胞的增殖、侵襲、成瘤、耐藥能力明顯降低。這使得GSCs起源及不同表型GSCs之間相互關(guān)系更加復雜。

3 檢測CD133（－）GSCs的局限性

CD133又名Prominin-1，是一種五次跨膜蛋白，分子量為120kD，因其在幼稚細胞中強陽性表達并隨細胞分化成熟而表達降低以至消失，被認為是干細胞標志物。單克隆抗體的使用能夠檢測靶蛋白存在及含量，但目前的CD133抗體，如：AC133、AC141、293C等都是通過檢測CD133表面一個特殊的糖基化表位來驗證該蛋白的存在。根據(jù)抗體的檢測特點，細胞分化過程中CD133的變化應(yīng)理解為：隨著干細胞分化，其糖基化表位逐漸減少而并非整個CD133蛋白［14］。以往通過免疫組織／細胞化學來研究CD133作為GSCs標志物時其精確定義為：CD133糖基化表位陽性的膠質(zhì)瘤細胞為GSCs。因此探索CD133（－）GSCs除了要考慮該細胞原本就不存在CD133蛋白之外，在應(yīng)用CD133抗體進行檢測時還有許多 “由于CD133蛋白存在但無該糖基化表位”而出現(xiàn)的誤導因素需要考慮：①在某些CD133蛋白表面無該表位或存在該表位但未糖基化，將檢測不到CD133蛋白的存在。②腫瘤細胞較其它細胞更活躍，可能由于基因突變、微環(huán)境改變、信號通路異常等對CD133糖基化表位產(chǎn)生影響。③CD133蛋白的多種剪切變體可受甲基化調(diào)節(jié)，這使得每種變體不一定都存在其特異的糖基化表位而被CD133抗體識別［15］。④培養(yǎng)細胞使用的胰酶會對細胞膜蛋白氨基酸序列中多個不同位點進行切割，可能將影響CD133糖基化表位。⑤在對CD133（－）膠質(zhì)瘤組織／細胞同時進行CD133 mRNA和蛋白檢測時可發(fā)現(xiàn)CD133mRNA存在但無蛋白表達，說明該分子在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平可能丟失了該表位。用針對不同糖基化表位的CD133抗體對同一樣本中CD133蛋白進行檢測時也會出現(xiàn)差異［16］，這也暴露了抗體檢測的不準確性。⑥此外CD133不僅在細胞膜上表達還可以在胞漿中少量表達［17］，當其定位于后者，有可能在流式細胞技術(shù)或免疫磁珠方法分選時被誤認為是CD133（－）細胞。

直接用抗體來檢測CD133表達存在局限性，其結(jié)果可能把CD133（＋）GSCs誤認為CD133（－）GSCs，因此聯(lián)合轉(zhuǎn)錄水平更有利于CD133（－）GSCs的研究。Beier［2］、Lottaz［9］認為：一部分CD133（－）膠質(zhì)瘤細胞無論是在基因還是蛋白水平都未出現(xiàn) CD133表達但確有 GSCs特征。Wang等［4］也從基因水平證實了一部分CD133（－）膠質(zhì)瘤細胞在不斷演進中能獲得CD133的表達。這些結(jié)果彌補了使用抗體對CD133蛋白檢測的局限性，而且證實了CD133（－）GSCs的真實存在。

4 CD133（－）GSCs標志物探索

CD133和Nestin以“兩點一線”的方式成為了GSCs的標志物，但如今CD133（－）GSCs的出現(xiàn)卻使得通過CD133來鑒定GSCs變得局限。因此需要一個更具權(quán)威的標志物聯(lián)合Nestin對GSCs進行分選。

A2B5是位于細胞膜表面的神經(jīng)節(jié)苷酯，在NSCs上可表達，其陽性的細胞具有分化為星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的潛能。通過分離得到的A2B5（＋）腫瘤細胞無論CD133表達如何都能形成“腫瘤球”，并且103數(shù)量級的該細胞就具有致瘤性，而A2B5（－）腫瘤細胞卻不能［18］。但也有數(shù)據(jù)顯示，A2B5（＋）腫瘤細胞在整個腫瘤成分中占有很大比例［19］，這與“CSCs只是腫瘤中一小部分群體”的概念相矛盾，可能GSCs只是包含于A2B5（＋）腫瘤細胞中的一部分群體。

SoX2（SRY-related homoebox transcription factor 2）是維持干細胞全能性的轉(zhuǎn)錄因子，且和CD133相似隨著分化成熟其表達下調(diào)，已被作為NSCs的標志物。它也能夠在膠質(zhì)瘤中分選出的腫瘤球中表達［20］。Annovazzi等［21］發(fā)現(xiàn)，SoX2（＋）膠質(zhì)瘤細胞具有抑制分化、無限增殖和致瘤性。但真正使用SoX2來進行GSCs分離并驗證其可靠性的報道卻很少，因此需要更多的研究進行指導。

側(cè)群細胞 （side population cell，SP cell）是用DNA染料Hoechst33342對細胞進行染色后出現(xiàn)的染色偏低的群體。目前文獻大多停留在CD133（＋）GSCs與SP細胞之間的相關(guān)性研究，這對研究CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs是否同時包含于SP細胞產(chǎn)生了局限。并非所有SP細胞都存在于“腫瘤球”中，而非SP細胞的自我更新能力和致瘤性可能更強且能轉(zhuǎn)化為SP細胞［22］，說明在非SP細胞中可能也存在部分GSCs。

雖然目前還沒有足夠的證據(jù)表明上述幾個標記物能夠包含整個GSCs的不同亞型，但可以聯(lián)合Nestin為尋找更加特殊的標記物和靶向治療GSCs打下堅實基礎(chǔ)。

5 展望

依據(jù)CD133（＋）GSCs作為標記物已產(chǎn)生了許多針對其靶點的治療方法，雖然療效有所改善但結(jié)局仍不盡如意。CD133（－）GSCs的提出不但解釋了這一現(xiàn)象的本質(zhì)，而且加深了人們對CSCs復雜多樣性的認識。在膠質(zhì)瘤中可能只存在兩種GSCs，即CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs；又或者在 CD133（－）GSCs中還存在多種不同亞型。根據(jù)全文所述，值得注意的是單憑針對CD133（＋）GSCs靶點的策略并不能實現(xiàn)對整個GSCs的殺滅，因此探索一個更為理想化的特異性標記物對GSCs進行篩選將成為對其全面認識的關(guān)鍵，并最終達到治愈膠質(zhì)瘤的目標。

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2011－08－23）

（責任編輯：甘章平）

10.3969／j.issn.1002－0152.2012.01.016

* 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科（重慶 400010）