李曉翠，苗愛東

(1.北京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，北京100071;2.河北北方學(xué)院，河北張家口075000)

復(fù)方土荊皮酊是由土荊皮藥材提取液與苯甲酸、水楊酸制成的復(fù)方制劑，具有抗表皮真菌和止癢等作用［1-2］。土荊皮提取液的主要成分是二萜酸類化合物［3-6］，包括土荊皮甲酸、土荊皮乙酸、土荊皮乙酸-O-β-D-葡萄糖苷和土荊皮丙酸等成分，其中土荊皮乙酸是土荊皮藥材的主要成分，具有抗真菌和抗腫瘤等作用［7-12］。目前對該制劑中土荊皮原料藥材所含有效成分(或特征成分)的測定方法很少見報道，為有效控制復(fù)方土荊皮酊的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法同時測定該制劑中土荊皮乙酸-O-β-D-葡萄糖苷、土荊皮丙酸、土荊皮乙酸和土荊皮甲酸等4種二萜類成分，該方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，為更好的控制復(fù)方土荊皮酊的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀(包括低壓梯度四元泵、自動進(jìn)樣器、恒溫箱和DAD檢測器)、Chem Station色譜工作站(美國安捷倫科技公司);Mettler Toledo AG 285型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，d=0.01 mg);KQ2200E型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)。

土荊皮乙酸對照品(批號110880-201003，純度為99.1%)購自中國藥品生物制品檢定所。土荊皮乙酸-O-β-D-葡萄糖苷對照品(批號101224)、土荊皮丙酸對照品(批號101223)、土荊皮甲酸對照品(批號101220)均購自四川成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。3種對照品經(jīng)HPLC峰面積歸一化法測定純度均在98%以上。收集了4個生產(chǎn)廠家(A～D)共17批次的復(fù)方土荊皮酊。A:2批次;B:1批次;C:1批次;D:14批次。乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件采用Agilent Zorbax SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱;以乙腈(A)-0.09%甲酸(B)為流動相，梯度洗脫0～8 min:30%～40%A;8～22 min:40%～100%A;柱溫35℃;體積流量1.0 mL/min;檢測波長262 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取土荊皮乙酸-O-β-D-葡萄糖苷、土荊皮丙酸、土荊皮乙酸和土荊皮甲酸對照品適量，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇配制成單一對照品貯備液(質(zhì)量濃度分別為231.965 μg/mL、84.402 μg/mL、368.652 μg/mL、7.958 μg/mL)。精密量取各對照品貯備液適量至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得土荊皮乙酸-O-β-D-葡萄糖苷、土荊皮丙酸、土荊皮乙酸和土荊皮甲酸的質(zhì)量濃度分別為81.223、13.504、73.730、0.796 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備精密量取復(fù)方土荊皮酊樣品5.0 mL置于10 mL量瓶中，用60%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，作為多成分定量測定用供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備按處方比例和制備工藝制備不含土荊皮藥材提取液的陰性樣品，按2.3項下方法制成陰性對照溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)分別精密吸取2.2項，2.3項和2.4項下的混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。在上述色譜條件下，土荊皮乙酸-O-β-D-葡萄糖苷、土荊皮丙酸、土荊皮乙酸和土荊皮甲酸與其他相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，陰性對照無干擾。

圖1 復(fù)方土荊皮酊HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Compound Tujingpi Tincture

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察分別精密吸取上述對照品貯備液適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇配制成含土荊皮乙酸-O-β-D-葡萄糖苷質(zhì)量濃度為11.598～82.845 μg/mL，土荊皮丙酸為1.206～27.009 μg/mL，土荊皮乙酸為14.746～126.392 μg/mL，土荊皮甲酸為0.159～2.274 μg/mL的混合對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定。分別以質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程見表1。

表1 回歸方程和線性范圍Tab.1 Regression equations and linear ranges

2.6.2 精密度試驗(yàn)按照上述色譜條件，精密吸取2.3項下供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣3日，每日6次，計算日內(nèi)精密度的RSD為0.09%、0.15%、0.06%和0.17%;日間精密度RSD為0.32%、0.16%、0.29%和0.71%。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn)分別取同一批次(20110402)樣品，按照2.3項下的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定土荊皮乙酸-O-β-D-葡萄糖苷、土荊皮丙酸、土荊皮乙酸和土荊皮甲酸，平行操作6份，其RSD值分別為0.31%、0.33%、0.27%和0.27%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一批次(20110402)樣品在上述相同色譜條件下于1、2、3日分別進(jìn)樣分析，記錄各色譜峰面積值，結(jié)果土荊皮乙酸-O-β-D-葡萄糖苷、土荊皮丙酸、土荊皮乙酸和土荊皮甲酸的RSD值分別為0.27%、0.19%、0.29%和0.69%。表明供試品溶液在3 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn)取已知含有量的復(fù)方土荊皮酊(20110402)2.5 mL，平行操作6份，分別加入適量的混合對照品溶液，按照2.3項下的方法制備供試品溶液并測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 4種二萜類化合物的回收率測定結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests of four diterpenoids

2.7 樣品測定取4個生產(chǎn)廠家共17批次復(fù)方土荊皮酊，按2.3項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀中，在上述相同色譜條件下記錄土荊皮乙酸-O-β-D-葡萄糖苷、土荊皮丙酸、土荊皮乙酸和土荊皮甲酸的峰面積值，通過回歸方程計算4種二萜類化合物的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表3。

表3 4廠家共17批次樣品測定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of seventy batches of samples from four factories

3 討論

3.1 色譜條件的選擇通過DAD檢測器掃描土荊皮乙酸-O-β-D-葡萄糖苷、土荊皮丙酸、土荊皮乙酸和土荊皮甲酸的紫外吸收光譜，其最大吸收波長分別是266 nm、262 nm和260 nm。為了在同一檢測波長下測定這4種二萜類成分的含有量，最終選擇262 nm作為檢測波長。在此波長下，基線平穩(wěn)，峰面積較大，各色譜峰的峰形較好。

本實(shí)驗(yàn)先后考察了甲醇、乙腈與水、酸溶液(醋酸、磷酸和甲酸)等流動相系統(tǒng)并進(jìn)行分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選擇乙腈-0.09%甲酸為流動相時基線平穩(wěn)。對不同的梯度洗脫程序進(jìn)行研究，從分離情況和出峰時間等方面綜合考慮，選擇乙腈(A)-0.09%甲酸(B)0～8 min:30%～40%A;8～22 min:40%～100%A進(jìn)行梯度洗脫，所得色譜峰的峰形較好且分離效果最佳。

3.2 提取條件的選擇分別考察了60%甲醇、乙醇和流動相作為提取溶劑，在不同超聲提取時間下(0、5、10、20 min)對定量測定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)60%甲醇為提取溶劑時基線平穩(wěn)，色譜峰峰形較好，柱效較高，且超聲時間對提取的各成分含有量并無明顯差別，故采用60%甲醇對樣品直接進(jìn)行稀釋，操作簡便，快速。

3.3 現(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［2］僅采用酸堿滴定法測定了復(fù)方土荊皮酊的總酸量，對處方中加入的苯甲酸、水楊酸和土荊皮藥材所含主要成分的含量限度均未作出明確的規(guī)定，難以有效控制其內(nèi)在質(zhì)量。目前對該制劑中苯甲酸和水楊酸兩種化學(xué)成分的定量測定方法研究較多［13-16］，但有關(guān)該制劑中土荊皮藥材中多成分定量測定方法的研究尚未見文獻(xiàn)報道。

對市售的4個生產(chǎn)廠家共17批次復(fù)方土荊皮酊樣品進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)，不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方土荊皮酊中4種二萜類成分的含有量參差不齊，其中土荊皮乙酸的質(zhì)量濃度較高，22.648～123.275 μg/mL，土荊皮乙酸-O-β-D-葡萄糖苷次之，質(zhì)量濃度范圍在20.291～90.114 μg/mL，再次是土荊皮丙酸，2.542～26.061 μg/mL，土荊皮甲酸的質(zhì)量濃度最低，在0.234～2.380 μg/mL之間。同時發(fā)現(xiàn)僅有4個生產(chǎn)廠家共計16批次制劑樣品中可同時檢出這4種成分，其中有1批次藥品均未檢出這4種成分的任何一種，提示相關(guān)廠家對土荊皮原料藥材的購入和使用把關(guān)不嚴(yán)，使用了偽劣藥材投料生產(chǎn)，需要引起各生產(chǎn)廠家、使用單位和監(jiān)督管理部門的高度重視，以確保用藥的安全、有效。

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