李天辰，沈侃，韓偉*

(1.華東理工大學(xué)中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237;2.上海中藥制藥技術(shù)有限公司，上海200042)

代謝綜合征是高血壓、血糖異常、血脂紊亂和肥胖癥等多種疾病在人體內(nèi)集結(jié)的一種狀態(tài)，直接導(dǎo)致嚴(yán)重心血管疾病的發(fā)生，嚴(yán)重時可造成死亡［1］。世界衛(wèi)生組織把一個人身上出現(xiàn)高血壓、高血脂、肥胖、高胰島素血癥等多種病理狀態(tài)集結(jié)的疾病，統(tǒng)稱為“代謝綜合征”［2］。作為一種多病因、多組成、多表現(xiàn)、多危害的特異性癥候群，代謝綜合征成為心腦血管疾病、糖尿病、痛風(fēng)、腫瘤等諸多疾病的共同病理基礎(chǔ)［3］。

益氣散聚方是治療代謝綜合征的臨床經(jīng)驗(yàn)方，該方能有效地降低患者的胰島素抵抗，控制機(jī)體的糖代謝混亂，并有效地降低患者的血脂，體質(zhì)量和腰臀圍［4］。益氣散聚方的處方由黃芪、蒲黃、澤瀉、茵陳、黃連五味藥物組成。其中，黃芪作為藥物中的君藥，在利尿降壓，降低心肌負(fù)荷，改善心功能方面發(fā)揮著重要的作用［5-6］。為了將益氣散聚方從傳統(tǒng)的水煎劑開發(fā)為現(xiàn)代中藥制劑，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)法以黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率和干浸膏得率為指標(biāo)，以提取時間、提取次數(shù)、加水倍數(shù)為考察因素優(yōu)化水提工藝;以藥液相對密度、醇沉?xí)r間、醇沉濃度為考察因素，優(yōu)化醇沉工藝。

1 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀、2000ES蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech)、超純水設(shè)備(上海賽鴿電子有限公司)、εlma 890/H超聲清洗器(德國)、R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司)、W501型升降恒溫水浴鍋、TC-15套式恒溫器(新華醫(yī)療器械廠)、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、TDL-5-A型離心機(jī)(上海安亭儀器廠)。

黃芪甲苷對照品(購自中國藥品生物制品鑒定所，批號為110781-200613)、氨試液、甲醇、磷酸、95%乙醇、正丁醇(分析純)、自制色譜純水。甲醇，乙腈(品牌:J＆K，色譜純)。黃芪藥材(批號為101123，含黃芪甲苷0.11%，產(chǎn)地:甘肅)、茵陳藥材(批號101101，產(chǎn)地:陜西)、澤瀉藥材(批號101318，產(chǎn)地:福建)、黃連藥材(批號101019，產(chǎn)地:四川)、蒲黃藥材(批號101703，產(chǎn)地:內(nèi)蒙古)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件與適用性試驗(yàn)資生堂C18色譜柱(4.6 mm I.D.×150 mm，5 μm);檢測器為ELSD(102℃，2.7 L/min);乙腈-水(32∶68)為流動相;柱溫為30℃;理論塔板數(shù)以黃芪甲苷計算應(yīng)該不低于4 000。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加入甲醇制成質(zhì)量濃度為0.54 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備按照藥材配比，稱取藥材，水提并將提取液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮(若醇沉，則加入乙醇，并靜置)，離心過濾取上清液，而后置105℃恒溫干燥箱中烘干制成浸膏。

取1 g浸膏粉于蒸發(fā)皿中，精密加入50 mL甲醇，超聲2 h，過濾，濾液蒸干，加水20 mL復(fù)溶，用水飽和的正丁醇萃取，每次40 mL，共4次，合并正丁醇液，之后用40%的氨水洗滌兩次，每次80 mL，取有幾層，棄去下層，蒸干，緩慢加入甲醇復(fù)溶，并定容至5 mL，過微孔濾膜，進(jìn)液相測定，進(jìn)樣量為10 μL。

2.4 線性關(guān)系考察精密稱取黃芪甲苷對照品適量，分別制成質(zhì)量濃度為0.027、0.054、0.108、0.27、0.54、1.08 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.45 μm微孔濾膜后，進(jìn)液相測定，進(jìn)樣量為10 μL，測定峰面積值。以峰面積的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)X，進(jìn)樣質(zhì)量的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)Y，計算回歸方程:Y=0.587 2X－3.936 2，r=0.999 8。結(jié)果表明黃芪甲苷對照品在0.27～10.8 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)精密吸取0.54 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)6次記錄峰面積，結(jié)果其RSD為2.07%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)分別于0、2、4、8、16、24 h精密吸取黃芪甲苷對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.54 mg/mL)10 μL注入液相色譜儀，記錄黃芪甲苷峰面積，計算，結(jié)果RSD為0.85%，表明黃芪甲苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)將批號為20120408水提醇沉浸膏樣品制成供試品溶液，測定，計算得黃芪甲苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.45 mg/g，RSD為1.56%。

2.8 回收率試驗(yàn)采用加樣回收率方法。取同一批樣品共9份，每份約1 g(批號20120408，含黃芪甲苷1.45 mg/g)，精密稱定，分3組，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.27、0.54、1.08 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液5 mL，照供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，測定，計算得平均回收率為99.01%，RSD為2.15%(n=9)。

2.9 樣品的測定精密稱取正交實(shí)驗(yàn)浸膏樣品，照供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣測定。每份樣品測定兩次，按回歸方程計算，以兩次測定的平均值作為測定值，計算樣品中黃芪甲苷的含有量。

3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計與統(tǒng)計分析

3.1 水提工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計以加水倍數(shù)、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，以黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率，出膏率為考察指標(biāo)，以設(shè)計L9(34)正交表，按照正交表進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，每一份實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。水提工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1，水提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3和表4。

表1 水提正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 水提正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 水提轉(zhuǎn)移率方差分析

表4 水提出膏率方差分析

考慮黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率，其極差R的大小順序依次為提取次數(shù)(C)＞提取時間(A)＞加水倍數(shù)(B)，得出影響黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率的因素大小順序是C＞A＞B。

考慮干浸膏的得率，其極差R的大小順序依次為提取次數(shù)(C)＞加水倍數(shù)(B)＞提取時間(A)，即得出影響干浸膏得率因素大小順序是C＞B＞A。

從方差分析來看:從轉(zhuǎn)移率角度出發(fā)，提取次數(shù)(C)、加水倍數(shù)(A)和提取時間(B)對于黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率都有著統(tǒng)計學(xué)的意義。從浸膏率角度出發(fā)，提取次數(shù)(C)對于出膏率有統(tǒng)計學(xué)意義，而加水倍數(shù)(A)和提取時間(B)則意義不大。

3.2 水提工藝綜合評分設(shè)計由于本水提工藝實(shí)驗(yàn)由轉(zhuǎn)移率和浸膏率兩個指標(biāo)組成，兩個指標(biāo)判斷標(biāo)準(zhǔn)不一，所以決定采取加權(quán)評分法進(jìn)行綜合評判。方法如下:轉(zhuǎn)移率最高得100分，最低得0分，以轉(zhuǎn)移率為橫坐標(biāo)，得分為縱坐標(biāo)，將最高最低兩點(diǎn)代入，得直線方程Y=2.116 85X－39.098 22，分別將正交表中的各個轉(zhuǎn)移率代入，得到相應(yīng)的分值。浸膏率最低得100分，最高得0分，以浸膏率為橫坐標(biāo)，得分為縱坐標(biāo)，將最高最低兩點(diǎn)代入，得直線方程Y=－6.940 27X+205.281 44，分別將正交表中的各個浸膏率代入，得到相應(yīng)的分值。綜合評分=轉(zhuǎn)移率得分×0.6+浸膏率得分×0.4。水提綜合評分結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表5 水提綜合評分結(jié)果

表6 水提綜合評分方差分析

從綜合評分角度來分析，根據(jù)其極差大小來看，其影響因素順序?yàn)樘崛〈螖?shù)(C)＞加水倍數(shù)(A)＞提取時間(B)，比較各個因素不同水平結(jié)果的加和值，對于因素C，其優(yōu)劣次序?yàn)?＞2＞1，對于因素A，其優(yōu)劣次序?yàn)?＞3＞1，對于因素B，其優(yōu)劣次序?yàn)?＞1＞2。

從其方差分析來看，由于F0.05(1，2)=19，提取次數(shù)(C)相對于加水倍數(shù)(A)和提取時間(B)有著統(tǒng)計學(xué)意義。

綜合考慮，決定采用綜合評分所得到的結(jié)果，選擇A2B3C3作為最優(yōu)提取方案。即提取3次，每次加8倍量水，每次提取2 h。

3.3 水提工藝正交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證按處方比例稱取15倍量藥材3份，根據(jù)正交優(yōu)化過的提取方案，提取3次，每次加8倍量的水，每次提取2 h，合并藥液，減壓濃縮并至105℃恒溫干燥箱中干燥3 h。驗(yàn)證結(jié)果見表7。

提取實(shí)驗(yàn)雖然經(jīng)過了優(yōu)化，但其出膏率偏大，黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率偏低，普遍小于60%，需要通過醇沉實(shí)驗(yàn)去除其中的雜質(zhì)，降低出膏率，提高轉(zhuǎn)移率。

表7 水提實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

3.4 醇沉工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計以藥液相對密度、醇沉濃度、醇沉?xí)r間為考察因素，以黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率、出膏率為指標(biāo)，采用L9(34)正交表，按正交表進(jìn)行醇沉實(shí)驗(yàn)，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。見表8，表9，方差分析結(jié)果見表10，表11。

表8 醇沉正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表9 醇沉正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表10 醇沉轉(zhuǎn)移率方差分析

表11 醇沉出膏率方差分析

從直觀分析來看，考慮黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率，其極差R的大小順序依次為藥液相對密度(A)＞醇沉濃度(B)＞醇沉?xí)r間(C)，得出影響黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率的因素大小順序是A＞B＞C。

考慮干浸膏的得率，其極差R的大小順序依次為A＞B＞C，得出影響干浸膏得率因素大小順序是A＞B＞C。

從方差分析來看:F0.05(2，2)=19，三者均無統(tǒng)計學(xué)影響。

3.5 醇沉工藝綜合評分設(shè)計由于本水提工藝實(shí)驗(yàn)由轉(zhuǎn)移率和浸膏率兩個指標(biāo)組成，兩個指標(biāo)判斷標(biāo)準(zhǔn)不一，所以決定采取加權(quán)評分法進(jìn)行綜合評判。方法如下:轉(zhuǎn)移率最高得100分，最低得0分，以轉(zhuǎn)移率為橫坐標(biāo)，得分為縱坐標(biāo)，將最高最低兩點(diǎn)代入，得直線方程Y=2.848 19X－83.138 71，分別將正交表中的各個轉(zhuǎn)移率代入，得到相應(yīng)的分值。浸膏率最低得100分，最高得0分，以浸膏率為橫坐標(biāo)，得分為縱坐標(biāo)，將最高最低兩點(diǎn)代入，得直線方程Y=－16.638 94X+193.677 20，分別將正交表中的各個浸膏率代入，得到相應(yīng)的分值。綜合評分=轉(zhuǎn)移率得分×0.6+浸膏率×0.4。醇沉綜合評分結(jié)果見表12，方差分析見表13。

表12 醇沉綜合評分結(jié)果

從綜合評分角度來分析，其影響因素順序?yàn)榇汲翝舛?B)＞藥液相對密度(A)＞醇沉?xí)r間(C)，比較各個因素不同水平結(jié)果的加和值，對于因素B，其優(yōu)劣次序?yàn)?＞2＞1，對于因素A，其優(yōu)劣次序?yàn)?＞3＞1，對于因素C，其優(yōu)劣次序?yàn)?＞3＞2，即最優(yōu)方案為A2B3C1。

從方差分析來看:F0.05(2，2)=19，三者均無統(tǒng)計學(xué)影響。

為了更充分地去除提取液中的雜質(zhì)，決定醇沉?xí)r間為8 h，最后的醇沉方案為A2B3C2，即濃縮藥液至相對密度為1.15，加入乙醇使含乙醇量達(dá)到80%，醇沉8 h。

3.6 提取醇沉工藝驗(yàn)證按處方比例稱取15倍量藥材3份，提取3次，每次加入8倍量的水，每次提取2 h，合并藥液，減壓濃縮至藥液比濃度為1.15，加入乙醇使含乙醇量達(dá)到80%，靜置8 h，而后至105℃恒溫干燥箱中干燥3 h。結(jié)果見表14。

表14 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表14可知，按最佳提取醇沉方案實(shí)驗(yàn)，出膏率可控制在11%左右，而黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率大于60%，說明以上方案是穩(wěn)定可行的。

4 討論

近年來，代謝綜合征已經(jīng)成為世界醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，西醫(yī)學(xué)對其治療有著明顯的效果，但也存在一定的不良反應(yīng)。而中醫(yī)學(xué)具有整體辨證論治的優(yōu)勢，充分體現(xiàn)了科學(xué)的個體化治療思想，在治療上積極探索早期干預(yù)的時機(jī)，對減少或延緩相關(guān)心腦血管事件的發(fā)生無疑具有重要的臨床和社會意義［7-8］。

現(xiàn)代藥理學(xué)證明，黃連中的主要成分之一小檗堿亦能改善脂質(zhì)代謝和胰島素的功效［9-10］。因此我們推測，益氣散聚方的基本作用之一可能是提高靶組織的胰島素敏感性，調(diào)節(jié)和改善機(jī)體代謝混亂的情況，從而改善肝臟的脂肪代謝［11-12］。然而用水提醇沉方法提取益氣散聚方時，對小檗堿的含有量和轉(zhuǎn)移率進(jìn)行測定，結(jié)果均不夠理想。曾嘗試過調(diào)節(jié)水提液的pH值，希望在酸性條件下提高小檗堿的溶出度，降低其沉淀的風(fēng)險，同時去除部分酸不溶性雜質(zhì)，降低出膏率。但結(jié)果仍然不太理想，可能由于小檗堿在水溶液中溶解性較低，在提取液靜置過程中極易發(fā)生沉淀，造成大量損失。具體原因有待進(jìn)一步考察。

本實(shí)驗(yàn)中，藥材里含較多的淀粉等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)在提取過程中也一起溶出，使浸膏得率偏高。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)得知，未經(jīng)過醇沉的提取液其浸膏率達(dá)到14%以上，這些雜質(zhì)可能成為將來制劑不穩(wěn)定的因素，同時過高的浸膏得率會使給藥劑量過大，不適合口腔給藥，故考慮用乙醇沉淀的方法去除水提液中的雜質(zhì)。

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