黃曉科 銀曉勇 黃艷秋 李艷君 (河北省峰峰集團(tuán)邯鄲醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

海馬是邊緣系統(tǒng)重要組成部分，參與了情緒、學(xué)習(xí)和記憶、行為、免疫等的調(diào)節(jié)，目前發(fā)現(xiàn)成年海馬神經(jīng)發(fā)生可能有幾種潛在的功能，包括學(xué)習(xí)和記憶的適應(yīng)作用、對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)、與低沉情緒的潛在聯(lián)系以及對(duì)損傷的可能反應(yīng)〔1〕。海馬結(jié)構(gòu)和功能的研究是當(dāng)前腦科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，損毀法是研究腦海馬功能定位的常用方法之一。

目前海馬毀損的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的滯后制約了海馬的研究，隨著海馬損毀模型的完善，我們將能夠越來(lái)越好地研究海馬與認(rèn)知的關(guān)系。已有的毀損海馬模型，總的來(lái)說(shuō)，包括物理?yè)p毀，化學(xué)損毀和電損毀。

1 物理方法

1.1 切斷開(kāi)穹窿海馬傘通路 早在1954年，Daitz等人就采用橫斷穹窿海馬傘系統(tǒng)來(lái)研究觀察神經(jīng)元的退化過(guò)程。后來(lái)人們?yōu)榱诉M(jìn)行AD方面的研究，采取了真空抽吸、橫斷或電解等方法損毀單側(cè)或雙側(cè)穹窿海馬傘通路建立AD模型〔2，3〕。此種方法主要是通過(guò)切斷隔海馬通路(如扣帶束、背穹窿海馬傘)，破壞膽堿能及非膽堿能纖維傳入，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為及神經(jīng)化學(xué)方面的缺損，造成動(dòng)物空間定向和記憶障礙及膽堿能神經(jīng)元的丟失。步驟:將大鼠用以10%水合氯醛3.5 ml/kg劑量，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠行腹腔注射將其麻醉后，固定于腦立體定位儀，常規(guī)消毒、剪毛，正中切開(kāi)頭皮，暴露出顱骨，于前囟自后1.5 mm，中線外左右1.0 mm處，用電動(dòng)開(kāi)顱器鑿開(kāi)顱骨，切開(kāi)硬腦膜，用自制的雙刃刀先置于上述部位的腦表面(相當(dāng)于彎窿部位)，續(xù)降刀6 mm，切斷彎窿，降刀時(shí)間約1 min，假手術(shù)組降刀2 mm，(未切彎窿)，刀在腦中均停留5 min。清潔顱面，縫合頭皮。用此方法建立模型，周期短(約2 w)，但手術(shù)定位難以控制，很難避免手術(shù)區(qū)鄰近組織的受損。

胡謀先等〔4〕用手術(shù)的方法直接橫切大鼠雙側(cè)隔一海馬通路。腹腔麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀上，用一把三面有刃的特制刀片在前囟后1.8 mm、距中線1 mm，自顱骨表面垂直插入5 mm橫切距離4 mm切斷雙側(cè)海馬傘及部分穿隆。術(shù)后大鼠記憶力顯著下降。He等〔5〕采用單側(cè)彎窿傘損傷，主要破壞膽堿能通路，致使其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的完整性破壞，海馬膽堿能纖維減少，大鼠學(xué)習(xí)記憶力下降。

1.2 液壓打擊 液壓損傷法(FPI)由Lindgren于1966年首先報(bào)道，1976年使用于貓及兔正中液壓打擊，1987年 Dixon等〔6，7〕建立了大鼠液壓沖擊顱腦損傷模型。至1989年改進(jìn)為嚙鼠動(dòng)物單側(cè)半球液壓沖擊〔8，9〕。側(cè)方液壓沖擊模型在2002年后廣泛用于小動(dòng)物TBI模型的制備。其原理是通過(guò)液壓裝置有然改變密閉顱腔內(nèi)壓力而間接造成腦損傷。根據(jù)顱骨鉆孔的位置不同，可將模型分為正中沖擊和側(cè)位沖擊兩種。該法受外界因素如動(dòng)物頭顱發(fā)育的差異影響小，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，定性及可控性較強(qiáng)。

海馬損傷模型的建立參照大鼠腦立體定位圖譜明確海馬結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)腦皮層位置(海馬結(jié)構(gòu)基本位于前囟后1.8～6.0 mm，中線旁0.5～5 mm范圍內(nèi)皮層下)，確定于頂骨開(kāi)骨窗部位。以10%水合氯醛3.5 ml/kg劑量，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠行腹腔注射，常規(guī)備皮、消毒，頂部正中切口，分離暴露頂骨。選擇前囟后3.5 mm，矢狀縫右側(cè)3 mm處鉆孔開(kāi)骨窗，骨窗直徑為3 mm，注意保持硬腦膜的完整性。連接固定顱骨連接管，封閉液壓打擊系統(tǒng)。待大鼠恢復(fù)角膜反射及夾尾反射后再進(jìn)行液壓打擊。此模型借助國(guó)際上通用的MODEL01-B液壓打擊裝置對(duì)大鼠進(jìn)行分組打擊。

缺點(diǎn):沖擊后裝置內(nèi)壓力不能立即釋放，腦組織可再次受損傷，伴有不同程度局部腦挫傷的彌漫性腦損傷，挫傷范圍及周圍水腫程度隨打擊力度增加而增大。如果想對(duì)海馬結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效打擊，則液壓打擊部位的選擇和打擊力度的控制尤為重要。如不加以重視，則會(huì)對(duì)海馬以外腦組織造成較大范圍損傷，加重大鼠意識(shí)及運(yùn)動(dòng)功能等障礙，掩蓋因海馬結(jié)構(gòu)損傷所致的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。如果打擊沖擊道波和(或)經(jīng)過(guò)鼠腦中線部位，甚至?xí)?duì)腦干、丘腦等重要結(jié)構(gòu)造成直接損害，明顯增加實(shí)驗(yàn)組大鼠的傷情和死亡率。

林云鵬〔10〕用改進(jìn)的液壓打擊海馬損傷模型觀察大鼠傷后空間學(xué)習(xí)能力發(fā)現(xiàn):各實(shí)驗(yàn)組大鼠均可見(jiàn)程度不同的MR影像特征、病理學(xué)特征改變;除輕型打擊組外，水迷宮逃避潛伏期及游泳距離均與對(duì)照組間存在顯著差異。

2 電損毀

近年來(lái)電毀損建立模型在實(shí)驗(yàn)研究中得到廣泛應(yīng)用。電毀損即用金屬電極通過(guò)直流電在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)造成損傷，其機(jī)制是離子流能誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生不可逆性代謝改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由陽(yáng)極電流造成的損傷，無(wú)論在損傷的大小及形狀上均易于重復(fù)，而且損傷的程度可以通過(guò)電流強(qiáng)度及通電時(shí)間進(jìn)行調(diào)節(jié)〔11〕。

以水合氯醛(35 mg/kg)腹腔麻醉，麻醉生效時(shí)間3～5 min，麻醉生效后將常規(guī)備皮、消毒，頂部正中切口，分離暴露頂骨。選擇前囟后3.5 mm，矢狀縫兩側(cè)3 mm處鉆孔開(kāi)骨窗，骨窗直徑為3 mm，注意保持硬腦膜的完整性，按《大鼠立體定位圖譜》確定海馬位置海馬結(jié)構(gòu)基本位于前囟后1.8～6.0 mm，中線旁0.5～5 mm范圍內(nèi)皮層下，用直流電陽(yáng)極電解雙側(cè)海馬。電解損毀的最大不足是損毀特異性不強(qiáng)，它不僅定位損毀神經(jīng)元，同時(shí)也損毀輸入纖維和過(guò)路纖維，往往導(dǎo)致?lián)p毀部位與損毀效應(yīng)關(guān)系的不確定。

方崇儀〔12〕利用局部電解損傷雙側(cè)海馬的腹前部、后部和背前部對(duì)大白鼠避暗行為的學(xué)習(xí)和記憶的影響，結(jié)果表明;局部損傷海馬各部可以不同程度地阻礙這種行為模式的學(xué)習(xí)和記憶，其中以損傷腹前部最為嚴(yán)重，依次是損傷后部和背前部，但是對(duì)大白鼠避光嗜暗的本能沒(méi)有影響。

方崇儀〔13〕利用廣泛的電損毀雙側(cè)海馬背部或腹部觀察對(duì)大白鼠避暗行為的學(xué)習(xí)和記憶的影響。結(jié)果表明:廣泛的雙側(cè)損毀海馬背部或腹部，可明顯阻礙大白鼠避暗行為的學(xué)習(xí)和記憶，尤以損毀腹部更為嚴(yán)重，但是對(duì)大白鼠避光嗜暗的本能和電防御反應(yīng)的敏感性等均無(wú)影響。提示廣泛的雙側(cè)損毀海馬背部或腹部可能阻礙暗間成為電擊“信號(hào)”的學(xué)習(xí)過(guò)程及其痕跡的保持，而海馬腹前部可能與這些過(guò)程有更密切的關(guān)系。

3 化學(xué)毀損

1980 年Ben-An、1985年Sofroniew等分別報(bào)道用興奮性神經(jīng)毒氨基酸，如紅藻氨酸(KA)、鵝膏蕈氨酸(IBD)、使君子氨酸(QUIS)、N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸(NMDA)注入大鼠 NBM，可以損毀大鼠NBM建立癡呆模型〔14～16〕。隨后，國(guó)內(nèi)外一些科研工作者采用上述方法建立了AD模型，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了關(guān)于AD的一系列研究。1987年方崇儀等〔17〕利用KA損傷海馬各區(qū)來(lái)觀察海馬結(jié)構(gòu)與大白鼠避暗行為的學(xué)習(xí)和記憶關(guān)系。神經(jīng)毒氨基酸可導(dǎo)致海馬各區(qū)的膽堿能神經(jīng)元變性和減少，繼而引進(jìn)相應(yīng)膽堿能纖維減少，細(xì)胞變性與死亡，膽堿能的標(biāo)志酶ChAT和AChE含量下降，學(xué)習(xí)記憶行為減退。因此，這種神經(jīng)興奮毒性氨基酸可作為腦內(nèi)局部去神經(jīng)元的工具藥而用于研究〔18，19〕，使用神經(jīng)興奮毒性氨基酸，腦組織內(nèi)微量注射可使注射部位神經(jīng)元變性死亡，而通過(guò)注射部位的神經(jīng)纖維卻安然無(wú)恙。

實(shí)驗(yàn)大鼠以水合氯醛(35 mg/kg)腹腔麻醉，按《大鼠立體定位圖譜》確定海馬位置海馬結(jié)構(gòu)基本位于前囟后1.8～6.0 mm，中線旁0.5～5 mm范圍內(nèi)皮層下將大鼠固定在腦立體定位儀上，剪開(kāi)頭皮后用過(guò)氧化氫清洗創(chuàng)面，確定前囟平面為參考平面，按確定的坐標(biāo)在腦顱上打孔，然后將進(jìn)樣器針頭緩緩插入到預(yù)定部位使用海人酸或使君子氨酸雙側(cè)損毀。手術(shù)完成后，每實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉注射1萬(wàn)單位慶大霉素。

興奮性神經(jīng)氨基酸能擴(kuò)散到遠(yuǎn)離注射腦區(qū)，意外地?fù)p及易傷的神經(jīng)元，干擾結(jié)果的分析，由于毒性太大，海馬對(duì)興奮性神經(jīng)毒氨基酸的興奮作用比較敏感，如果損毀劑量或位置不適當(dāng)就很容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗甚至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡。因此在損毀時(shí)要十分注意。但化學(xué)損毀如果工具藥選擇得當(dāng)，其損毀作用是相當(dāng)特異的。

方崇儀〔17〕利用KA損傷海馬各區(qū)觀察海馬結(jié)構(gòu)與大白鼠避暗行為的學(xué)習(xí)和記憶關(guān)系發(fā)現(xiàn)損毀兩側(cè)海馬背部與背前部的錐體細(xì)胞，但是幾乎無(wú)損于大白鼠避暗行為的學(xué)習(xí)和記憶。損毀海馬的腹前部、腹部和后部的CA3和CA4區(qū)錐體細(xì)胞，避暗行為的學(xué)習(xí)和記憶受嚴(yán)重障礙。Hendelmenn等〔20〕發(fā)現(xiàn)KA注入海馬內(nèi)，選擇地?fù)p及大白鼠的CA3錐體細(xì)胞，并障礙了大白鼠在輻射迷宮中的學(xué)習(xí)和記憶，其中單獨(dú)損及海馬前部或后部的障礙較輕，而同時(shí)損及海馬前部和后部的最為嚴(yán)重。Sutherland等〔21〕報(bào)道了用KA損傷單側(cè)海馬CA3，CA4區(qū)錐體細(xì)胞，并不影響大白鼠在水中的空間定位學(xué)習(xí)，而雙側(cè)的損傷對(duì)其才有影響。

海馬損毀對(duì)學(xué)習(xí)和記憶的影響結(jié)果表明，海馬在認(rèn)知過(guò)程中扮演重要的過(guò)程，海馬不同的區(qū)域在認(rèn)知過(guò)程中扮演不同的角色，不同區(qū)域在不同的認(rèn)知中起的作用不同。海馬是參與學(xué)習(xí)和記憶的，但并非參與任何學(xué)習(xí)任務(wù)的習(xí)得和記憶，有些類型的學(xué)習(xí)，海馬并非是必需的;同時(shí)海馬不同區(qū)域，其參與程度也并非完全相同。雖然海馬在學(xué)習(xí)、記憶中的作用研究的時(shí)間最長(zhǎng)，研究工作最多，然而，真正機(jī)制還有待研究。

1 Schaffer DV，Gage FH.Neurogenesis and neuroadaptation〔J〕.Neuromolecular Med，2004;5(1):1-10.

2 Gage FH，Bjorkund A，Stenevi U.Reinnervation of the partialely deafferented hippocampus by compensatory collateral sprouting from spared cholinergic and noradrenergic afferents〔J〕.Brain Res，1983;268:27-37.

3 Dunnett SB.Neural transplantation in animal models of dementia〔J〕.Eur J Neurosci，1990;2:567-87.

4 胡謀先，謝 虹，樊龍珍，等.大鼠隔-海馬通路橫切對(duì)記憶功能及海馬內(nèi)去甲腎上腺素含量的影響〔J〕.同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)報(bào)，1994;23(2):84-6.

5 He Y，Yao Z，Gu Y，et al.Nerve growth factor promotes collateral sprouting of cholinergic fibers in the septohippocampal cholinergic system of aged rats with fimbria transection〔J〕.Brian Res，1992;586(1):27-35.

6 Lindgren S，Rinder L.Experimental studies in head injury，Ⅱ.Pressure propagation in“percussion-contusion”〔J〕.Biophysik，1966;(2):174-80.

7 Dixon CE，Lyeth BG，Povlishock JT，et al.A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat〔J〕.J Neurosurg，1987;67(2):110-9.

8 Mclntosh TK，Vink R，Noble L，et al.Traumatic brain injury in the rat;charaeterization of alateral fluid-pereussion model〔J〕.Neuroscience，1989;28(1):233-44.

9 Lighthall JW，Dixon CE，Anderson TE.Experimental models of brain injury〔J〕.J Neurotrauma，1989;6(2):83-97.

10 林云鵬.液壓打擊海馬損傷模型的改進(jìn)及大鼠傷后空間學(xué)習(xí)能力觀察〔J〕. 天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，15(4):599-602.

11 Grosswendt B.Ionisation cluster-size formation by electrons:from macroscopic to nanometric target sizes〔J 〕.Radiat Prot Dosimetry，2006;122:437-45.

12 方崇儀.海馬結(jié)構(gòu)與大白鼠避暗行為的學(xué)習(xí)和記憶局部電解損傷雙側(cè)海馬的腹前部、后部和背前部對(duì)大白鼠避暗行為的學(xué)習(xí)和記憶的影響〔J〕.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1986;18(6):96-104.

13 方崇儀，田聯(lián)明，歐陽(yáng)三，等.利用廣泛的電損毀雙側(cè)海馬背部或腹部觀察對(duì)大白鼠避暗行為的學(xué)習(xí)和記憶的影響〔J〕.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1985;17(1):81-9.

14 Ben-Ari Y，Tremblay E，Ottersen OP，et al.The role of eplieptic activityin hippocampal and remote cerebral lesions induced by kainic acid〔J〕.Brain Res，1980;191:79-97.

15 Sofroniew MV，Pearson RCA.Degeneration of choliergic neurous in ghe basal nucleus following kainic or N-methyl-D-aspartic acid application to the cerebral cortex in the rat〔J〕.Brain Res，1985;(1):186-90.

16 Hastings MH，Winn P，Dunnett SB，Neurotoxic amino acid lesions of the lateral hypothalamus:a parametric comparison ofthe effectsof ibteate.N-metyl-D L-aspartate and quisqualalate in the rat〔J〕.Brain Res，1985;360:248-56.

17 方崇儀.海馬結(jié)構(gòu)與大白鼠避暗行為的學(xué)習(xí)和記憶不同劑量的海人酸注入海馬各部的影響〔J〕.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1987;(4):69-78.

18 Heym C，F(xiàn)orssmann WG.Techniques in neuroanatomical research〔M〕.Berlin:Springer Verlag，1981:8.

19 Heimer L，Robards MJ.Neuroanatomical tract-tracing methods〔M〕.New York:Plenum Press，1981:71.

20 Handelmann GE，David S.Spatial memory following damage to hippocampal CA3 pyramidal cells with kainic acid:impairment and recovery with preoperative training〔J〕.Brain Res，1981;217:41-58.

21 Sutherland RJ，Whishaw IQ，Kolb B，et al.A behavioural analysis of spatial localization following electrolytic，kainate-or colchicine-induced damage to the hippocampal formation in the rat〔J〕.Behavioural Brain Res，1983;7(2):133-53.